Study on Establishment of the Korea National Standard Reference for Filgrastim

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DOI 10.17480/psk.2018.62.5.325

유전자재조합 필그라스팀 국가표준품 확립 연구

백정희*^,§·유지혜*^,§·홍영기*^{, §}·박태환** · 강소영*^,*** ·김민정* · 김 호* · 우정남* · 허지연* · 박기대* · 엄준호* · 서수경**** · 안치영*^,#

*식품의약품안전처 식품의약품안전평가원 첨단바이오제품과

**(주)동아에스티 품질보증실, ***충북대학교 약학대학

****식품의약품안전처 식품의약품안전평가원 약리연구과

(Received June 15, 2018; Revised September 27, 2018; Accepted October 16, 2018)

Study on Establishment of the Korea National Standard Reference for Filgrastim

JoungHee Baek^*,§, Jihye Yoo*^,§, Young Ki Hong*^,§, Tae-Hwan Park**, Soyeong Kang*^,***, Min-Jung Kim*, Ho Kim*, Jeong-nam Woo*, Jiyeon Heo*, Ki Dae Park*, Joon Ho Eom*,

Soo Kyung Suh****, and Chiyoung Ahn*^,#

*Division of Advanced Therapy Product Research, National Institute of Food and Drug Safety Evaluation, Cheongju 28159, Republic of Korea

**Quality Assurance Division, DONG-A ST Co., Ltd. Daegu 42982, Republic of Korea

***College of Pharmacy, Chungbuk National University, Cheongju 28160, Republic of Korea

****Division of Pharmacological Research, National Institute of Food and Drug Safety Evaluation, Cheongju 28159, Republic of Korea

Abstract — We have established a new National Reference Standard(NRS) of filgrastim to be used for the quality management of domestic genetic recombinant drugs. Filgrastim is a recombinant human granulocyte colony stimulating factor(G-CSF) and one of the first-generation biosimilars used as the hematopoietic agent. At first, the candidate substance for the NRS was manufactured on consignment in accordance with the manufacturing process of filgrastim. The identity, purity, potency and protein contents of the candidate substance were assessed using electrophoresis, HPLC systems and a biological assay, which showed it was comparable to filgrastim in quality. In addition the stability test showed it was stable for 12 months. We performed a collaborative study with other institutes to endow it with the labelled protein content and potency values. From the data, it has been assigned with the protein content of 0.240 mg/mL(95% confidence intervals:

0.238~0.242 mg/mL) and the potency value of 2.94× 10⁷ IU per vial. We had finally enrolled it as the first Korean NRS of filgrastim as approved by Working Committee on Development of Testing and Inspection in Korea Ministry of Food and Drug Safety.

Keywords filgrastim, national reference standard, quality test, potency

서 론 (Introduction)

전 세계 의약품의 매출액 중 바이오의약품의 시장점유율은 매 년 상승하고 있다. 특히 전체의약품 시장의 성장률이 2015년에

서 2022년까지 약 50% 높아질 것으로 예상되는 가운데서도, 바 이오의약품만의 매출성장률은 이보다 더 높은 1,840 억불에서 3,370 억불로 83% 가량 급격히 성장할 것으로 예측되고 있다.¹⁾ 국내 바이오의약품 산업 역시 2007년부터 2016년까지 연도별 생 산실적, 수출실적 및 수입실적 각각 연평균 성장률은 10.4, 21.9, 15.0%로 같은 기간 전체 시장의 연평균 성장률 8.0%에 비하여 상대적으로 높은 증가율을 보이고 있다.²⁾이와 같이 바이오의약 품의 제조 및 수입이 증가하고 있는 가운데 최적의 품질관리를 위한 표준품의 존재는 의약품의 품질 및 안전관리에 있어서 주 요한 요소로 대두되고 있다.

#Corresponding Author Chiyoung Ahn

National Institute of Food and Drug Safety Evaluation, Cheongju 28159, Republic of Korea

Tel.: 043-719-4751 Fax.: 043-719-4750 E-mail: [email protected]

§These authors equally contributed to these works.

Short Report종설

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유전자재조합의약품은 동일한 유전자를 이용하여 제조하였더 라도 숙주-벡터 또는 배양 및 정제과정 등에서의 차이나, 공정 요소 등의 변경에 의하여 당화 등 단백질구조를 비롯한 다양한 변이와 그로 인한 생물활성의 차이가 나타날 수 있다. 따라서 유 전자재조합의약품의 품질관리를 위해서는 그 물리화학적 특성과 생물활성 등이 검증된 표준품의 확보가 필수적이다.³⁾국제적으로는 의약품국제조화회의(International Conference on Harmonization of Technical Requirements for Registration of Pharmaceutical for Human Use, ICH) 가이드라인⁴⁾에 따라 대표적인 표준품을 설정하 여 여러 시험기관에서 분석하고, 그 결과를 일관성 있게 검토 · 관 리하고 있다. 미국의 경우 비영리단체인 미국약전위원회(United States Phamacopeia, USP)에서, 유럽의 경우 유럽의회 산하기관 인 유럽의약품품질위원회(European Directorate for the Quality of Medicine & Healthcare)에서 주도적으로 국제 수준의 표준품 을 제정하는 업무를 수행하고 있다.⁵⁾

바이오의약품의 경우, 그 구조의 복잡성에서 기인한 품질관리 의 어려움 때문에, 각 회사에서 제조 관리하는 자사 표준품을 사 용할 경우 측정값에 대한 신뢰의 문제 등이 발생할 수도 있다.

이에 세계보건기구(World Health Organization, WHO)는 백신, 혈액제제를 포함한 바이오의약품에 대한 국제표준품의 생산 및 확립을 지속적으로 수행해 오고 있다. 그러나, 국제표준품의 안 정적인 생산, 관리, 보급과 국제적으로 동등한 수준의 바이오의 약품 유통을 위하여 WHO 국제표준품을 기반으로 한 국가표준 품을 확립하도록 권고하고 있다.⁶⁾

이에, 식품의약품안전평가원은 지금까지 4 종의 유전자재조합 의약품 국가표준품을 제조 · 확립하였고, 의약품 등의 표준품 분 양 및 관리 지침⁷⁾에 따라, 현재는 인터페론알파-2a(Interferon alpha 2a, IFNα2a)에 대하여 역가용(국가표준품 분류코드 01/003) 과 특성분석용(국가표준품 분류코드 03/011)으로 2 종만 유지, 분양을 위하여 관리하고 있다.

특히, 최근에는 다양한 유전자재조합의약품의 특허가 만료 · 도 래되어 국내 제약사의 바이오시밀러 개발이 활발해짐에 따라 공 인된 국가표준품에 대한 요구가 더욱 증대되고 있다. 바이오시 밀러 시장 확대와 관련하여 국내에서는 바이오시밀러 중 1 세대 라고 할 수 있는 저분자 바이오의약품인 성장호르몬(Growth hormone, GH), 에리스로포이에틴(Erythropoietin, EPO), 필그라 스팀(Filgrastim, 과립백혈구집락자극인자, Granulocyte-colony- stimulating factor, G-CSF) 제품이 활발히 개발, 생산되고 있다.⁸⁾ 이중, 필그라스팀은 항암보조제로서 바이오의약품 세계시장의 베스트셀러 중의 하나이자 1세대 바이오시밀러의 주요 품목이다.⁹⁾ 주로 고형암 또는 혈액종양에 대해 항암화학요법을 받고 있는 환 자의 호중구감소증, 골수이형성증후군에 따른 호중구감소증 및 재생불량성빈혈에 따른 호중구감소증 등에 처방되며¹⁰⁾,국내 유 전자재조합의약품 수출액 상위 10 개 품목 중 하나이다.¹¹⁾

이에 식품의약품안전평가원에서는 이번 연구를 통해 국내 생 산 · 유통되는 필그라스팀 제품의 신뢰성 있는 품질관리를 위하 여 지속적이고 안정적인 공급이 가능할 수 있도록 필그라스팀 유 전자재조합의약품 국가표준품을 제조 · 확립하고자 하였다.

연구 방법 (Experimental Methods)

국가표준품 후보물질의 제조

위탁제조사가 제조판매 품목 허가를 받은 완제의약품(류코스 팀주사액 300 μg/1.2 mL)의 제조방법과 동일한 제조방법으로 필 그라스팀 국가표준품 후보물질(이하, 후보물질)을 제조하였다.

원액 제조를 위해서는 제조용 세포은행으로부터 종배양, 본배 양을 수행하였다. 이를 농축, 파쇄한 후, 인클루전 바디를 회수, 용해 및 활성화를 진행하였다. 이후 산 침전을 유도한 다음 이온 교환크로마토그래프, 황산암모늄 침전, 겔여과크로마토그래프 등 의 정제과정을 거쳐 원액을 마련하였고 최종 원액을 여과 후 충 전하였다. 단, 충전 규모 및 충전 규모 변경에 따른 일부 공정 변 수는 변경되었다. 이를 통하여 완제의약품 기준으로 1,353 바이 알을 제조하였다. 제조된 필그라스팀 국가표준품 후보물질은 4^oC 에서 보관하였다.

이들 중 일부를 품질평가, 안정성 시험 등에 사용하였다. 남은 바 이알은 국가표준품 등록 심의 후에 국가표준품으로서 등록하고 4^oC 에서 보관하였다. 품질평가는 유럽약전(European Pharmacopoeia, EP)의 필그라스팀항¹²⁾및 대한민국약전(Korean Pharmacopoeia, KP) 의 필그라스팀농축액¹³⁾항을 참고로 작성된 아래의 시험방법에 의 해 시험하였다.

주요시약

표준대조물질로서 생물학적 활성시험용과 이화학분석용, 이 두 종류의 필그라스팀을 사용하였다. 생물학적 활성시험용은 NIBSC(London, UK)에서 G-CSF 2nd 국제표준품인 09/136(역 가: 95,000 IU/mL)을, 이화학분석용 국제표준품은 EDQM (Strasbourg, France)의 Filgrastim 국제표준품 두 번째 배치인 Y0001173(1.7 mg/mL)를 사용하였다.

필그라스팀 후보물질의 품질평가

성상, pH, 실용량시험, 불용성이물시험, 기밀도시험, 엔도톡신 시험, 무균시험, 불용성미립자시험 등 제제학적 특성에 따른 시 험은 대한민국약전의 주사제항에 따라 수행하였으며 그 외 확인, 순도, 역가, 함량 시험은 아래 시험방법에 따라 수행하였다.

1) 전기영동법

SDS-PAGE 젤은 Invitrogen사의 4-20% Tris-Glycine Mini(Cat No. XP04200) 젤을 사용한다. 분자량 표준품은 Invitrogen사의

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See Blue Plus Pre-stained protein standard(Cat. No. LC5925)를 사용하고, 이동완충액은 Invitrogen사의 SDS running buffer(Cat.

No. LC2675), 비화원조건의 샘플완충액은 Invitrogen사의 SDS sample buffer(Cat. No. LC2676)를, 환원조건의 샘플완충액은 비 환원조건의 샘플완충액에 1% 2-mercaptoethanol을 녹여 사용했 다. 50% 에탄올과 10% 초산을 혼합하고 초순수로 혼합하여 만든 고정액을 준비하고, 감광액, 은 용액, 정지액, 현상액을 제조사의 매뉴얼(ProteoSilver™ Silver Stain Kit, Cat. No. PROT-SIL1)에 따라 제조했다. 표준액은 유럽의약품품질위원회(European^® Directorate for the Quality of Medicines, EDQM) 화학표준물 질(Chemical Reference Substance, CRS)을 100 μg/mL의 농도 가 되도록 샘플완충액으로 희석했다. 그리고 환원조건과 비환원 조건에 따라 각각 준비한다. 후보물질은 역시 같은 농도가 되도 록 준비하며, 시험적합성을 확인하기 위하여 2% 농도(2 μg/mL) 의 검액도 준비했다. 준비된 후보물질과 국제표준품 표준액을 85^oC에서 2 분간 가열하고 상온으로 냉각한 다음 spin down한 후, 20 μL 씩 환원조건과 비환원조건으로 구분하여 주입한 후, 전 기영동 했다. 125 V에서 90 분간 전기영동하여 염색선이 젤의 아 래 끝부분까지 전개되면 전기영동을 멈추고, 젤을 분리하여 세 척한 후 은염색법으로 단백질을 염색하여 확인했다.

2) 등전집속시험

IEF 젤은 Invitrogen사의 3-10(Cat. No. EC6655) 젤과 SERVA 사의 등전점 표준품(IEF marker 3-10, Cat. No. LC5925)을 사 용했다. 샘플완충액은 Invitrogen사의 IEF sample buffer(Cat.

No. LC5311)를, 양극완충액은 Invitrogen사의 IEF anode 50X(Cat.

No. LC5300)을 1X로 희석하여, 음극완충액은 Invitrogen사의 IEF cathode 10X(Cat. No. LC5310)을 1X로 희석하여 사용했다. 트 리클로로아세트산(Trichloroacetic acid, TCA) 57.3 g과 술포살리 실산(Sulfosalicylic acid) 17.3 g을 500 mL 초순수에 녹여 고정액 을 제조했다. 염색용액은 GE healthcare사의 PhastGel^® Blue R(Cat. No. 17-0518-01) 1 정을 탈색용액 400 mL에 녹여 제조했 다. 탈색용액은 30% 메탄올, 10% 초산을 초순수와 혼합하여 제 조했다. 표준액으로서는 EDQM CRS 국제표준품을 0.15 mg/mL 의 농도가 되도록 샘플완충액으로 희석한 것과, 이것의 10% 농 도인 0.015 mg/mL로 농도로 희석한 것을 준비했다. 후보물질은 표준액과 동일한 농도가 되도록 샘플완충액으로 희석하여 준비 했다. 등전집속용 젤을 전기영동장치에 설치하고 음극완충액과 양극완충액을 채운 뒤, 등전점표준품 및 표준액 2 종, 희석한 후 보물질을 차례로 20 μL씩 넣고, 100 V에서 1 시간, 200 V에서 1 시간, 500 V에서 30 분간 전기영동 했다. 전개가 끝나면 젤을 고 정용액에 옮겨 30 분간 흔들며 고정시킨 후 탈색용액으로 5 분 간 세척했다. 세척한 젤을 10 분간 염색용액과 반응시키면서 염 색시킨 후 탈색용액으로 충분히 세척한 후 결과를 확인했다.

3) 크기배제 고속액체크로마토그래프법

본 연구에 사용한 모든 HPLC 시험은 펌프와 검출기 등이 포 함된 Waters US/e 2695 시스템을, 분석프로그램은 Empower 3 소프트웨어를 사용하였다. 이동상은 7.9 g의 ammonium hydrogen carbonate를 1,000 mL의 초순수에 녹이고 phosphoric acid를 이 용하여 pH 7.0으로 조정한 후 전체 부피가 2,000 mL이 되도록 초순수를 첨가하여 제조했다. 표준액은 EDQM CRS 국제표준품 을 초순수로 희석하여 0.25 mg/mL로 준비하며, 국가표준품 후보 물질은 그대로 사용했다. 친수성의 실리카겔이 충전된 분석용 컬 럼(길이 0.3 m, 내경 7.8 mm, 입자크기 5 μm, TOSHO, TSKgel G3000SWxL)을 사용하여 각 시료를 24 μL씩 주입하여 유속 0.5 mL/min로 검출파장 215 nm, 농도구배 없이 30 분간 전개하 였다. 단량체는 유지시간 약 19 분에서 용출되며, 이 단량체 이 외의 불순물 피크 면적의 합을 계산하여 순도를 확인했다.

4) 역상 고속액체크로마토그래프법

이동상 A는 1,000 mL의 초순수에 1 mL의 트리클로로아세트 산을 첨가하여 조제하며, 이동상 B는 1,000 mL의 크로마토그래 프용 아세토니트릴에 1 mL의 트리클로로아세트산을 첨가하여 조 제했다. 표준액은 EDQM CRS 표준품을 초순수로 희석하여 0.25 mg/mL로 조제하며, 후보물질은 그대로 사용했다. 준비된 시 료를 부틸실릴화 시킨 실리카겔이 충전된 분석용 컬럼(길이 0.25 m, 내경 4.6 mm, 입자크기 5 μm, pore size 30 nm)에 48μL 주입한 후, 유속 0.6 mL/min으로 검출파장은 215 nm, 처음 5 분간은 이동상 A와 B의 비율을 50 : 50으로, 이후 40 분까지는 45 : 55로, 41 분부터 45 분까지는 0 : 100, 46 분부터 55 분까지 는 다시 50 : 50으로 농도구배로 전개했다. 유사단백질을 보기 위 해서는 0.25 mg/mL로 희석한 표준액 500 μL에 0.45%(v/v) 과산 화수소 용액을 첨가하여 25^oC에서 30 분 반응시킨 후 1.5 mg 메 치오닌을 추가한 반응시킨 산화형 단백질 검출용 분리도 용액을 준비했다. 검액 단백질의 함량은 표준액의 전체피크면적대비 검 액 전체피크 면적비로 계산했다.

5) in vitro 생물학적 활성시험

NFS-60(ATCC No. CRL-1838) 세포주를 사용하여 실험했다.

배양용 배지는 10%(v/v) 소태아혈청(Fetal bovine serum, FBS, Cellgro, Cat. No. 35-015-CV) 및 1 ng/mL의 농도로 인터루킨- 3(Interleukin-3, IL-3, R&D systems, Cat. No. 403-ML-010)가 첨가된 RPMI 1640(Cellgro, Cat. No. 10-041-CV) 배지를 사용 하고, 시험용 배지는 5%(v/v) FBS가 첨가된 RPMI 1640 배지 를 사용했다. 세포증식여부는 CellTiter 96^® AQueous One Solution Reagent(Promega, Cat. No. G3581)로 확인했다. 역가 값을 보정하기 위한 표준물질로서는 NIBSC 국제표준품(2nd International Standard for G-CSF(Code No. 09/136))를 사용했

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다. 세포 생존율이 90% 이상이 되도록 관리하며 사용했다. 표준 액은 NIBSC 국제표준품을 시험용 배지를 사용하여 약 800 IU/

mL에 해당하는 단백질 농도로 희석한 후, 다시 연속적으로 2 배 씩 희석하여 총 10개 농도의 필그라스팀 표준품 희석액을 준비 했다. 후보물질은 시험용 배지를 사용하여 약 800 IU/mL에 해당 하는 단백질 농도로 희석한 후, 다시 연속적으로 2 배씩 희석하 여 총 8개 농도의 후보물질 희석액을 준비했다. 96 웰 플레이트 에 표준액 희석액과 후보물질 희석액을 농도별로 3 반복씩 분주 하고, 배지만 있는 대조군도 준비했다. 이후, NFS-60 세포를 시 험용 배지로 세척하여 시험용 배지를 사용하여 최종 3.5 × 10⁵ cells/mL의 농도가 되도록 희석했다. 희석한 NFS-60 세포용액에 최종 농도가 0.1 mM이 되도록 2-mercaptoethanol을 첨가했다.

표준품 희석액, 후보물질 희석액, 시험용 배지를 분주한 96 웰 플레이트의 각 웰에 준비한 NFS-60 세포용액을 100 μL 씩 분주 하고 37^oC, 5% CO₂ incubator에서 40~44 시간 배양했다. 배양 이 끝난 96 웰 플레이트의 각 well에 CellTiter 96^® AQueous One Solution Reagent를 30 μL 씩 분주하고, 37^oC, 5% CO₂ incubator에서 2~4 시간 동안 반응 후 490 nm에서 흡광도를 측 정했다. 측정 결과는 평행선 분석법과 같은 적당한 통계처리방 법으로 역가를 계산했다.

장기 및 단기 안정성 시험

후보물질의 국가표준품으로서의 등록 적합성을 평가하기 위하 여 식품의약품안전처의 의약품 등의 표준품안정성시험 지침¹⁴⁾에 따라 장기안정성 시험과 단기 가속안정성 시험을 계획하여 수행 하였다. 장기안정성시험은 온도 2~8^oC, 습도 55~65%의 보관조

건에서 0, 1, 3, 6, 9, 12 개월 시점에 수행하였으며, 가속안정성 시험은 온도 23~27^oC, 습도 55~65%의 보관조건에서 1, 3, 6 개월 시점에 수행하였다. 확인, 순도, 역가, 함량을 품질평가 항 목으로 선정하여, 전기영동시험, 등전집속시험, 크기배제 고속액 체크로마토그래프법, 역상 고속액체크로마토그래프법 그리고 in vitro 생물학적 활성시험을 수행하였다. 각 시험방법 세부 내용은 필그라스팀 후보물질의 품질평가항에 기술하였다. 각 도래시점 마다 3 회씩 독립적인 시험을 수행하여 그 평균값으로 결과를 산 출하였다.

공동연구를 통한 역가 산정

필그라스팀 국가표준품 후보물질의 역가는 식품의약품안전처, 위탁제조기관 및 오송첨단의료산업진흥재단간 공동 연구를 통해 산정되었다. 역가 시험은 연구방법에 기재된 in vitro 생물학적 활성시험 방법대로 세 기관이 동일하게 수행하였으며 각 기관에 서 각각 3 회씩 수행하여 얻어진 결과들을 통계분석을 통해 계 산하였다.

통계분석

가속 및 장기안정성 시험 결과를 통하여 안정성 기간을 추정 하는 데에는 회귀분석을 사용하였다. 신뢰수준 95%, 유의수준은 5%로 설정하여 양측검정을 수행하였다. 후보물질의 역가 산정을 위해서는 3 기관에서 수행한 상대역가 시험결과를 이원 분산분 석(two-way ANOVA)를 통해서 유의성을 검증한 후 평균하여 계 산하였다.

Table I− The results of quality test for Filgrastim NRS candidate.

Test method Acceptance criteria Result

1. Appearance Colourless clear liquid vial Colourless clear liquid vial

2. pH 3.7~4.3 3.9

3. Identity

3.1. SDS-PAGE Consistent with (Reference) Standard (The retention time of the main band in

the sample and standard should be similar.) Pass

3.2. Isoelectric focusing Consistent with (Reference) Standard (The retention time of the main band in

the sample and standard should be similar.) Pass

3.3. SE-HPLC The retention time difference of the main peak in the sample and standard ≤

± 1 min Pass

4. Purity

4.1. SDS-electrophoresis No band except for main bands is more intense than the main band in the 2%

sample solution. Pass

4.2. Isoelectric focusing No band except for main bands is more intense than the main band in the 10%

standard solution. Pass

4.3. SE-HPLC Total peak area except for the main peak area ≤ 2.0% 0.0%

5. Deliverable volume ≥ 3.6 mL(1.2 mL × 3 vials) Ave.: 3.95 mL(3.95~3.95)

6. Protein 0.225~0.275 mg/mL 0.235 mg/mL

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연구결과 및 고찰 (Results and Discussion)

필그라스팀 후보물질의 품질평가

위탁제조기관에서 제조한 후보물질에 대하여, 유럽약전과 대 한민국약전의 필그라스팀 항을 참고로 하여 유전자재조합의약품 허가 규정¹⁵⁾에 따라 필요한 시험을 수행하였다. 성상, pH, 실용 량시험, 불용성이물시험, 기밀도시험, 엔도톡신시험, 무균시험, 불 용성미립자시험 등 제제학적 특성에 따른 시험을 대한민국약전 의 주사제항에 따라 수행한 결과, 기준에 만족하는 것을 확인하 였다(Table 1). 후보물질 주성분인 필그라스팀에 대한 품질평가 항목으로는 확인, 순도, 역가, 함량 시험을 선정하였다.

주성분의 확인을 위해서는 전기영동시험과 등전집속시험, 크기 배제 고속액체크로마토그래프법을, 순도는 확인시험방법에 추가 로 역상 고속액체크로마토그래프법을 사용하였다. 단백질 함량 역 시 역상 고속액체크로마토그래프법을 통하여 측정하였으며, 역가 는 세포를 사용한 in vitro 생물학적 활성시험으로 수행하였다.

전기영동시험 결과(Fig. 1), 환원 및 비환원 조건에서 각각 시 험할 때 후보물질과 표준액에서의 주밴드 이동거리가 유사한 것 을 확인하였으며, 후보물질의 주밴드 이외의 그 어떤 밴드도 2%

농도(2 μg/mL)의 후보물질의 레인에서 보여지는 밴드보다 진한 밴드는 관찰되지 않았다. 등전집속시험 결과(Fig. 2) 역시 후보물 질과 표준액에서의 주밴드의 이동거리가 유사하고, 후보물질의 주밴드 이외의 어떠한 밴드도 10% 농도(0.015 mg/mL) 표준액 의 주밴드보다 진한 밴드는 관찰되지 않았다.

크기배제 고속액체크로마토그래프법 결과 후보물질과 표준액 에서의 주피크의 유지시간 차이가 ±1 분 이내로 유사하였다(Fig.

3). 이번 연구에서 사용한 컬럼과 다른 컬럼을 사용한 논문¹⁶⁾에

Table I− The results of quality test for Filgrastim NRS candidate (continued).

7. Related proteins 7.1. Related proteins (1)

individual impurity area ≤ 2% 0%

7.2. Related proteins (2) total

impurity area ≤ 3.5% 0.2%

8. In vitro bioassay 80~125% 117%

9. Foreign insoluble matter test Not foreign insoluble Pass

10. Leak test method Not colored in vial Pass

11. Bacterial endotoxins ≤ 0.2 EU/mL Maximum 0.2 EU/mL

12. Sterility Growth of microorganisms not occurs. Pass

13. Particulate matter (1) ≥

10µm ≤ 6,000 particles/container 11 particles/container

14. Particulate matter (2) ≥

25µm ≤ 600 particles/container 1 particle/container

Fig. 1− SDS-PAGE results of Filgrastim NRS candidates. (Upper) Non-reducing SDS-PAGE data. (Lower) Reducing SDS- PAGE data.

1: Invitrogen –See Blue Plus Pre-stained protein standard 2: Filgrastim EDQM CRS (0.1 mg/mL)

3: Filgrastim NRS candidate (0.1 mg/mL) 4: Filgrastim NRS candidate (0.05 mg/mL) 5: Filgrastim NRS candidate (0.005 mg/mL) 6: Filgrastim NRS candidate (0.0001 mg/mL) 7: Filgrastim NRS candidate (0.000001 mg/mL)

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서는 주피크 유지시간이 약 16 분으로 보고되었으나, 본 시험에 서 주피크의 유지시간은 약 19 분으로 이전의 논문과 유사하게 나타났다.¹⁷⁾후보물질에서 주피크를 제외한 피크는 거의 나타나 지 않았다.

역상 크로마토그래프법을 사용하여 단백질 함량과 순도 중 산 화형 단백질변이체의 양을 확인¹⁸⁾한 시험결과는 Fig. 4와 같다.

표준액의 함량 값에 대비하여 후보물질의 최초 함량을 계산한 결 과 0.235 mg/mL로 측정되었다. 산화형 단백질변이체 중 가장 큰 피크의 상대피크면적은 전체피크면적의 0.11%로, 산화형 단백질 변이체 피크면적의 총합은 전체피크면적의 0.21%로 매우 낮게 나타났다.

바이오의약품에 있어서 품질관리항목 중 하나인 역가는 그 바 이오의약품의 생체내에서의 작용기전을 반영하여 설정되어야 하 므로 매우 중요하다.¹⁹⁾ 역가 측정을 위해 NFS-60 세포주를 사용 하는 in vitro 생물학적 활성시험법을 사용하였다. 그 결과, NIBSC 국제표준품 대비 상대역가는 통상적인 상대역가 허용범위인 80.0%

Fig. 2− IEF results of Filgrastim NRS candidate.

1: IEF marker 3-10, SERVA Liquid Mix, SERVA Electrophoresis 2: Filgrastim EDQM CRS (0.15 mg/mL)

3: Filgrastim EDQM CRS (0.015 mg/mL) 4: Filgrastim NRS candidate (0.15 mg/mL)

Fig. 3− SE-HPLC chromatogram results of Filgrastim NRS candidates.

(Upper) Filgrastim NRS candidate chromatogram was overlaid with that of Filgrastim EDQM CRS(Red line). The main peak of EDQM CRS appeared at 18.784 minutes.

(Lower) The main peak of Filgrastim NRS candidate appeared at 18.787 minutes in the chromatogram.

Fig. 4− RP-HPLC chromatogram results of Filgrastim EDQM CRS(upper) and NRS candidate(lower). (Upper) The main peak of EDQM CRS appeared at 25.265 minutes. (Lower) The main peak of Filgrastim NRS candidate appeared at 25.142 minutes in the chromatogram. Oxidant form1 of Filgrastim NRS candidate was detected at 21.650 min and Oxidant form2 was not detected. The relative retention time(RRT) of Oxidant form1 was 0.86.

(7)

에서 125.0%를 만족하는 116.9%로 측정되었다(Table 2).

위와 같이 위탁 제조된 후보물질에 대하여 확인, 순도, 역가, 함량의 품질평가항목을 시험한 결과, 공정서 및 자체적으로 설 정한 기준에 적합하였다.

장기 및 단기 안정성 시험

장기 및 단기 안정성 시험 결과는 Table 3과 같다. 확인 및 순도 시험 결과, 전체 시험기간 동안 안정된 결과가 나타났다. 단 백질 함량의 경우, 장기안정성 시험에서 최댓값 0.243 mg/mL, 최솟값 0.235 mg/mL로 품질이 적정한 수준에서 유지되는 것을 확인할 수 있었다. 단, 가속안정성 시험에서는 6 개월 차에서 단 백질 함량이 0.217 mg/mL으로 저하되는 것을 볼 수 있었다. 순 도항목에서 장기안정성 시험에서는, 개별 산화형 단백질변이체 의 경우 0.3% 이내, 총 산화형 단백질 변이체의 비율 0.4% 미만 이었으나, 가속안정성 시험의 6 개월 차에 이르러서는 산화형 단 백질 변이체와 탈아민화 변이체를 포함한 총 불순물 총합이 1.11%

로 급격히 증가하는 것이 확인되었다. 이러한 품질 저하는 정제 과정에서도 일어날 수 있으며, 액상 제형의 가속시험 조건에서 는 자연적으로 일어날 수 있는 현상으로 사료된다.¹⁶⁾

역가 시험의 경우 안정성 검체의 역가 값이 최댓값 114.4%에 서 최솟값 101.4%으로, 품질의 적합성 기준인 80.0~125.0%의 범 위 안에 포함되어 있어, 해당 안정성 기간 동안 품질이 보증됨을 확인할 수 있었다. 후보물질의 역가측정값들에 대한 T검정(유의 수준 5% 양측검정) 결과는 12 개월 동안 역가에 유의미한 차이 Table II− The results of quality test for potency(n=3). Assay validity

was confirmed by regression, non-parallelism and non- linearity.

Trials 1 2 3

Assay Validity

(F-test) Probability(p)

Regression (p<0.05) 1.6E-15 8.5E-13 5.5E-13 Non-parallelism

(p≥0.05) 0.589 0.568 0.536

Non-linearity

(p≥0.05) 0.150 0.312 0.557

Results Pass Pass Pass

Potency(%) 120.1 116.3 114.3

95% Confidence

Interval(%) 109.3~132.3 101.6~133.6 100.2~130.9

Potency 116.9

Table III− The results of long-term stability study and short-term degraded study for Filgrastim NRS candid.

Test Analytical

method Acceptance criteria

Results Long-term stability

(month)

Accelerated stability (month)

0 1 3 6 9 12 1 3 6

Identity

SDS-PAGE

Consistent with (Reference) Standard (The retention time of the main band in the sample and standard should be similar.)

Pass Pass Pass Pass Pass Pass Pass Pass Pass

Isoelectric focusing

Consistent with (Reference) Standard (The retention time of the main band in the sample and standard should be similar.)

SE-HPLC The retention time difference of the main

peak in the sample and standard ≤ ± 1 min Pass Pass Pass Pass Pass Pass Pass Pass Pass

Purity/

Impurity

SDS-PAGE

No band except for main bands is more intense than the main band in the 2% sample solution.

Isoelectric focusing

No band except for main bands is more intense than the main band in the 10%

standard solution.

SE-HPLC Total peak area except for the main peak

area ≤ 2.0% 0.0% 0.0% 0.0% 0.1% 0.3% 0.1% 0.0% 0.0% 0.0%

RP-HPLC

Individual impurity area ≤ 2% 0%

(0.11%) 0%

(0.19%) 0%

(0.25%) 0%

(0.26%) 0%

(0.25%) 0%

(0.23%) 0%

(0.22%) 0%

(0.19%) 1%

(0.80%) Total impurity area ≤ 3.5% 0.2%

(0.21%) 0.2%

(0.24%) 0.3%

(0.30%) 0.3%

(0.33%) 0.3%

(0.34%) 0.3%

(0.31%) 0.3%

(0.27%) 0.2%

(0.22%) 1.1%

(1.11%)

Potency In vitro

bioassay 80~125%

117%

(116.9

%) 114%

(114.4

%) 112%

(112.2

%) 115%

(115.2

%) 105%

(105.3

%) 101%

(101.4

%) 113%

(112.7

%) 107%

(107.3

%) 98%

(98.0%) Protein

contents

RP-HPLC

(mg/mL) 0.225~0.275 mg/mL 0.235 0.236 0.236 0.239 0.243 0.238 0.236 0.232 0.217

(8)

가 없는 것으로 확인되었다(t 임계값(t_critical)=4.303>0.05).

이와는 별도로, 단백질 표시함량의 산정을 위하여 위탁제조기 관과 식약처 두 기관에서 총 6 회 시험을 수행하였다. 전체 시험 결과의 평균값은 0.240 mg/mL, 표준편차 0.002858, 95% 신뢰구 간의 범위는 0.238~0.242 mg/mL로 나타났다. 본 결과는 필그라 스팀 국가표준품의 함량에 대한 품질관리시 반영할 것이다.

역가 산정을 위한 공동연구결과

본 연구과제의 최종목표는 제조회사나 규제기관에서 품질관리 를 위한 시험 수행시 표준물질로 사용할 수 있는 필그라스팀 국가 표준품을 확립하는 것이다. 특히 생물학적 활성시험의 표준물질로 사용하기 위해서는 제조된 후보물질에 대하여 표시역가가 부여되 어야 한다. 이를 위하여 연구방법에 기재된 in vitro 생물학적 활성 시험 방법대로 위탁제조기관 및 오송첨단의료산업진흥재단과 다 기관 공동연구를 통해 표시역가를 산정하였다. 각각의 기관에서 동 일한 시험법으로 각각 3 회씩 수행하여, 그 결과를 이원 분산분석 을 통해 유의성을 검정한 결과, 시험기관 간 및 시험일자에 따른 유의한 차이는 없는 것으로 확인되었다. 이에 따라 관측된 상대역

가 값에 대하여 상대역가 평균은 103.1%, 전체상대표준편차 7.2%, 95% 신뢰구간 100.1~106.0%를 도출하였다. 이 상대역가 값을 토 대로 시험 중 희석배수, 시험의 표준편차 등을 고려하여 후보물질 의 최종 역가는 2.94 × 10⁷ IU/Vial로 산정하였다(Table 4).

결 론 (Conclusion)

본 연구에서는 위탁제조기관을 통해 필그라스팀 국가표준품 후보물질 1,353 바이알을 제조하였고, 다기관 공동으로 제조된 후보물질에 대한 품질평가 및 안정성 시험을 수행하여 적합성을 검증하였다.²⁰⁾역가산정을 위해서는 다기관에서 동일한 생물학 적 시험 프로토콜을 가지고 공동연구를 수행하였다. 이와 같은 품질평가 및 안정성 시험결과를 종합하여 국가표준품 후보물질 에 대한 규격(안)을 작성하였다(Table 5). 본 후보물질은 in vitro 생물학적 시험과 순도, 함량시험을 위한 표준물질로 사용할 수 있을 것으로 사료되어, 식품의약품안전처 시험검사발전실무위원 회의 심의를 거쳐 국가표준품으로 등록하였다. 이후에도 안정성 시험을 수행하여 안정성 기간 연장에 대한 자료를 확보, 국가표 준품으로서의 품질을 점검· 유지할 것이며, 안정성 연구결과는 식품의약품안전평가원 홈페이지²¹⁾를 통하여 공지할 예정이다.

식품의약품안전평가원은 이번 연구를 통해 국내 유통 유전자 재조합의약품의 신뢰성 있는 품질관리를 위하여, 국내외 제약산 업계에 안정적으로 공급이 가능한 필그라스팀 유전자재조합의약 품 국가표준품을 제조, 확립하였다. 이번 연구에서 확보한 제조, 품질평가 경험 등은 앞으로의 새로운 바이오의약품 국가표준품 후보물질 제조 및 확립에도 도움이 될 것으로 사료된다.

감사의 말씀 (Acknowledgments)

국가표준품 후보물질 제조와 관련하여 연구에 도움 주신 동아 에스티(주), 통계분석관련 자문을 해주신 숙명여대학교 약학대학 조정환 교수님과 역가 산정에 참여한 오송첨단의료산업진흥재단 신약개발지원센터에 감사드립니다. 본 연구는 식품의약품안전처 의 연구개발비(16171MFDS195)로 수행되었다.

Table VI− The results of inter-laboratory potency tests. ¹⁾National Institute of Food and Drug Safety Evaluation (NIFDS),

2)Dong-A ST, ³⁾Osong Medical Innovation Foundation (KBIO).

Relative Potenty A¹⁾ B²⁾ C³⁾

Trials

Day1 101.70 96.23 103.10

Day2 113.87 109.67 96.17

Day3 98.60 102.70 105.53

Means 104.72 102.87 101.60

P_calc F_critical F_calc

F-test

Lab. to Lab variation

0.517 3.55 0.68

Non-Significant (P_calc> 0.05, F_calc≤ F_critical) Day to day

variation

0.087 3.55 2.81

Non-Significant (P_calc> 0.05, F_calc≤ F_critical) Total Means 103.06 95% confidence

interval 100.13~106.00

Table V− Specifications of Filgrastim NRS candidate.

Title Test method Specifications

Potency In vitro bioassay 2.94× 10⁷ IU/vial

Protein contents RP-HPLC 0.240 mg/mL (95% confidence intervals: 0.238~0.242 mg/mL)

Purity/Impurity

SDS-PAGE No bands except main band showed stronger signals than 2% of main band.

IEF No bands except main band showed stronger signals than 10% of main band.

SE-HPLC Sum of total impurities < 2%

RP-HPLC Individual impurity < 2%

Sum of total impurities < 3.5%

(9)

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