Effect of Sunhwangigagambang(SHG) on Hyperlipidemia in SD Rats Induced by High Cholesterol Diet

(1)

․교신저자: 설인찬 대전광역시 중구 대흥동 22-5번지 대전대학교 부속 대전한방병원 심계내과 TEL: 042-229-6805 FAX: 042-254-3403 E-mail: [email protected]

循環器加減方이 고지혈증 유발 白鼠에 미치는 영향

김동현, 임승민, 안정조, 조현경, 유호룡, 김윤식, 설인찬 대전대학교 한의과대학 심계내과학교실

Effect of Sunhwangigagambang (SHG) on Hyperlipidemia in SD Rats Induced by High Cholesterol Diet

Dong-hyun Kim, Seung-min Lim, Jung-jo Ahn, Hyun-kyung Jo, Ho-ryong Yoo, Yoon-sik Kim, In-chan Seol Dept. of Internal Medicine, College of Oriental Medicine, Dae-jeon University

ABSTRACT

Objective :

This study was performed to investigate the effect of Sunhwangigagambang(SHG) on hyperlipidemia in SD rats induced by high cholesterol diet.

Method :

After treatment with SHG, cytotoxicity, body weight, liver weight, AST, ALT, ALP, total cholesterol, LDL-cholesterol, HDL-cholesterol, triglyceride, glucose, albumin, total protein in serum, malondialdehyde, and gene expression for ACAT and HMG-CoA reductase in hepatic tissue were analyzed.

Result :

1. SHG didn't show any cytotoxicity in both human fibroblast cell line and SD rats.

2. SHG significantly inhibited the increase of liver weight by high cholesterol diet compared to the control group.

3. SHG significantly ameliorated the increase of total cholesterol, LDL-cholesterol, and triglyceride and reduction of HDL-cholesterol compared to the control group.

4. SHG significantly reduced glucose level in serum compared to the control group.

5. SHG significantly reduced malondialdehyde in hepatic tissue compared to the control group.

6. SHG significantly down-regulated gene expression of ACAT and HMG-CoA reductase compared to the control group.

Conclusion :

These results suggest that SHG might be effective in treatment and prevention of hyperlipidemia.

Key words : Sunhwangigagambang(SHG), Hyperlipidemia, HMG-CoA reductase, Cholesterol

Ⅰ. 서 론

뇌혈관 질환 및 관상동맥 질환의 공통되는 위험 인자에는 고지혈증, 고혈압, 당뇨, 흡연 등이 있다

1,2

. 이들 중 동맥경화의 위험인자로 잘 알려진 고 지혈증을 관리하는 것이 순환기 질환의 예방에 중

요하다

³

.

고지혈증은 한의학적으로 痰濁, 血瘀의 범주에 속하고, 嗜食肥甘厚味의 外因과, 肝脾腎機能失調의 內因에 의해 痰濕, 瘀血이 生하여 발병한다고 보았 다. 따라서 滋補肝腎, 調理脾胃로 扶正하고, 利濕化痰, 活血化瘀로 祛邪하는 補瀉兼施의 治法을 응용 할 수 있다

⁴

.

최근 降脂通脈飮

⁵

, 雙降湯

⁶

, 加味地黃湯

⁷

등의 고

지혈증 관련 인자에 대한 유효성이 실험적으로 밝

혀지고 있다. 이에 저자는 기존 논문들에서 고지혈

(2)

증에 대한 유효성이 확인 된 豨簽

⁸

, 芍藥

⁹

, 當歸

¹⁰

등의 약재로 구성된 循環器加減方을 이용하여 항 고지혈증 효과를 실험적으로 규명하고자 고콜레스테 롤 식이로 유발된 고지혈증 Sprague-Dawley(SD) rat 에 循環器加減方을 투여 후 aspartate aminotransferase (AST), alanine aminotransferase (ALT), alkaline phosphatase (ALP), 몸무게, 간무게, TC, LDL-C, HDL-C, TG, glucose, albumin, total protein, 간조 직의 과산화지질 함량, 간조직의 acetocoenzyme A acetyltransferase (ACAT) 및 3-hydroxy-3-methylglutaryl -coenzyme A (HMG-CoA) reductase의 mRNA 유 전자 발현 등을 측정하여 유의성 있는 결과를 얻 었기에 보고하는 바이다.

Ⅱ. 실 험

1. 재 료

1) 동물 및 사육조건

본 실험에 사용된 실험용 쥐는 체중 180∼220g 의 웅성 SD rat으로 실험 당일까지 일반 사료와 고콜레스테롤 사료 (Bio-serv, USA)를 자유식이하 면서 식수를 충분히 공급하였다. 실온 22 ± 2℃, 상 대습도 50 ± 10%, 조명시간 12시간 (07:00∼19:00), 조도 150∼300Lux로 설정하여 2주일간 실험실 환 경에 적응시킨 후 체중 변화가 일정하고 건강한 쥐만을 선별하여 실험에 사용하였다.

2) 약 재

본 실험에 사용한 循環器加減方( Sunhwangigagambang , 이하 SHG)의 구성 약물은 대전대학교 부속한방병 원에서 구입하여 정선한 후 사용하였다(Table 1).

Name Herb General Name Amount

豨簽 Siegesbeckiae Herba 12g

白芍藥 Paeoniae Radix 8g

當歸 Angelicae Gigantis Radix 6g

牛膽南星 Arisaematis Rhizoma 3g

半夏 Pinelliae Rhizoma 3g

白朮 Atractylodes Rhizome Alba 3g

白茯笭 Hoelen Alba 3g

天麻 Gastrodiae Rhizoma 3g

川芎 Cnidii Rhizoma 3g

酸棗仁 Zizyphi Spinosi Semen 3g 陳皮 Aurantii Nobilis Pericarpium 3g

黃芩 Scutellariae Radix 3g

熟地黃 Rehmanniae Radix Preparata 3g

防風 Peucedani Radix 3g

桃仁 Persicae Semen 3g

薄荷 Menthae Herba 3g

桂枝 Cinnamomi Ramulus 3g

羌活 Angelicae Koreanae Radix 3g

牛膝 Achyranthis Radix 3.2g

生地黃 Rehmanniae Radix Crudus 3.2g

紅花 Carthami Flos 1.8g

炙甘草 Glycyrrhizae Radix 1.8g

黃柏 Phellodendri Cortex 1.2g 竹瀝 Bambusae Caulis in Liquamen _(10㎖) ^10g

Total Amount 92.2g Table 1. Composition of Sunhwangigagambang (SHG)

3) 시약 및 기기 (1) 시 약

Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS-A;

Sigma Co., U.S.A.), RPMI 1640 (Sigma Co., U.S.A), Collagenase A (BM, U.S.A), DNase type Ⅰ (Sigma.

Co., U.S.A.), Penicillin (Sigma. Co., U.S.A.), Streptomycin

(Sigma. Co., U.S.A.), Deoxycorticosterone Acetate

(DOCA; Sigma., U.S.A), Trypsin (invitrogen., U.S.A),

Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA; Sigma., U.S.A),

3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium

bromide (MTT; Sigma., U.S.A), Dimethyl sulfoxide

(3)

(DMSO; Sowa chemical., Japan), 3.8% Sodium citrate (Sigma Co., U.S.A), Angiotensin converting enzyme (ACE, Sigma Co., U.S.A), Hippuryl-his-leu acetate (Sigma Co., U.S.A), Ethylacrtate(Junsei., Japan), Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4; Yakuri., Japan), Bovine serum albumin (BSA; Sigma, U.S.A) 등을 사용하였고, 이 밖에 일반 시약은 특급 시약 을 사용하였다.

(2) 기 기

본 연구에 사용된 기기는 Accoutered GC (Roche, Germany), Ice-maker (Vision, Korea), Serum separator (녹십자, Korea), Minos-ST (Cobas Co., France), Centrifuge (Beckman Co., U.S.A.), Rotary vaccum evaporator (Büchi 461, Switzerland), Deep freezer (Sanyo Co., Japan), Freeze dryer (Eyela Co., Japan), Autoclave (Hirayama, Japan), Ultrasonic cleaner (Branson Ultrasonics Co., U.S.A.), ELISA reader (Molecular Divice., U.S.A), Roller Mixer (Gowon scientific technology Co., Korea), 한약유출기 (DWP -1800T, 웅진, Korea), Spectrophotometer (UV-2450, Shimazu, Japan), Balance (Cass, korea), 생화학기 기 (AU400, Olimpus, U.S.A) 등을 사용하였다.

2. 방 법 1) 약물 추출

시료 추출 방법은 SHG 2첩을 한약유출기에 넣 고, 증류수 1500㎖와 같이 혼합하여 3시간 열탕하여 추출한 후 흡입 여과하였다. 이를 rotary vacuum evaporator에서 감압 농축하여 분리한 후, 다시 freeze dryer에서 24시간 동결 건조하여 분말 34.5g 을 얻었으며, 얻어진 분말은 초저온냉동고 (-80℃) 에 보관하면서, 실험에 따라 필요한 농도로 증류수 에 희석하여 사용하였다.

2) In vitro (1) 독성 검사

① Human fibroblast cells (hFCs) 배양 피부 조직을 cool DPBS-A로 3회 세척한 후 작

은 조각으로 절단한 다음, conical tube (15㎖)에 넣어 1,400rpm에서 5분간 원심분리 하였다. 이 tube 에 RPMI 1640 {containing collagenase A (5㎎/㎖) 와 DNase type Ⅰ(0.15㎎/㎖), antibiotics (penicillinm 10

⁴

U/㎖, streptomycin 10㎎/㎖, amphote-ricin B 25㎍/㎖)}을 넣고 37℃ CO

2

배양기에서 hFCs를 2 시간 동안 배양하였다. 여기에 0.5% trypsin-0.2%

EDTA를 첨가하여 30분간 배양하고, phosphate buffered saline (PBS)로 약 2회 1,500rpm에서 원심 분리한 후 RPMI 1640-10% FBS로 1주일 동안 배 양하였다. 이를 다시 0.5% trypsin-0.2% EDTA로 분리하여 연속으로 1주일씩 3회 반복하여 살아있 는 부착세포를 RPMI 1640-10% FBS 배양액에서 배양하였다.

② 세포독성 측정

세포독성 측정은 MTT assay로 하였다. 배양한 hFCs를 96 well plate에 2×10

⁴

cell씩 분주한 후 배양 하고, 24시간 후 SHG를 500, 250, 125, 62.5, 31.25 (㎍/㎖)의 농도로 투여하였다. 다시 48시간 동안 배양 후 부유액을 제거하고, 각 well에 MTT solution 100㎕씩 첨가하여 4시간 동안 배양 후 부유액을 제 거하고 각 well에 100㎕의 DMSO를 첨가하여 37℃

CO

2

배양기에서 30분간 반응 시킨 후 ELISA reader 를 사용하여 wave length 540㎚에서 흡광도를 측정 하였다.

③ 간독성 측정

실험 종료 후 혈액을 채취해 혈청을 분리하여 생화학분석기를 이용하여 AST, ALT, ALP를 측정 하였다.

3) In vivo

(1) 고콜레스테롤 사료에 의한 고지혈증 유발 과 약물투여

각 실험군은 정상군, 대조군 그리고 SHG 투여

군으로 나누어 정상군은 일반 사료와 식수를 충분

히 공급하였고, 대조군과 SHG 투여군은 고콜레스

테롤 사료와 식수를 충분히 공급하였다. SHG 투여

군은 고콜레스테롤 사료 투여 2주 후부터 SHG를

(4)

115㎎/㎏/0.5㎖의 양으로 존대를 사용하여 4주간 정해진 시간에 매일 1회 투여하였고 대조군은 동 일한 방법으로 동량의 증류수를 투여하였다.

(2) 몸무게 및 간무게 측정

몸무게는 SHG 투여가 끝나고 sacrifice 직전에 측정하였고, 간무게는 Sacrifice 후 몸의 혈액을 제 거한 후 간을 적출하여 측정하였다.

(3) 채혈 및 혈청 분리

SHG 투여 종료 후 12시간 절식 후 ether로 마취 시킨 다음 심장에서 12㎖ 이상의 혈액을 취하여 5

㎖를 15㎖ conical tube에 넣어 6,500rpm에 15분간 원심분리시켜 혈청을 분리하였다.

(4) 혈청 및 혈장 성분 측정

분리한 혈청은 생화학분석기를 이용하여 TC, LDL-C, HDL-C, TG, glucose 그리고 albumin을 측정하였다.

(5) 간조직의 효소활성 측정

① 효소원 제조

적출한 간은 PBS로 세척하여 수분을 제거하고 1g의 간조직에 10㎖의 0.25M sucrose / 0.5mM EDTA / 5mM N-2-hydroxylethyl-piperazine-N-2-ethane sulfonic acid (HEPES) 용액을 가하여 ultraturax homogenizer를 이용하여 빙냉 하에서 마쇄하였다.

마쇄한 용액을 4℃, 600xg로 15분간 원심분리하여 핵 및 미마쇄 부분을 제거한 후 4℃, 8000xg로 30분 간 원심분리하여 1㎖의 상등액을 thiobarbituric acid reactive substance(TBARS) 함량 측정에 사 용하였다.

② 과산화지질(TBARS) 함량 측정

간조직의 과산화지질 정량은 Sato법을 이용하여 측 정하였다. 제조한 간조직 효소원 0.5㎖에 trichloroacetic acid (TCA) 용액 2.5㎖를 가하여 잘 섞은 다음 실 온에서 10분간 방치한 후 1500xg에서 10분간 원심 분리하여 상등액을 버리고 침전물은 0.05M 황산으 로 1회 세척 후 침전물에 0.05M 황산 2.5㎖와 0.6%

TBA 3.0㎖를 가하여 잘 섞은 후 95℃의 항온 수조에 서 30분간 가열하였다. 가열 후 n-butanol:pyridine

(15:1) 혼합액 3.0㎖를 가하여 잘 섞은 후 1500xg에 서 10분간 원심분리하고 상등액을 취하여 530㎚에 서 흡광도를 측정하였다.

(6) Real Time Quantitative RT-PCR

① RNA 추출

미량의 간조직에 RNAzolB 500㎕를 넣고 homogeniger 로 마쇄한 후 chloroform (CHCl

3

) 50㎕를 첨가한 후 15초간 다시 혼합하였다. 이를 얼음에 15분간 방치한 후 13,000rpm에서 원심분리한 후 약 200㎕

의 상층액을 회수하여 2-propanol 200㎕와 동량 혼 합 후 천천히 흔들고 얼음에서 15분간 방치하였다.

이를 다시 13,000rpm에서 원심분리한 후 80% EtOH 로 수세하고 3분간 vaccum pump에서 건조하여 RNA 를 추출하였다. 추출한 RNA는 diethyl pyrocarbonate (DEPC)를 처리한 20㎕의 증류수에 녹여 heating block 75℃에서 불활성화 시킨 후 first strand cDNA 합성에 사용하였다.

② 역전사-중합효소 연쇄반응

역전사 (reverse transcription) 반응은 준비된 total RNA 3㎍을 DNase I (10U/㎕) 2U/tube를 37℃

heating block에서 30분간 반응한 후 75℃에서 10분 간 변성시키고, 여기에 2.5㎕ 10mM dNTPs mix, 1

㎕ random sequence hexanucleotides (25pmole/25㎕), RNA inhibitor로서 1㎕ RNase inhibitor (20U/㎕), 1㎕

100mM DTT, 4.5㎕ 5×RT buffer (250mM Tris-HCl, pH 8.3, 375mM KCl, 15mM MHCl

2

)를 가한 후, 1

㎕의 M-MLV RT (200U/㎕)를 다시 가하고 DEPC 처리된 증류수로서 최종 부피가 20㎕가 되도록 하 였다.

이 20㎕의 반응 혼합액을 잘 섞은 뒤 2,000rpm 에서 5초간 원심침강하여 37℃ heating block에서 60분간 반응시켜 first-strand cDNA를 합성하였다.

이를 다시 95℃에서 5분간 방치하여 M-MLV RT를 불활성화 시킨 후 합성이 완료된 cDNA를 polymerase chain reaction (PCR)에 사용하였다.

③ Real Time Quantitative RT-PCR

간조직으로부터의 총 RNA는 TRI 시약으로 분

(5)

리하고, DNase I (Life Technologies, Grand Island, NY)로 염색체의 DNA를 제거하기 위해 digested 하였다. 75℃에서 20분 동안 DNase와 5㎍을 넣어 total RAN은 First Strand cDNA Synthesis kit (Amersham Pharmacia, Piscataway, NJ)로 cDNA 로 transcription하였다.

기술된 것에 따라 Real-Time PCR은 Applied (Applied Biosystems, USA)를 사용하면서 수행되

었다. Probes는 6-carboxy-fluorescein으로 라벨을 붙이고, beta-actin cDNA는 모든 cDNA와 같은 양 을 포함한 각 cDAN 표본을 AmpliTaq Gold DNA Polymerase를 포함시켜 TaqMan Universal PCR로 증폭시켰다. PCR 조건은 40cycles를 위한 50℃에서 2분, 95℃에서 10분, 60℃에서 15초 수행하였다. 사 용된 probe는 아래와 같다(Table 2).

ACAT Sense CCTCCCGGTTCATTCTGATA

Antisense ACACCTGGCAAGATGGAGTT HMG-CoA reductase Sense TGCTGCTTTGGCTGTATGT

Antisense TGAGCGTGAACAAGAACCA

y = x(1+e)n, x = starting quantity, y = yield, n = number of cycles,

e = efficiency로 계산하여 RQ (relative quantitative)를 측정하였다.

Table 2. Primer Sequence

4) 통계 처리

본 실험에서 얻은 결과를 ANOVA multi t-test (JAVA, Bonferroni Ver 1.1)로 분석하여 p값을 구 하였다. 각 대조군을 정상군과, 실험군을 대조군과 비교하여 p<0.05일 때 유의성이 있는 것으로 판정 하였다.

Ⅲ. 실험결과

1. 세포독성 평가

hFCs는 대조군 세포생존율이 100.2 ± 1.5 (%), SHG의 500, 250, 125, 62.5, 31.25 (㎍/㎖) 농도에서 세포생존율이 각각 86.7 ± 5.9, 92.6 ± 1.5, 93.7 ± 3.1, 97.2 ± 3.9, 100.4 ± 1.2 (%) 였다(Fig. 1).

Fig. 1. Cytotoxicity of SHG on hFCs.

hFCs were treated with various concentration (500, 250, 125, 62.5, 31.25 ㎍/㎖) of the SHG extract.

2. 간독성 평가 1) AST

AST는 정상군이 118.0 ± 7.0 (I.U/L), 대조군이

206.0 ± 33.1 (I.U/L), SHG 투여군이 145.0 ± 10.8

(I.U/L)로 대조군에 비하여 유의성 있게 (*p<0.05)

감소되었다(Fig. 2).

(6)

Fig. 2. Effect of SHG on the AST in rats fed high cholesterol diets.

Normal : Basal diet group. Control : High cholesterol diet and normal saline (0.5㎖/day) treated group.

SHG : High cholesterol diet and SHG (115㎎

/0.5㎖/day) treated group. The result represents the mean ± S.D (n=6). Statistically significant value compared with normal group (++p<0.01).

Statistically significant value compared with control group (*p<0.05).

2) ALT

ALT는 정상군이 39.7 ± 5.5 (I.U/L), 대조군이 55.3 ± 9.5 (I.U/L), SHG 투여군이 44.0 ± 6.6 (I.U/L) 로 대조군에 비하여 유의성 있게 (*p<0.05) 감소되 었다(Fig. 3).

Fig. 3. Effect of SHG on the ALT in rats fed high cholesterol diets.

SHG : High cholesterol diet and SHG (115㎎/0.5

㎖/day) treated group. The result represents the mean ± S.D (n=6). Statistically significant value compared with normal group (+p<0.05). Statistically significant value compared with control group (*p<0.05).

3) ALP

ALP는 정상군이 178.0 ± 10.6 (I.U/L), 대조군이 235.7 ± 35.7 (I.U/L), SHG 투여군이 175.7 ± 8.5 (I.U/L)로 대조군에 비하여 유의성 있게 (*p<0.05) 감소되었다(Fig. 4).

Fig. 4. Effect of SHG on the ALP in rats fed high cholesterol diets.

㎖/day) treated group. The result represents the mean ± S.D (n=6).. Statistically significant value compared with normal group (+p<0.05). Statistically significant value compared with control group (*p<0.05).

3. 몸무게 및 간무게에 미치는 영향 1) 몸무게에 미치는 영향

몸무게는 정상군이 406.0 ± 36.2 (g), 대조군이 452.0

± 20.5 (g), SHG 투여군이 436.1 ± 32.7 (g)로 대조 군에 비하여 감소하였으나 유의성은 없었다.

2) 간무게에 미치는 영향

간무게는 정상군이 14.3 ± 0.4 (g), 대조군이 25.2

± 0.4 (g), SHG 투여군이 17.8 ± 3.7 (g)로 대조군 에 비하여 유의성 있게 (*p<0.05) 감소되었다(Fig.

5).

(7)

Fig. 5. Effect of SHG on the liver weight in rats fed high cholesterol diets.

4. Total cholesterol에 미치는 영향

TC는 정상군이 55.0 ± 4.4 (㎎/㎗), 대조군이 271.0 ± 28.0 (㎎/㎗), SHG 투여군이 120.3 ± 22.8 (㎎/㎗)로 대조군에 비하여 유의성 있게 (**p<0.01) 감소되었다(Fig. 6).

Fig. 6. Effect of SHG on the TC level in rats fed high cholesterol diets.

㎖/day) treated group. The result represents the mean ± S.D (n=6). Statistically significant value compared with normal group (+++p<0.001). Statistically significant value compared with control group (**p<0.01).

5. LDL cholesterol에 미치는 영향

LDL-C는 정상군이 6.7 ± 1.5 (㎎/㎗), 대조군이 43.0 ± 7.5 (㎎/㎗), SHG 투여군이 20.7 ± 3.1 (㎎/㎗) 로 대조군에 비하여 유의성 있게 (**p<0.01) 감소 되었다(Fig. 7).

Fig. 7. Effect of SHG on the LDL-C level in rats fed high cholesterol diets.

㎖/day) treated group. The result represents the mean ± S.D (n=6). Statistically significant value compared with normal group (++p<0.01). Statistically significant value compared with control group (**p<0.01).

6. HDL cholesterol에 미치는 영향

HDL-C는 정상군이 16.3 ± 1.2 (㎎/㎗), 대조군 이 5.7 ± 1.5 (㎎/㎗), SHG 투여군이 9.7 ± 2.5 (㎎/㎗) 로 대조군에 비하여 유의성 있게 (*p<0.05) 증가되 었다(Fig. 8).

7. Triglyceride에 미치는 영향

TG는 정상군이 50.7 ± 11.5 (㎎/㎗), 대조군이

137.0 ± 25.2 (㎎/㎗), SHG 투여군이 79.3 ± 30.0

(㎎/㎗)로 대조군에 비하여 유의성 있게 (*p<0.05)

감소되었다(Fig. 9).

(8)

Fig. 8. Effect of SHG on the HDL-C level in rats fed high cholesterol diets.

㎖/day) treated group. The result represents the mean ± S.D (n=6). Statistically significant value compared with normal group (++p<0.01). Statistically significant value compared with control group (*p<0.05).

Fig. 9. Effect of SHG on the TG level in rats fed high cholesterol diets.

8. Glucose에 미치는 영향

Glucose는 정상군이 112.3 ± 36.1 (㎎/㎗), 대조군 이 265.0 ± 28.5 (㎎/㎗), SHG 투여군이 163.3 ± 10.7 (㎎/㎗)로 대조군에 비하여 유의성 있게 (**p<0.01) 감

소되었다(Fig. 10).

Fig. 10. Effect of SHG on the glucose level in rats fed high cholesterol diets.

㎖/day) treated group. The result represents the mean ± S.D (n=6). Statistically significant value compared with normal group (++p<0.01).

Statistically significant value compared with control group (**p<0.01).

9. Albumin에 미치는 영향

Albumin은 정상군이 3.9 ± 0.1 (g/㎗), 대조군이 4.6 ± 0.2 (g/㎗), SHG 투여군이 4.5 ± 0.3 (g/㎗) 로 대조군에 비하여 감소하였으나 유의성은 없었 다.

10. Total protein에 미치는 영향

Total protein은 정상군이 6.2 ± 0.1 (g/㎗), 대조 군이 7.6 ± 0.3 (g/㎗), SHG 투여군이 7.5 ± 0.6 (g/㎗)로 대조군에 비하여 감소하였으나 유의성은 없었다.

11. 간조직의 과산화지질에 미치는 영향

간조직의 과산화지질 함량은 정상군이 3.4 ± 0.6

(nmol/㎎), 대조군이 19.8 ± 1.4 (nmol/㎎), SHG

투여군이 12.4 ± 2.5 (nmol/㎎)로 대조군에 비하여

유의성 있게 (*p<0.05) 감소되었다(Fig. 11).

(9)

Fig. 11. Effect of SHG on hepatic TBARS value in rats fed high cholesterol diets.

㎖/day) treated group. The result represents the mean ± S.D (n=6). Statistically significant value compared with normal group (+++p<0.001).

12. 간조직의 콜레스테롤 인자에 미치는 영향 1) ACAT에 미치는 영향

간조직의 ACAT mRNA 유전자 발현은 대조군 의 유전자 발현을 1 (RQ)로 했을 때 정상군이 0.18

± 0.1 (RQ), SHG 투여군이 0.6 ± 0.1 (RQ)로 대 조군에 비하여 유의성 있게 (**p<0.01) 감소되었다 (Fig. 12).

Fig. 12. Effects of SHG on the gene expression level of ACAT in hepatic tissue of rats fed high cholesterol diets.

2) HMG-CoA reductase에 미치는 영향 간조직의 HMG-CoA reductase mRNA 유전자 발현은 대조군의 유전자 발현을 1 (RQ)로 했을 때 정상군이 0.36 ± 0.03 (RQ), SHG 투여군이 0.55 ± 0.08 (RQ)로 대조군에 비하여 유의성 있게 (**p<0.01) 감소되었다(Fig. 13).

Fig. 13. Effects of SHG on the gene expression level of HMG-CoA reductase in hepatic tissue of rats fed high cholesterol diets.

Ⅳ. 고 찰

지질 중 cholesterol은 세포막의 구성 성분이며

스테로이드 호르몬과 담즙산의 전구체이고, TG는

인체 에너지원으로 사용되지만 혈중 지질농도의

이상은 동맥경화의 위험인자로 작용한다. 동맥경화

가 뇌동맥에 발생하면 뇌 혈전증을, 심장에 발생하

(10)

면 허혈성 심장 질환으로 인한 급사, 협심증, 심근 경색, 심부전 등을, 신장에 발생하면 신부전을, 하 지 말초동맥에 발생하면 간헐성 파행, 괴저 등을 각각 일으킨다

^3,11

.

LDL-C의 증가가 관상동맥질환의 발생과 직접 적인 연관이 있다는 것은 동물 실험, 실험실 연구, 역학 조사 및 치료적 연구 등을 통해 이미 알려진 사실이며, LDL-C를 낮추면 관상동맥 질환의 발생 의 위험이 낮아짐이 밝혀졌다. 따라서 고지혈증 치 료의 일차목표는 상승한 LDL-C를 조절하는 것이 다

¹²

.

HDL-C는 cholesterol 역수송을 통해 관상동맥 질환의 보호인자로 작용한다. 또한 Lipid Research Clinics Prevalence Study에 의하면 HDL-C는 다른 위험 인자들을 보정한 후 심혈관 질환에 의한 사 망을 가장 잘 예측하는 지표라고 하였다

^13,14

.

Hypertriglyceridemia는 심혈관 질환을 일으키는 독립적인 위험인자는 아니라고 인식되어 왔지만, 최근에는 hypertriglyceridemia가 심혈관 질환을 일으 키는 독립적인 위험인자라고 보는 견해도 있다

^15,16

.

Albumin은 혈중 FFA와 결합하여 FFA를 골격 근, 심장, 신피질 등의 조직으로 운반한다. 따라서 혈중에 albumin이 많으면 보다 많은 FFA가 에너 지로 사용되며 이렇게 유입된 FFA는 다시 카르니 틴에 의해 지방 대사를 촉진시킨다. 또한 albumin 은 white blood cells (WBC), C-reactive protein (CRP) 그리고 fibrinogen 등과 함께 혈관 급성 염 증인자들로서 혈관의 염증 진행에 관여하여 관상 동맥 질환을 발병시킨다

^17,18

.

소장에서 음식이나 담즙산으로부터 free cholesterol 을 흡수하는데, free cholesterol은 ACAT에 의해 세 포내 저장 형태인 cholesterol ester로 된다. Cholesterol ester는 다른 지질들과 결합하여 CM이 된다. 또한 내인성으로 간에서 합성되는 cholesterol의 대사과 정에서 두 분자의 Acetyl-coenzyme A가 간에 존재 하는 HMG-CoA reductase 및 여러 효소에 의해 매개되어 여러 단계의 과정을 거쳐 free cholesterol

로 생합성 된다

^19,20

. 따라서 ACAT 및 HMG-CoA reductase가 억제되면 cholesterol 생성이 억제된다.

고지혈증은 혈중에 cholesterol이 높은 hypercholesterolemia, 혈중에 TG가 상승되어 있는 hypertriglyceridemia, 그리고 cholesterol과 TG가 모두 상승되어 있는 combined hyperlipidemia 등을 포함하는 개념이며, 임상양상은 LDL-C가 매우 높을 경우에 아킬레스 건, 무릎, 손등 등에 근황색종이 생기고 TG가 1000 이상 높을 경우에 체간과 사지에 발진성 황색종 및 췌장염이 발생하고 2000이상 높을 경우에 망막 지혈 등이 생기는 것 이외에는 특별한 증상이 없 다

¹¹

.

치료는 개개인의 위험도를 평가해 위험도에 따 라 세 가지 중 한 가지 치료전략을 적용하는 것을 권하고 있다. 흡연, 고혈압, 낮은 HDL-C 농도, 당 뇨, 심혈관 질환의 가족력, 나이, 생활 위험인자, 최 근의 위험인자 등 중에서 두 가지 미만의 위험인 자를 가진 경우에는 LDL-C를 160㎎/㎗ 미만으로 유지하는 것을 목표로 하는 낮은 단계의 치료를 한다. 두 가지 이상의 위험인자를 가진 환자 중 10 년 위험도가 20% 이하인 경우에는 LDL-C를 130

㎎/㎗ 미만으로 유지하는 것을 목표로 하는 중간 단계의 치료를 한다. 10년 위험도가 20%를 초과하 거나, 동맥경화 또는 당뇨의 증거가 있는 경우에는 LDL-C를 100㎎/㎗ 미만으로 유지하는 것을 목표 로 하는 높은 단계의 치료를 한다. 치료 목표를 달 성하기 위해서 먼저 식이요법과 운동을 포함하는 생활습관의 개선을 권장하지만 위험 그룹은 LDL-C 가 목표치를 30㎎/㎗ 이상 넘으면 약물치료를 권 장한다

^3,21

.

고지혈증은 한의학적으로 痰飮 및 瘀血의 범주

에 속한다. 肥甘한 음식을 많이 섭취하거나 臟腑의

기능실조로 津液의 수송, 이용, 배설기능이 저하되

면 痰飮이 생기고

²²

, 氣滯로 혈액이 不行하면 瘀血

이 생긴다

²³

. 痰飮 및 瘀血의 점조한 성질 때문에

氣血운행에 장애가 되는 것이 고지혈증으로 인해

동맥경화가 생겨 혈액순환 장애를 일으키는 것과

(11)

유사하다

²⁴

. 血中에 痰濁, 瘀血 등이 발생한 것이므 로 標實의 병태이지만 肝, 脾, 腎 등 내부 臟腑의 失調에 의한 것이므로 本虛의 병태이기도 하다. 따 라서 滋補肝腎, 調理脾胃로 扶正하고, 利濕化痰, 活血化瘀로 祛邪하는 補瀉兼施의 治法을 응용할 수 있다

⁴

.

SHG는 대전대학교 부속한방병원에서 고지혈증 에 임상적으로 다용하는 처방에 몇 가지 약재를 가감한 것으로 祛風濕, 通經絡하며 혈관이완을 통 해 혈관보호 효과가 있는 豨簽

^8,25

과 養血柔肝, 補脾胃하며 혈관수축을 억제하는 白芍藥

^25,26

, 補血和血 하며 동맥경화 억제 효과가 있는 當歸

^25,27

를 중용하 고 牛膽南星, 半夏, 竹瀝, 白茯笭 등으로 利濕化痰 하고, 川芎, 桃仁, 紅花, 牛膝 등으로 活血化瘀하고, 白芍藥, 白朮, 熟地黃 등으로 肝脾腎을 補할 수 있 도록 구성한 처방이다

²⁸

. 저자는 한방 고지혈증 치 료제를 제형화하기 위한 초석으로 SHG를 이용하 여 동물실험을 실행하였다.

hFCs는 SHG의 500, 250, 125, 62.5, 31.25 (㎍/

㎖) 농도에서 세포생존율이 각각 86.7 ± 5.9, 92.6 ± 1.5, 93.7 ± 3.1, 97.2 ± 3.9, 100.4 ± 1.2 (%) 였다 (Fig. 1). SHG로 인한 간세포의 파괴 및 담즙정체 등을 평가하기 위해 AST, ALT, ALP를 측정하였 다. AST, ALT, ALP 모두 대조군에 비하여 유의성 있게 (p<0.05) 감소되었다(Fig. 2, Fig. 3, Fig. 4).

SHG를 4주간 투여한 후 몸무게는 대조군에 비 하여 감소하였으나 유의성은 없었다. 간무게는 대 조군에 비하여 유의성 있게(p<0.05) 감소되어(Fig.

5) 고지혈증으로 인한 간의 지방 축적에 대해 억제 작용이 있으리라 사료된다.

SHG가 혈청 내 지질에 미치는 영향을 평가하였 다. TC 및 LDL-C, TG는 대조군에 비하여 유의성 있게 감소되었다(Fig. 6, Fig. 7, Fig. 9). HDL-C는 대조군에 비하여 유의성 있게(p<0.05) 증가되었다 (Fig. 8).

SHG가 고지혈증과 유관한 인자들에 미치는 영 향을 평가하였다. Glucose는 대조군에 비하여 유의

성 있게(p<0.01) 감소되었다(Fig. 10). Albumin과 total protein은 대조군에 비하여 감소하였으나 유 의성은 없었다.

고혈당 상태에서는 VLDL-C의 산화가 증가하여 체내에 과다한 농도로 과산화지질이 존재한다. 고 농도의 과산화지질은 중대한 산화 스트레스로 작 용하여 호중구의 기능을 저하시키고, 혈관 내피세 포 괴사 및 혈관 투과성 증가 등의 장애를 초래하 여 동맥경화를 일으키는 위험인자가 된다

^29,30

. 간조 직의 과산화지질 함량은 대조군에 비하여 유의성 있게(p<0.05) 감소되었다(Fig. 11).

Cholesterol 합성에 대해 알아보기 위해 간조직의 ACAT 및 HMG-CoA reductase의 mRNA 유전자 발현을 측정하였다. ACAT mRNA 및 HMG-CoA reductase의 mRNA 유전자 발현이 모두 대조군에 비하여 유의성 있게 (p<0.01) 감소되었다(Fig. 12, Fig. 13).

이상의 결과를 종합해보면 SHG는 hFCs에 대해 세포독성이 없고 고지혈증 유발 SD rat에 대해 간 독성이 없어 안전성을 확보 할 수 있었을 뿐만 아 니라 AST, ALT, ALP 등의 수치 감소와 간무게의 감소에도 유의성 있는 효과를 보여 고콜레스테롤 식이로 인한 간손상의 억제에 도움이 될 것으로 사료된다.

또한 SHG는 혈청 내 TC, LDL-C, TG, glucose를 유의성 있게 감소시키며 HDL-C를 유의성 있게 증 가시키고, 간조직의 과산화지질 함량 및 cholesterol 발현에 영향을 미치는 ACAT 와 HMG-CoA reductase 의 mRNA 유전자 발현을 유의성 있게 감소시키므 로 고지혈증에 유용하리라 사료된다.

Ⅴ. 결 론

SHG의 고지혈증 인자에 미치는 영향을 실험적

으로 규명하고자 고지혈증 유발 동물병태모델을

통해 세포독성, AST, ALT, ALP, 몸무게, 간무게,

TC LDL-C, HDL-C, TG, glucose, albumin, total

(12)

protein, 간조직의 과산화지질, 간조직에서의 ACAT 및 HMG-CoA reductase의 mRNA를 측정하여 다 음과 같은 결론을 얻었다.

1. SHG는 hFCs에 대한 세포독성 및 고지혈증 유 발 SD rat에 간독성이 없었다.

2. SHG는 고지혈증 유발 SD rat의 간무게를 유의 성 있게 감소시켰다.

3. SHG는 TC 및 LDL-C, TG를 유의성 있게 감소 시켰고, HDL-C를 유의성 있게 증가시켰다.

4. SHG는 glucose를 유의성 있게 감소시켰다.

5. SHG는 간조직의 과산화지질을 유의성 있게 감 소시켰다.

6. SHG는 ACAT와 HMG-CoA reductase의 mRNA 발현을 유의성 있게 감소시켰다.

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