Single Dose Oral Toxicity of Bacillus subtilis JNS in ICR Mice

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ICR 마우스를 이용한 Bacillus subtilis JNS 균주의 단회경구투여 독성시험

김경훈¹․정창화¹․주성제²․박종훈²․문지영²․조은지²․이현태^2,3 권현주^2,3․김병우^2,3․엄성환⁴․이은우^2,3

1(주)제이엔에스텍, ²동의대학교 생명응용학과

3동의대학교 블루바이오소재개발센터, ⁴한국식품연구원 소재연구센터

Single Dose Oral Toxicity of Bacillus subtilis JNS in ICR Mice

Kyoung-Hoon Kim¹, Chang Hwa Jeong¹, Seong-Je Joo², Jong-Hoon Park², Ji-Young Moon², Eun-Ji Cho², Hyun-Tai Lee^2,3, Hyun-Ju Kwon^2,3, Byung-Woo Kim^2,3,

Sung-Hwan Eom⁴, and Eun-Woo Lee^2,3

1JNS Tech Co.

2Department of Life Science and Biotechnology and ³Blue-Bio Industry RIC, Dongeui University

4Food Resource Research Center, Korea Food Research Institute

ABSTRACT The present study was carried out to investigate the in vivo single-dose acute toxicity of Bacillus subtilis JNS isolated from Cheonggukjang, which is a probiotic candidate showing strong and broad antibacterial activity.

The test sample was orally administrated to male and female ICR mice at a highest dose of 2,000 mg/kg for 14 days. No significant change in general conditions, mortalities, body weight changes, clinical signs, autopsy findings, or presence of gross lesions was observed in either sex of mice. The results indicate that up to 2,000 mg/kg of B.

subtilis JNS had no adverse effect on ICR mice.

Key words: single dose oral toxicity, Bacillus subtilis, ICR mice, Cheonggukjang

Received 27 August 2014; Accepted 8 December 2014

Corresponding author: Eun-Woo Lee, Department of Life Science and Biotechnology and Blue-Bio Industry RIC, Dongeui University, Busan 614-714, Korea

E-mail: [email protected], Phone: +82-51-890-1537

서 론

인체의 위장관 내에 항상 존재하는 정상적인 세균총은 외 부에서 유래하는 각종 병원체가 장내 상피세포에 집락을 형 성하여 감염하는 것을 예방한다고 알려져 있다. 장내 세균총 의 정상적인 균형 유지나 새로운 세균총의 형성을 위해 선택 적으로 섭취하는 미생물인 probiotics는 정장제나 유산균 제제, 발효유제품의 스타터, 사료첨가제로서의 생균제 등으 로 활용되고 있다(1). Probiotics는 적정량을 섭취하였을 때 인체에 이로운 건강기능효과를 줄 수 있는 미생물로 정의되 며, 장내 세균총의 정상화를 돕고 유해세균의 정착을 억제함 으로써 부패산물의 생성 감소와 각종 질병예방, 항암작용, 면역의 활성화, 혈중 콜레스테롤 저하 및 항산화 등의 기능 성이 입증되고 있다(2). 현재 probiotics로는 Lactobacil- lus acidophilus, L. sporogenes, Enterococuus faecium, Bacillus polyfermenticus, Bacillus subtilis 등이 주로 활 용되고 있으며 주된 연구대상으로 되어 있다. 그중 B. subtilis 종은 probiotics로서 뿐만 아니라 산업적으로도 중요한

종으로 오랜 기간 동안 식품, 의약품 및 각종 발효 산업에서 사용되어 안전성이 확립되어 있다(3).

청국장은 우리나라의 대표적인 전통 대두발효식품 중의 하나로 증자한 대두에 B. subtilis를 주로 이용하여 발효시 켜 제조하는 건강기호식품이다(4). 청국장은 항산화, 혈압 억제, 항균, 항암, 혈전용해 효과 등과 같은 다양한 생리활성 이 보고되어 왔다(5). 청국장의 생리활성은 대두로부터 유래 하는 isoflavone 등의 페놀성 화합물과 phytic acid 등의 유효성분 이외에도 발효 과정 중에 B. subtilis가 생산하는 효소에 의하여 콩에 함유되어 있는 단백질 및 탄수화물이 소화되기 쉬운 형태로 분해되어 페놀성 화합물의 함량이 증 가하기 때문인 것으로 보고되고 있다(6,7). 또한 청국장의 B. subtilis는 여러 가지 식중독 세균과 Helicobacter pylori 에 대한 항균활성을 나타내는 보고도 있어 probiotics로서 의 잠재성이 충분하다고 알려져 있다(8). 일반적으로 pro- biotics로 사용되는 미생물들은 소화관 내의 위산, 담즙 및 소장의 각종 소화효소와 같은 저해환경으로부터 저항력을 가져야 하며 대장과 직장에 도달하여 증식 및 부착해야 한다 는 점에서 환경변화에 강한 포자를 형성하는 B. subtilis는 장점을 지닌다고 보고되고 있다(9,10).

유산균을 포함한 probiotics는 GRAS(generally recog- nized as safe) 등급 미생물로 분류되고 있으나 실제 식품에

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적용 시에는 안전성이 검증되어야 하고 이의 식품 적용 여부 가능성을 식품의약품안전처에서 승인받아야 한다(3). 따라 서 본 연구에서는 청국장에서 분리되어 항균활성이 우수하 다고 판단되는 probiotics로서의 잠재능이 있는 B. subtilis JNS 균주의 안전성 평가의 일환으로 단회 투여 시 나타날 수 있는 독성평가를 위해 식품의약품안전처의 시험기준 (11)에 따라 마우스에서 단회경구투여에 의한 급성독성을 평가하였다.

재료 및 방법

실험동물

본 실험에서는 (주)샘타코(Osan, Korea)로부터 구입한 4주령의 특정병원체 부재 ICR 마우스를 사용하였다. 동의대 학교 블루바이오소재개발 및 실용화지원센터(Busan, Ko- rea)의 실험동물시설에서 1주일 간 순화 적응시킨 후 일반 증상을 관찰하여 이상이 없는 건강한 동물을 선택하여 사용 하였다. 실험동물사육은 온도, 습도, 환기가 자동 조절되는 Micro Ventilation Cage System Rack(ThreeShin Inc., Daejeon, Korea)을 이용하였다. 온도 23±2°C, 상대습도 50±10%, 환기 횟수 10~18회/시간, 조명시간 12시간(오전 8시~오후 8시) 및 조도 150~300 Lux로 설정된 사육환경에 서 polycarbonate cage(27L×22W×13H cm)에 사육상자 당 5마리 이하로 수용하였으며, (주)샘타코의 방사선 멸균된 실험동물용 고형사료와 고압 멸균한 1차 증류수를 자유롭게 섭취할 수 있게 하였다. 동물실험은 동의대학교 동물실험윤 리위원회의 사전 심의를 받아 동물실험윤리위원회의 규정 에 따라 수행하였다.

시험물질의 추출 및 조제

전국 각지에서 수집한 청국장 시료로부터 분리 동정하여 보관 중인 균주 중에서 항균활성이 우수한 균주인 Bacillus subtilis JNS를 선별하여 실험에 사용하였다(12). 성장배지 는 Tryptic Soy Broth(Difco Co., Detroit, MI, USA)를 사 용하였으며, 배양조건은 37°C에서 24시간 진탕배양 하였 다. B. subtillis JNS 배양액은 1,100×g에서 15분간 원심분 리 한 후 배양액 중의 균체(3.0~5.0×10¹¹ CFU/g)를 회수하 여 시험시료로 사용하였다.

투여용량 설정 및 투여방법

시험물질 투여 전 4시간 동안 절식시킨 다음 체중을 측정 하여 체중 범위에 따른 무작위법에 의거하여 ICR 마우스 암수 각각 20마리의 실험동물을 5마리씩 실험군을 분리하 였다. 투여용량은 식품의약품안전처 고시 제2013-121호 의약품 등의 독성시험기준(2013. 4. 5 개정)(11)에서 설정 한 급성독성시험 허용 한계용량인 2,000 mg/kg을 최고용량 군으로 설정하고 등비를 0.5로 하여 1,000 mg/kg/d와 500 mg/kg/d의 3단계 용량을 설정하였다. 투여경로는 경구투여

법을 사용하였으며 모든 실험동물은 투여 전 18시간 동안 절식시킨 후 경구투여용 스테인리스 재질 존데를 이용하여 500 μL의 0.5% sodium carboxymethyl cellulose(CMC- Na)에 시험시료를 현탁하여 1일 1회 체중을 기준으로 kg당 10 mL를 위 내로 강제 경구투여를 시행하였다. 시험물질 투여 후 2시간 동안은 사료를 제한하였으며 음수는 제한 없 이 계속 공급하였다.

일반증상 관찰 및 체중 측정

투여 당일에는 투여 직후 30분 동안에는 이상 증상 유무 에 대해 지속적으로 관찰하였고, 투여 후 6시간까지 매시간, 투여 후 1일부터 14일까지는 1일 1회 일정한 시간에 일반 상태의 변화, 중독 증상의 발현, 사망 동물의 유무 및 기타 이상 증상에 대하여 관찰하였다. 체중 변화 관찰은 모든 동 물에 대하여 투여 직전과 투여 후 1일, 3일, 7일, 그리고 14일째에 측정하였다.

부검

실험동물을 희생하기 전날 18시간 절식시킨 후, CO2를 이용하여 마취시킨 뒤 개복하여 후대동맥을 절단하여 방혈 시킨 다음 주요 내부 장기의 병변을 시험물질 비투여군과 비교하여 육안적으로 관찰하였다. 이후 간, 신장, 비장, 폐, 심장, 뇌를 적출하여 생리식염수로 세척한 다음 수분을 제거 하고 각각의 무게를 측정하였다.

통계처리

실험 결과는 SPSS Package Program(version 20.0, SPSS Inc., Chicago, IL, USA)을 이용하여 평균과 표준편 차를 구하였으며 실험군 간의 차이의 유의성은 one-way ANOVA와 Student t-test에 의하여 P<0.05 수준에서 검증 하였다. 본 시험에서는 사망동물이 관찰되지 않아 반수치사 량(LD₅₀)의 산출을 위한 통계처리는 실시하지 않았다.

결 과

사망동물 및 LD50

B. subtilis JNS 균주를 500, 1,000 및 2,000 mg/kg을 경구투여 후 암수 ICR 마우스를 14일 동안 관찰한 결과 사망 동물과 LD50은 Table 1과 같았다. 실험동물의 사망 유무를 관찰한 결과 모든 실험구에서 시험물질 투여에 기인하여 사 망은 관찰되지 않았다. 따라서 마우스에서 본 시험물질의 최소치사량(minimal lethal dose)은 2,000 mg/kg을 초과 할 것으로 관찰되었으며, 시험물질에 의한 LD₅₀은 2,000 mg/kg 이상으로 추정된다.

체중 변화

B. subtilis JNS 균주를 500, 1,000 및 2,000 mg/kg 경구 투여 후 암수 ICR 마우스의 14일 동안의 체중 변화는 Table

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Table 1. Mortality in male and female ICR mice after oral administration of B. subtilis JNS (n=5) Group Dose

(mg/kg)

Days after treatment LD50

(mg/kg)

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

Male Ctrl

A B C

0 500 1,000 2,000

0/5¹⁾ 0/5 0/5 0/5

0/5 0/5 0/5 0/5

> 2,000 mg/kg

Female Ctrl

A B C

0 500 1,000 2,000

0/5 0/5 0/5 0/5

> 2,000 mg/kg

1)Values are expressed as number of dead animals/ number of animals tested.

Table 2. Body weights changes in male and female ICR mice after oral administration of B. subtilis JNS (n=5) Group Dose

(mg/kg)

Body weight (g)

0 day¹⁾ 1 day 3 day 7 day 14 day

Male

Ctrl A B C

0 500 1,000 2,000

20.50±0.60^NS2) 20.60±0.77 20.56±0.42 20.46±1.00

25.30±1.49^NS 27.42±1.92 28.00±1.93 27.04±1.61

27.50±1.90^NS 29.62±2.06 30.24±2.07 29.30±1.68

28.80±2.12^NS 31.74±2.05 31.70±2.31 31.04±1.83

31.36±2.53^NS 33.90±2.42 34.14±2.72 33.44±1.66

Female Ctrl

A B C

0 500 1,000 2,000

18.50±0.50^NS 18.50±0.48 18.48±0.50 18.52±0.50

22.12±1.13^NS 20.74±1.01 21.30±1.13 23.40±1.57

23.78±1.61^NS 21.70±2.01 22.94±1.32 24.28±1.33

24.14±1.84^NS 23.73±1.74 23.76±1.73 24.88±1.12

24.96±0.85^NS 24.40±1.74 25.32±1.31 26.02±1.42 The data were presented as mean±SD.

1)Day after treatment of B. subtilis JNS. ²⁾NS: not significantly different among groups.

Table 3. Clinical signs in male and female ICR mice after oral administration of B. subtilis JNS Group Dose

(mg/kg)

Clinical signs

Loss of fur Diarrhea Polyuria Soft stool Decreased motor

activity Tremor Edema

Male

Ctrl A B C

0 500 1,000 2,000

0/5¹⁾ 0/5 0/5 0/5

0/5 0/5 0/5 0/5

Female Ctrl

A B C

0 500 1,000 2,000

0/5 0/5 0/5 0/5

1)Values are expressed as number of animals with the sign/ number of animals tested.

2와 같았다. 경구투여 후 시험물질 투여군과 대조군 모두 개시 체중에 비하여 체중이 증가하였으며, 투여 전과 투여 후 모두 대조군과 모든 시험물질 투여군(0, 500, 1,000 및 2,000 mg/kg) 사이의 유의적인 체중 변화의 차이는 관찰되 지 않았다(Table 2).

임상증상

시험물질 투여군과 대조군의 ICR 마우스를 14일간 관찰 한 결과 암수 모두에서 털빠짐현상, 설사, 다뇨, 연변, 활동 저하현상, 진전 및 부종 등 시험물질 투여와 관련된 어떠한 임상증상의 이상 소견도 관찰되지 않았다(Table 3).

육안적 부검소견 및 장기무게 변화

시험물질 투여 후 14일 간의 관찰기간 종료 후 동물을 부검하여 모든 주요 장기에 대한 육안적 검사 및 장기 무게 변화를 측정하였다. 시험물질 투여군과 대조군의 모든 마우 스에서 시험물질의 투여에 기인한다고 사료되는 장기의 어 떠한 병변도 관찰되지 않았다(Table 4). 또한 시험물질 투여 농도 증가에 따른 간, 신장, 비장, 폐, 심장, 뇌 등 주요 장기 의 무게 변화도 정상 대조군과 시험물질 투여군에서 유의한 차이가 관찰되지 않았다(Table 5).

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Table 4. Gross findings in male and female ICR mice after oral administration of B. subtilis JNS

Group Dose (mg/kg)

Abnormal gross findings Observation Frequency

Male Ctrl

A B C

0 500 1,000 2,000

N.G.F¹⁾ N.G.F N.G.F N.G.F

0/5²⁾ 0/5 0/5 0/5

Female Ctrl

A B C

0 500 1,000 2,000

N.G.F N.G.F N.G.F N.G.F

0/5 0/5 0/5 0/5

1)N.G.F: no gross finding.

2)Values are expressed as number of animals with the sign/ number of animals tested.

Table 5. Organ weights of male and female ICR mice after oral administration of B. subtilis JNS (n=5) Group Dose

(mg/kg)

Organ weight (g)

Liver Kidney Spleen Lung Heart Brain

Male Ctrl

A B C

0 500 1,000 2,000

1.385±0.096^NS1) 1.494±0.119 1.540±0.115 1.572±0.113

0.252±0.021^NS 0.296±0.024 0.308±0.022 0.295±0.026

0.145±0.012^NS 0.155±0.015 0.158±0.014 0.151±0.013

0.194±0.016^NS 0.189±0.011 0.198±0.019 0.201±0.015

0.141±0.017^NS 0.159±0.014 0.158±0.016 0.151±0.014

0.454±0.032^NS 0.478±0.035 0.498±0.041 0.462±0.039

Female Ctrl

A B C

0 500 1,000 2,000

1.123±0.095^NS 1.132±0.084 1.197±0.089 1.175±0.099

0.213±0.015^NS 0.202±0.017 0.215±0.020 0.228±0.019

0.112±0.011^NS 0.115±0.010 0.116±0.009 0.121±0.011

0.144±0.012^NS 0.142±0.013 0.152±0.012 0.158±0.009

0.115±0.009^NS 0.112±0.010 0.116±0.008 0.122±0.011

0.364±0.029^NS 0.358±0.032 0.372±0.031 0.380±0.039 The data were presented as mean±SD.

1)NS: not significantly different among groups.

고 찰

전통 발효식품인 청국장에서 분리한 B. subtilis JNS 균주 의 단회투여 급성독성을 실험적으로 평가하고자 식품의약 품안전처의 의약품 등의 독성시험기준에 따라 ICR 마우스 암수에 각각 시험물질을 투여한 후 임상증상 및 부검 소견, 치사율과 체중 변화 등의 관찰을 실시하였다. 시험물질인 B. subtilis JNS의 임상적용 경로가 구강이므로 존데를 사용 하여 경구투여를 수행하였다. 시험기간 중 모든 실험동물에 서 사망 동물이 관찰되지 않아 경구투여에 의한 최소치사량 은 2,000 mg/kg 이상으로 나타났으며, 이는 식품의약품안 전처의 가이드라인에 따라 시험물질인 B. subtilis JNS는 급성독성의 측면에서 매우 안전한 물질인 것으로 판단된다.

실험 종료 시 모든 동물의 장기에 대하여 육안적 병변의 관 찰 및 무게 변화를 측정하였을 때 이상 병변 및 유의성 있는 체중 변화는 관찰되지 않았다. 본 연구와 유사하게 된장에서 분리된 Bacillus sp. A9184 균주의 SD rat에서의 급성독성 연구보고에서는 마리당 10⁸까지 투여하였을 경우에도 체중 변화나 임상적인 이상 증상이 발견되지 않아 안전하다고 보 고하였으며(13), 돼지의 장에서 분리된 Lactobacillus sp.

PSC101 균주에 대한 연구보고에서는 마우스에 14일간 10¹²까지 투여한 결과에서 안전하였다고 보고하였다(14).

김치에서 분리된 유산균 Leuconostoc citreum GR1을 ICR 계 암수 마우스에 14일간 투여에 의한 급성독성 연구보고에 따르면 최고용량 5,000 mg/kg으로 설정되었고 체중 변화, 장기병변 등은 대조구와 차이가 없었다는 점에서 본 연구 결과와 유사하였다(15).

이상의 결과로 B. subtilis JNS는 실험동물에 대하여 급성 독성이 없는 천연물 소재로 그 기능성 규명을 통해 의약품이 나 기능성 식품 소재로서의 가능성을 확인하였다. Probiot- ics는 GRAS 미생물로서 숙주에 투여했을 경우에 안전성을 가짐과 동시에 장내 유해균 억제, 유익균 증식 및 정장작용 등이 기대되는 식품소재로 인정되고 있다(16). B. subtilis JNS는 전통적인 제조 방식의 청국장에서 분리된 균주로서 그 안전성은 본 연구 결과를 통해 확인을 하였으나 pro- biotics로서는 이미 검증된 항균활성 이외에도 담즙 안전성, 내산성, 장관세포 부착성, 포자형성 및 내열성 등에 대한 연 구가 향후 필요하다고 사료된다.

요 약

청국장에서 분리한 항균활성이 우수한 Bacillus subtilis JNS의 probiotics로서의 활용성을 검증하기 위해 단기투여 에 의한 안전성을 확인하고자 실험을 실시하였다. 경구투여 용 존데를 이용하여 임상적용 경로인 경구로 투여하였으며, 최고투여용량은 2,000 mg/kg으로 설정하였다. ICR계 암수 마우스에서 14일간 관찰한 결과 일반증상, 사망률, 체중, 임 상증상 및 육안적 소견 등에서 무처리 대조군과 비교해서 유의성 있는 차이를 보이지 않았다. 부검 후의 주요 장기에 대한 육안적 검사에서 또한 대조군과 비교하여 이상소견이 나 병변이 관찰되지 않았다. 이상의 결과로부터 시험물질인 B. subtilis JNS는 경구투여 시 ICR계 암수 마우스에서 독성 학적인 변화가 관찰되지 않았으며, 경구투여가 2,000 mg/

kg 이상인 저독성의 안전한 물질로 사료된다.

감사의 글

이 논문은 2014학년도 동의대학교 교내 연구비(과제번호:

(5)

2014AA278)와 산업통상자원부･부산광역시 지원 지역혁 신센터사업(RIC) 동의대학교 블루바이오소재개발 및 실용 화지원센터의 지원으로 이루어졌습니다.

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