Characterization of Prunus necrotic ringspot virus Isolate from Peach in Korea

(1)

Res. Plant Dis. 15(3) : 170-174 (2009)

©The Korean Society of Plant Pathology

국내 복숭아에서 분리한 Prunus necrotic ringspot virus의 특성

김현란*·이신호¹·신일섭·김정희·조강희·허 성·김정수²·최용문³ 농촌진흥청 국립원예특작과학원 과수과

,

¹^{한국과수농협연합회}

,

2농촌진흥청 국립농업과학원

,

³^{농촌진흥청}

Characterization of Prunus necrotic ringspot virus Isolate from Peach in Korea

Hyun Ran Kim

^*

, Sin-Ho Lee

¹

, Il-Sheob Shin, Jeong Hee Kim, Kang-Hee Cho, Seong Heo, Jeong Soo Kim

²

and Yong Mun Choi

³

Fruit Research Division, National Institute of Horticultural & Herbal Science, Rural Development Administration, Suwon 441-440, Korea

1

Korea Fruit Agricultural Co. Federation, Seoul 137-133, Korea

2

National Academy of Agricultural Science, R.D.A. Suwon 441-707, Korea

3

Rural Development Administration, Suwon 150, Korea (Received on July 23, 2009; Accepted on October 28, 2009)

In this paper, we report a characterization of Prunus necrotic ringspot virus (PNRSV) isolate. The virus was identified from ‘Yumyeong’ peach showing mild mosaic on leaves in commercial orchard of ‘Umsung’, Chungbuk province in Korea. The virus isolate produced ringspot symptom on the inoculated cotyledons and systemic mosaic and malformation on the upper leaves of Cucumis sativus . Systemic mottles were appeared in Chenopodium quinoa . When the buds of the virus infected stem were grafted on the healthy young Prunus persica GF305 seedlings, line pattern with mosaic appeared within 3 months. Isometric virus-like particles were found in parenchyma cells and plasmodesmata of C. sativus leaves inoculated mechanically with the virus. The cDNA fragments of PNRSV coat protein (CP) region, approximately 675bp, were synthesized from genomic RNA extracted from virus-infected leaves by RT-PCR using specific primer pairs. Partial nucleotide sequences of the CP regions were determined and analyzed with the known PNRSV. The CP gene of PNRSV- Korea isolates showed 93.9~94.7% similarity to the 4 known PNRSV isolates.

Keywords : Ilarvirus, Indicator assay, RT-PCR detection, Peach, PNRSV

복숭아

,

^살구

,

^자두 ^등^{핵과류에는} ^전^{세계적으로} ^심각

한문제를 일으키는

Plum pox virus (PPV)

^를^포함하여 ^약

18

^여종의 ^{바이러스와}

3

^종의^{바이로이드가} ^보고되어^있다

.

국내에서는 복숭아나무에서의

Prunus necrotic ringspot virus (PNRSV)

^발생이^김 ^등

(2001)

^에 ^의해^발표된 ^보고가

있을뿐 복숭아 바이러스병에관한논문은 거의없는 실 정이다

.

한편

, PNRSV

^는 ^전 ^{세계적으로} ^복숭아

,

^양앵두 ^등 ^핵

과류에서 경제적인 피해를 주는 주요 바이러스 중의 하 나로 보고되어 있으며

(Smith

^등

, 1972; Wood

^등

, 1979)

분류학적으로는

Family Bromoviridae , Genus Ilarvirus subgroup 3

^에 ^속하는 ^{바이러스이다}

(Alan

^등

, 1995).

^바이

러스 입자는 직경

23 nm

^정도의 ^크기로 ^구형과 ^간상형

의 입자로존재한다

.

^접목

,

^화분에 ^의해^전염되고 ^종자로

도 전염이가능한 것으로 알려져 있으며 초본식물에서는 즙액접종으로감염되는것으로보고되어있다

(Fulton, 1970;

1983).

현재까지국내에서

Ilarvirus

에관한연구는

Apple mosaic virus (ApMV)

^의 ^{진단기술에} ^대한 ^보고가 ^있지만

(

^이 ^등

, 2002;

^최^등

, 2003)

^{생물검정을}^통한^바이러스 ^분리^특성

및 유전자 분석에 관한국내 보고는 없다

.

따라서

,

^본^연구는

Ilarvirus

그룹에속하는 바이러스중

에 우리나라 복숭아 과원에서 검출된

PNRSV isolate

^의

특성을 조사하고자 초본 및 목본 지표식물을 이용한 생

*Corresponding author

Phone) +82-31-240-3673, Fax) +82-31-240-3709

Email) [email protected]

(2)

물검정과 세포 내 바이러스입자 존재양식을 관찰하였으 며

,

^특이^{프라이머를} ^{디자인하여}

RT-PCR

^에 ^의해^증폭된

국내 분리주 외피단백질 유전자 특성을 확인하여 기 보 고된분리주와의 유전적 상동성을비교함으로써국내 분 리주를 동정하였다

.

재료 및 방법

바이러스 생물검정. 충북 음성지역 등 복숭아 주산단 지의 과수원에 재식되어 있는 ‘유명’ 등 다양한 품종의

성목을 대상으로스위스

BIOREBA

^사의 ^항혈청을 ^이용

하여

ELISA

^{진단법으로} ^바이러스 ^{감염여부를} ^스크리닝

하여

PNRSV

^감염주를^{선발하였다}

. PNRSV

^단독^검출주

로부터 잎과가지 부위를 채취하여초본지표식물 및 목 본지표식물을이용한생물검정에활용하였다

.

^초본^지표

식물 검정에서는

Ilarvirus

의 분리기주로 많이 활용되는

C. sativus

를포함하여

5

^종의^{지표식물을}^{이용하였으며} ^모

자이크증상을 보이는 어린 복숭아 잎을

C. sativus

^의 ^자

엽조직에 즙액 접종한 후 접종엽과 상엽의 병징 발현여 부를관찰하였다

.

^목본^지표식물^검정은^핵과류^바이러스

에대해감수성품종으로보고되어있는

P. persica GF305

품종의 종자를이용하여

Fig. 1

^과 ^같이 ^실생묘를 ^양성한

^{감염주로부터}^채취한 ^녹색^가지의 ^눈 ^부위

를 메스로 잘라 접목하였으며 접종 후

2~3

^개월 ^동안 ^지

표식물 잎의 병징 발현여부를 조사하였다

.

^병징 ^발현이

관찰된 잎은

dip

^검경과

ELISA

^검정을 ^통해

PNRSV

^감

염여부를 확인하였다

.

전자현미경검경. 인위접종한

C. sativus cv. Beakbong

에서 상엽의 모틀

(mottle)

^과 ^{기형증상을} ^보이는 ^잎을 ^전

자현미경검경용시료로 이용하였다

.

^잎^절편을

1~2 mm

²

크기로 잘라서

karnovsky

^{고정액으로} ^고정하고

Spurr's

resin

^으로^블록을^만든^다음^{다이아몬드}^나이프로^자른^초

박절편을

2% uranyl acetate

^와

lead citrate

^로 ^이중^염색하

는방법

(Hayat, 1972)

^을^{이용하였으며}

Carl Zeiss LEO 906 TEM

^으로 ^세포^내 ^바이러스 ^입자를 ^{관찰하였다}

.

RT-PCR 및염기서열분석. 병징을나타내는

C. sativus

상엽을 절취하여

Qiagen RNeasy Plant kit

^를 ^이용

, total

RNA

^를 ^추출하여

PCR

^진단에 ^{사용하였다}

. GenBank

database

^에 ^공개되어 ^있는 ^{염기서열정보와}

RT-PCR

^기술

(Spiegel

^등

, 1996, Hammond

^등

, 1998)

^을 ^참고하여

PNRSV

^{외피단백질} ^{유전자부분을} ^기준으로 ^특이^프라이

머를

Table 1

^과 ^같이 ^{디자인하여}

RT-PCR

^에^{이용하였다}

. RT-PCR

^{증폭조건은}

45

^o

C 45

^분

(1cycle)

^→

94

^o

C 2

^분

(1 cycle)

처리 후

94

^o

C 30

^초→

60

^o

C 1

^분→

68

^o

C 2

^분간

40 cycle

^처

리하였으며 최종적으로

68

^o

C

^에서

7

^분

1 cycle

^처리한 ^후

1% Agarose gel

^상에서 ^{전기영동하여}

ethidium bromide

Fig. 1. Bioassay protocols using P. persica ‘GF305’ woody indicator.

Table 1. Oligonucleotide primers used to amplify the PNRSV coat protein gene

Primers Sequences Product size (bp) PNRSV-P1 ATG GTT TGC CGA ATT TGC AA

PNRSV-P2 CTA GAT CTC AAG CAG GTC TT 675

(3)

로염색하여특이밴드를확인하였다

.

^증폭된 ^유전자의^염

기서열 분석은

ABI Prism 377 Genetic Analyzer

^를 ^이용

,

Bioneer

^사에 ^의뢰하여 ^결과를 ^{획득하였으며}^분석된 ^염기

서열 결과는

DNASTR

^{프로그램을} ^이용하여

Genbank

^에

기 보고된 분리주와의 상동성을 비교하였다

.

결과 및 고찰

충북 음성 등 복숭아 주요 재배과원의 성목을 대상으

로

ELISA

^법으로

PNRSV

^{감염여부를} ^스크리닝 ^한 ^결과

음성지역 농가의 ‘유명’ 품종의 약한 모자이크증상의 잎

에서

PNRSV

^{양성반응이} ^{확인되었다}

.

^모자이크 ^증상을

나타내는 잎을

Table 1

^에서와 ^같이

Chnopodium quinoa

등

5

^종의^초본^{지표식물에} ^접종하여^반응을^조사한 ^결과

, C. quinoa

와

C. amaranticolor

의상엽에

mottle

^병징이 ^각

각 관찰되었으며

C. sativus

의 접종자엽에

ringspot

^와 ^상

엽에

mosaic

^병징이 ^{나타나다가} ^잎이^{기형화되고}^선단부

의 생육이 불량해지면서 고사되는 것을 관찰할 수 있었 다

(Table 2).

^이러한 ^{지표식물의}^반응은

Salem

^등

(2004)

^이

보고한 결과와 일치하였다

.

P. persica GF305

^품종을 ^이용한^{목본지표식물} ^검정에

서는 접종

3

^개월^후부터 ^신엽에

vein banding

^증상이 ^관

찰되었다

(Fig. 2). C. sativus

의 접종엽에 나타난 국부 병

반을 채취하여 재 접종한 다음

2

^차 ^병징이 ^발현된 ^잎의

혈청학적 반응을 조사하기 위해 잎을 절취하여

PNRSV,

Prune dwarf virus (PDV)

^및

Cherry leafroll virus (CLRV)

등 핵과류에 감염 가능한 구형 바이러스

3

^종

(Alan

^등

,

1995)

^의^항혈청에 ^대해

ELISA

^진단한 ^결과

, C. sativus

와

P. persica GF305

^품종^모두

PDV

^와

CLRV

^항혈청에 ^대해

서는반응이 나타나지않은 반면

PNRSV

^에 ^대해서만 ^양

성반응을 보여

PNRSV

^감염에 ^의한 ^병징인 ^것으로 ^확인

할 수 있었다

.

기보고된생물검정에서도

C. sativus

에서자엽에

yellow chlorotic local lesion

^이 ^나타나고

point stunt

^가 ^나타난다

고보고되어 있으며

, C. quinoa

에서

systemic mottle

^증상

이 나타나는 것으로 보고되어 있어

(Fulton, 1970, 1983),

본연구에서 얻은결과와 유사하였다

.

^보통

PNRSV

^의 ^유

지 증식 기주로서

C. sativus

를 사용하는 것으로 보고되

어 있으며

(ICTV DB 00.010.0.02.015)

^본 ^{연구에서도} ^시

험용 바이러스원을

C. sativus

접종주를 활용하였다

. C. sativus

^이병^세포에 ^대한

TEM

^검경에서 ^엽육^조직

세포내에 구형의 바이러스입자가 존재하는 것을관찰할

수 있었으며

Plasmodesmata

^내 ^바이러스 ^입자가 ^존재하

Table 2. Reaction of indicator plants inoculated with PNRSV-Ko Indicator plants Response on leaves

Inoculated Upper Chenopodium quinoa Mo^a Mo Chenopodium amranticolor NS NS Nicotiana glutinosa NS NS Nicotiana tabacum cv. Xanthi NS NS Cucumis sativus RS M, Mf, TN

a

M; mosaic, Mf; malformation, Mo; mottle, NS; no symptoms, RS;

ringspot, TN; Top necrosis.

Fig. 2. Symptoms of PNRSV on peach and indicator plants. (A) mild mosaic on peach, (B) ringspots on C. sativus cotyledons, (C) mosaic and malformation on C. sativus, (D) mosaic with line pattern on P. persica GF305.

Fig. 3. Electron micrographs of C. sativus leaves inoculated mechanically with PNRSV-Ko. Arrows indicate virus particles.

(4)

는형태도 확인할 수있었다

(Fig. 3).

^이는^바이러스 ^입자

형태가 구형인 바이러스 종인

Nepovirus , Comovirus , Fabavirus , Ilarvirus

등이 공통적으로 가지는 세포병리학 적 특성으로 보고되어 있다

(Martelli, 1980).

PNRSV

^{외피단백질}^유전자를 ^{특이적으로} ^{증폭하도록}

디자인한

Table 1

^의^{프라이머를}^이용하여

C. sativus

접종

엽을

RT-PCR

^한 ^결과^약

675bp

^크기의^특이적인 ^증폭산

물을 얻을수 있었다

(Fig. 4).

증폭된 특이산물을 회수하여 염기서열 분석을 수행하

고

NCBI

^에 ^공개된 ^외국의 ^기보고 ^분리주

4

^개와 ^유전적

상동성을 비교한결과약

93.9~94.7%

^의^상동성을^나타내

는것으로확인되었고

(

^자료^생략

),

^이에^대한

phylogenetic tree

^를 ^{작성하였다}

(Fig. 5).

본 논문은

PNRSV

^에 ^대한^국내 ^첫^보고로서 ^생물검정

결과와

RT-PCR

^진단 ^기술은^금후^전국적인 ^발생^모니터

링과 피해구명에 관한 연구의 기반기술로 활용될 수 있 을 것으로 판단된다

.

요 약

국내의 복숭아 과수원 중에 충북 음성지역의 유명 품 종에서 약한 모자이크증상 잎으로부터

Prunus necrotic

ringspot virus (PNRSV)

^를 ^분리 ^{동정하였다}

.

^{지표식물을}

이용한 생물검정에서

Cucumis sativus

의 접종 자엽에 원 형모양의 반점이 관찰되었으며 상엽으로 전이되어 모자 이크와 잎기형 증상을 나타내다가고사하는 것으로 나타 났다

.

^접종한

Chenopodium quinoa

접종엽과상엽에도 모 틀증상을나타내었다

.

^목본^지표식물

Prunus persica GF305

를 활용한 검정에서는 바이러스 감염된 줄기의 눈을 인 위적으로 접종한 지

3

^개월 ^후에 ^잎에 ^라인 ^패턴의 ^모자

이크 증상을 관찰할 수 있었다

.

인위접종한

Cucumis sativus

잎조직의 세포 검경에서

parenchyma cells

^과

plasmodesmata

^내에^존재하는^구형^바

이러스 입자가 관찰되었다

.

PNRSV

^의 ^{외피단백질} ^유전자 ^분석을 ^위해

RT-PCR

^진

단프라이머와조건을 설정하고분석한 결과

675bp

^위치

에서특이적으로증폭된것을확인할 수있었다

.

^또한^증

폭산물을 회수하여염기서열 분석한 결과기보고된

4

^개

의

PNRSV isolate

^와

93.9~94.7%

^의^유전적^상동성을^보였다

.

결론적으로복숭아과수원에서분리한바이러스주의생 물적 특성과 유전자분석결과를 종합하여

Ilarvirus

^에 ^속

하는

PNRSV

^인 ^것으로 ^최종^{동정하였다}

.

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Fig. 4. Agarose gel electrophoretic analysis of cDNA products from RT-PCR of PNRSV-infected C. sativus leaves using PNRSV-CP gene-specific primers.

Fig. 5. Phylogenic tree analysis of the CP gene nucleotide sequences of PNRSV-Ko isolate. PNRSV-ku, Genbank accession No. AY037791; PNRSV-gg, AY037788 ; PNRSV-nt, AY037790 ; PNRSV-yug, AY037789 ; PNRSV-Ko.

(5)

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