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2019년 8월 석사학위논문

증자쌀, 쌀코지, 증자콩 및 콩코지가 고지방식이로 비만유도 된 흰쥐의 항비만 및 지질대사에 미치는 영향

조선대학교 대학원

식품영양학과

박 시 훈

증자쌀, 쌀코지, 증자콩 및 콩코지가 고지방식이로 비만유도 된 흰쥐의 항비만 및 지질대사에 미치는 영향

Effects of steamed rice, rice koji, steamed soybean and soybean koji on anti-obesity and lipid metabolism in a

high-fat diet-induced obese rats.

2019년 8월 23일

조선대학교 대학원

식품영양학과

박 시 훈

증자쌀, 쌀코지, 증자콩 및 콩코지가 고지방식이로 비만유도 된 흰쥐의 항비만 및 지질대사에 미치는 영향

지도교수 이 재 준

이 논문을 이학 석사학위신청 논문으로 제출함

2019년 4월

조선대학교 대학원

식품영양학과

박 시 훈

박시훈의 석사학위 논문을 인준함

위원장 조 선 대 학 교 교 수 김 복 희 (인)

위 원 조 선 대 학 교 교 수 이 주 민 (인)

위 원 조 선 대 학 교 교 수 이 재 준 (인)

2019년 5월

조선대학교 대학원

목 차

LIST OF TABLES ··· iv

LIST OF FIGURES ··· v

ABSTRACT ··· viii

제1장 서 론 ··· 1

제2장 실험의 재료 및 방법 ··· 5

제1절 실험재료 ··· 5

제2절 이화학적 성분 ··· 5

1. 이화학적 성분분석··· 5

가. 일반성분 분석 ··· 5

나. 유리 아미노산 분석 ··· 6

다. 지방산 분석 ··· 7

라. UPLC-LTQ-IT-MS/MS 분석 ··· 8

2. 실험기기··· 9

가. 실험기기 ··· 9

제3절 In vivo에서 지질대사 개선 및 비만 억제효능 ··· 10

1. 실험동물의 사육 및 식이 ··· 10

2. 실험동물의 처리 ··· 13

4. 혈청 지질 함량 측정 ··· 13

5. 혈청 렙틴 함량 측정 ··· 14

6. 간 조직의 지질 함량 측정 ··· 14

7. 지방조직의 지질 함량 측정 ··· 14

8. 간 조직의 병리조직학적 측정 ··· 15

9. 지방세포의 크기 측정 ··· 15

10. Reverse transcription-polymerase chain reaction ··· 16

11. 통계처리 ··· 18

제3장 실험결과 및 고찰 ··· 19

제1절 이화학적 성분 ··· 19

1. 이화학적 성분분석 ··· 19

가. 일반성분 ··· 19

나. 유리 아미노산 ··· 21

다. 지방산 ··· 23

라. 2차 대사산물 ··· 25

제2절 In vivo에서 지질대사 개선 효과 ··· 29

1. 체중증가량, 식이섭취량 및 식이효율 ··· 29

2. 간 및 지방조직의 무게 ··· 31

3. 혈청 중 ALT, AST, ALP 및 LDH 활성 ··· 36

4. 혈청 중 중성지방 및 총콜레스테롤 함량 ··· 42

5. 혈청 중 HDL-콜레스테롤, LDL-콜레스테롤 함량, 동맥경화지수 및 심혈 관위험지수 ··· 44

6. 혈청 중 렙틴 함량 ··· 50

7. 간 조직 중 총 지질, 중성지방 및 총 콜레스테롤 함량 ··· 52

8. 지방조직 중 총 지질, 중성지방 및 총 콜레스테롤 함량 ··· 57

9. 간 조직의 병리조직학적 변화 ··· 65

11. 지질대사 관련 mRNA 발현 수준 ··· 69

제4장 요 약 ··· 74

참 고 문 헌 ··· 78

LIST OF TABLES

Table 1. Operating conditions of amino acid auto-analyzer ··· 6

Table 2. Operating conditions of gas chromatography for fatty acids ··· 7

Table 3. Experimental design ··· 11

Table 4. Composition of experimental diet ··· 12

Table 5. Sequences of primers used for reverse transcription-polymerase chain reaction ··· 17

Table 6. Proximate compositions of steamed rice, rice koji, steamed soybean and soybean koji ··· 20

Table 7. Contents of free amino acids of steamed rice, rice koji, steamed soybean and soybean koji ··· 22

Table 8. Compositions of fatty acids in steamed rice, rice koji, steamed soybean and soybean koji ··· 24

Table 9. Relative contents of targeted secondary metabolites in steamed rice, rice koji, steamed soybean and soybean koji ··· 27

Table 10. Changes in body weight gain, food intake and food efficiency ratio of rats fed the experimental diets ··· 30

Table 11. Weights of epididymal, mesenteric, retroperitoneal and perirenal adipose tissues in rats fed the experimental diets ··· 34

LIST OF FIGURES

Fig. 1. Manufacturing method of traditional gochujang and commercial gochujang ··· 3 Fig. 2. Liver index of rats fed a high-fat diet containing steamed rice, rice koji, steamed soybean and soybean koji for 8 weeks ··· 33 Fig. 3. Total adipose tissue weight of rats fed a high-fat diet containing steamed rice, rice koji, steamed soybean and soybean koji for 8 weeks ··· 35 Fig. 4. Serum activity of alanine aminotransferase (ALT) in the rats fed a

high-fat diet containing steamed rice, rice koji, steamed soybean and soybean koji for 8weeks ··· 38 Fig. 5. Serum activity of asparate aminotransferase (AST) in the rats fed a high-fat diet containing steamed rice, rice koji, steamed soybean and soybean koji for 8 weeks ··· 39 Fig. 6. Serum activity of alkaline phosphatase (ALP) in the rats fed a high-fat diet containing steamed rice, rice koji, steamed soybean and soybean koji for 8 weeks ··· 40 Fig. 7. Serum activity of lactate dehydrogenase (LDH) in the rats fed a high-fat diet containing steamed rice, rice koji, steamed soybean and soybean koji for 8 weeks ··· 41 Fig. 8. Contents of triglyceride and total cholesterol in the rats fed a high-fat diet containing steamed rice, rice koji, steamed soybean and soybean koji for 8 weeks ··· 43 Fig. 9. Contents of HDL-cholesterol in the rats fed a high-fat diet containing steamed rice, rice koji, steamed soybean and soybean koji for 8 weeks ··· 46

containing steamed rice, rice koji, steamed soybean and soybean koji for 8 weeks ··· 47 Fig. 11. Atherogenic index of rats fed hig fat cholesterol diet containing steamed rice, rice koji, steamed soybean and soybean koji for 8 weeks ··· 48 Fig. 12. Cardiac risk fact of rats fed high fat diet containing steamed rice, rice koji, steamed soybean and soybean koji for 8 weeks ··· 49 Fig. 13. Contents of serum leptin in the rats fed a high-fat diet containing steamed rice, rice koji, steamed soybean and soybean koji for 8 weeks ··· 51 Fig. 14. Content of total lipid in the liver of rats fed a high-fat diet containing steamed rice, rice koji, steamed soybean and soybean koji for 8 weeks ··· 54 Fig. 15. Contents of triglyceride in the liver of rats fed a high-fat diet containing steamed rice, rice koji, steamed soybean and soybean koji for 8 weeks ··· 55 Fig. 16. Contents of total cholesterol in the liver of rats fed a high-fat diet containing steamed rice, rice koji, steamed soybean and soybean koji for 8 weeks ··· 56 Fig. 17. Contents of total lipid in the epididymal adipose of rats fed a high-fat diet containing steamed rice, rice koji, steamed soybean and soybean koji for 8 weeks ··· 59 Fig. 18. Contents of total lipid in the mesenteric adipose of rats fed a high-fat diet containing steamed rice, rice koji, steamed soybean and soybean koji for 8 weeks ··· 60 Fig. 19. Contents of triglyceride in the epidydimal adipose of rats fed a high-fat diet containing steamed rice, rice koji, steamed soybean and soybean koji for 8 weeks ··· 61

high-fat diet containing steamed rice, rice koji, steamed soybean and soybean koji for 8 weeks ··· 62 Fig. 21. Contents of total cholesterol in the epididymal adipose of rats fed a high-fat diet containing steamed rice, rice koji, steamed soybean and soybean koji for 8 weeks ··· 63 Fig. 22. Contents of total cholesterol in the mesenteric adipose of rats fed a high-fat diet containing steamed rice, rice koji, steamed soybean and soybean koji for 8 weeks ··· 64 Fig. 23. Hepatic representative anatomical views (A) and histological analysis (B) in rats fed a high-fat diet containing steamed rice, rice koji, steamed soybean and soybean koji for 8 week ··· 66 Fig. 24. Histological analysis on epididymal adipose tissue ··· 68 Fig. 25. The changes of acetyl-CoA carboxylase (ACC) gene expressions in liver ···71 Fig. 26. The changes of fatty acid synthase (FAS) gene expressions in liver ··· 72 Fig. 27. The changes of glucose-6-phosphate-dehydrogenase (G6PDH) gene expressions in liver ··· 73

ABSTRACT

Effects of steamed rice, rice koji, steamed soybean and soybean koji on anti-obesity and lipid metabolism in a

high-fat diet-induced obese rats.

by. Park, Si-Hoon

Advisor : Prof. Lee, Jae-Joon, Ph.D.

Department of Food and Nutrition, Graduate School of Chosun University

Recently, the westernized diet has increased the intake of animal fat, and the prevalence of metabolic diseases such as obesity, arteriosclerosis and hypertension is increasing due to over nutrition and nutritional imbalance.

Especially obesity is becoming a major social problem by causing various diseases.

In this study, it was carried out to investigate the effects of gochujang raw materials, such as steamed rice, rice koji, steamed soybean and soybean koji, on anti-obesity and lipid metabolism in rats fed a high-fat diet for 8 weeks. It was also conducted to investigate major nutrients component secondary metabolites of steamed rice, rice koji, steamed soybean and soybean koji. The crude fat, crude protein, ash, and dietary fiber contents were higher in steamed soybean and soybean koji than in steamed rice and rice koji. However, the carbohydrate was higher in steamed rice and rice koji than in steamed soybean and soybean koji. The contents of total amino acids and essential amino acids

steamed rice and rice koji. The contents of monounsaturated fatty acid contents such as palmitoleic acid and oleic acid were high in steamed rice and rice koji, whereas the contents of polyunsaturated fatty acids such as linoleic acid and linolenic acid were high in steamed soybean and soybean koji. Analysing result of secondary metabolite, flavonoid compounds including apigenin-C-glucosyl-C-carabinoside, chrysoeriol-hexoside, chrysoeriol-rutinoside, tricin-7-O-rutinoside, tricin-O-glucoside and tricin were detected in steamed rice and rice koji, whereas kaempferol was only detected in steamed soybean and soybean koji. However, the isoflavone compounds such as daidzein, glycitein, genistin, and genistein; soyasaponines including soyasaponin Ⅰ-Ⅴ were only detected in steamed soybean and soybean koji. Lysophosphatidyl compounds were significantly higher in steamed rice and rice koji compared with steamed soybean and soybean koji. In the in vivo study, the anti-obesity effects of steamed rice, rice koji, steamed soybean and soybean koji were investigated in rat fed a high-fat diet. Experimental groups were normal diet group (ND), high fat diet group (HFD), high fat diet with steamed rice group (HFD-R), high fat diet with rice koji (HFD-RK), high fat diet with steamed soybean (HFD-S), and high fat diet with soybean koji (HFD-SK). The body weight gain and FER were increased due to a high fat diet, but decreased in the group that consumed gochujang raw material groups (steamed rice, rice koji, steamed soybean and soybean koji) compared with the HFD group. Liver, epidydimal, mesenteric, retroperitoneal, perirenal and total adipose tissues weights of HFD group were more heavier than that of ND group, whereas those of groups administered gochujang raw material groups were decreased.

The serum ALT, AST, ALP and LDH activities were significantly decreased in the gochujang raw materials groups compared with the HFD group. Levels of serum triglyceride (TG), total cholesterol (TC), LDL-cholesterol, atherogenic index, cardiac risk factor and leptin were decreased in gochujang raw materials groups compared with HFD group, and HDL-cholesterol levels was increased in

decreased after the supplementation of gochujang raw meterial, compared to those in the HFD group. High fat diet induce to accumulation of lipid in liver and increase of adipocyte size, but administration of gochujang raw meterial groups were inhibited. Furthermore, the mRNA expression of ACC, FAS, G6PDH in gochujang raw meterial administered groups in liver were downregulated campared with HFD group.

In gochujang raw materials, the antiobesity and hypolipidemic effects are mediated by high levels of secondary metabolites including flavonoides, insofalvone, soysaponine, and lysophophatidylcholine. Soybena koji was most effective in terms of antiobsity and li[id-lowering effects, compared the other tested gochujang raw materials. These results suggest that gochujang raw materials inhibiting lipogenesis and lipid accumulation, and was considered good effects on obesity and lipid metabolism of liver, serum and adipose tissue.

제1장 서 론

최근 생활수준 및 소득수준의 향상됨에 따른 식생활의 다양화, 편리화로 인해 곡류와 채소 위주의 식생활에서 고지방, 고칼로리 위주의 서구화된 식품섭취가 증 가하였다. 이에 동물성지방 섭취가 증가하여 영양과잉 및 영양불균형이 초래되어 비만, 동맥경화증, 고혈압 및 당뇨병 등 다양한 대사성질환의 유병률이 크게 늘고 있는 추세이다.

비만은 비정상적으로 체지방이 과다하게 증가된 상태를 말한다. 이러한 비만은 지방대사와 당대사간의 불균형을 일으켜 여러 대사성질환의 원인이 된다고 알려져 있다(1). 전 세계적으로 1975년 이후 비만인구는 3배 증가하였고, 2016년에는 18세 이상 성인의 39%가 과체중이었고, 이들 중 약 3분의 1은 비만인 것으로 조사되었 다(2). 비만은 성인뿐만 아니라 소아 및 청소년에서도 꾸준하게 증가하고 있어 전 연령대에서 심각성이 더해지고 있다(3). 이에 세계보건기구(World Health Organization, WHO)는 비만을 단순히 건강을 해치는 위험인자가 아닌 치료해야 할 질병으로 규정하여 ‘전 세계적인 유행성 전염병’이라 칭하였다. 우리나라의 경 우 2016년 국민건강영양조사에 따르면 만 19세 이상 성인의 34.8%가 비만으로 조 사되었으며(4), 비만 유병률이 꾸준히 증가하고 있어 대한보건협회 등에서도 비만 을 만성질병으로 규정하여 대책을 강구하고 있는 실정이다. 비만은 에너지 과잉섭 취 및 운동부족으로 인한 에너지 소비량의 감소의 결과로 체중이 증가하며 체내에 지방이 다량 축적되는 외인성 비만과(5), 갑상선 기능 저하, 부신피질 기능 항진, 약물 및 유전적 요인에 의해 발생하는 내인성 비만으로 구분된다(6). 비만은 그 자 체로서도 신체건강에 악영향을 미치는 질병일 뿐만 아니라 고혈압, 고지혈증과 같 은 심혈관계질환(7), 유방암, 대장암 등의 다양한 암(8), 그리고 수면장애, 우울증 등의 정신적 질환을 발생시키는 요인이 된다고 보고되어 있다(9). 이와 같이 다양 한 질환의 요인이 되는 비만의 발병이 성인뿐 아니라 전 연령에서 증가하고 있어 심각한 사회적 문제를 야기할 수 있어 사회적 문제로 대두되고 있다. 비만을 해결 하기 위해서는 식사 및 약물요법, 운동과 수술, 생활습관 등 다양한 차원의 접근이 필요하다(10).

발효식품은 미생물의 발효작용으로 성분이 분해되거나 새로운 성분이 합성되어 독특한 풍미를 갖게 된다. 한국은 다른 나라보다 많은 종류의 발효식품을 전통적 으로 만들어 왔으며, 소비량도 매우 높다. 특히, 콩과 곡류를 이용한 발효식품인 청국장, 된장, 고추장, 간장 등이 있으며, 이들 발효식품들은 대부분 음식에 간을 할 때 가장 기본으로 사용하는 조미료들이다. 그 중 고추장은 고춧가루, 쌀가루, 메주가루(발효 콩) 및 코지를 혼합하여 발효시킨 한국의 전통 발효식품으로 캡사 이신으로부터 유래된 매운맛, 전분이 분해되면서 생성되는 당 성분에 의한 단맛 및 독특한 질감 등 고유한 특성을 가지고 있다(11). 고추장은 여러 기능성물질을 함유한 콩으로 만든 메주와 쌀을 기본 원료로 제조함으로써 항암효과, 항동맥 기 능 등이 있으며(12), 특히 고추장의 원료인 고추에 들어있는 매운 맛 성분인 캡사 이신이 지방세포를 분해하여 에너지로 사용하므로, 지방을 제거하는 항비만 효과 가 있다고 알려져 있다(13).

재래식 고추장은 찹쌀을 하룻밤 불린 후 절구에 찧어 분말로 만들고, 물은 한번 끓인 후 따뜻하게 식힌 후 엿기름을 불린다. 냄비에 엿기름을 붓고 찹쌀가루를 푼 다음 불을 끈 다음 삭히고 조린다. 여기에 고춧가루, 메줏가루를 섞고 하루 뒤 소 금으로 간을 하여 고추장을 만들어 항아리에 담아 숙성시킨다(14). 메주제조는 콩 과 멥쌀을 침치·중숙 시킨 후 메주를 만든다. 콩은 8-10시간, 멥쌀은 5-6시간 침지 한 후 물을 제거한다. 익힌 콩과 불린 쌀을 혼합하여 시루에서 찐 후에 중숙이 끝 나면 식기 전에 절구에 거칠게 찧은 다음 동그랗게 빚어 볏짚 위에서 하루정도 말 린다. 겉면이 마르면 짚으로 싸서 7-8일 정도 처마에 매달거나 더운 곳에 두어 고 초균이나 곰팡이가 증식하면 볕에서 말린 다음 가루로 곱게 빻는다. 고추는 씨를 제거한 다음 가루를 낸다. 고추장의 종류에 따라 전분질 원료(찹쌀, 보리, 멥쌀)를 준비하고 소금과 주원료인 고춧가루를 6%이상 첨가한 다음 26-30℃에서 3-4개월 동안 담금 숙성을 한다(15). 재래식 고추장은 지역마다 만드는 시기가 정해져 있는 데 3-5월에 가장 많이 만들고, 12-2월 사이에도 만든다. 담근 이후 외부의 온도가 고추장의 발효숙성에 영향을 미치기 때문에 날씨가 비교적 춥지 않은 시기에 고추 장을 담근다(16).

개량식 고추장은 효소제 담금 고추장과 코지 담금 고추장으로 나뉜다. 효소제 담금 고추장은 쌀, 밀가루 등의 전분질 원료에 물을 가한 뒤 당화효소를 넣고 3시

(A)

(B)

Fig. 1. Manufacturing method of tranditional gochujang(A)and commercial gochujang(B).

지 않고 살균하여 포장제품화한 것이다. 코지 담금 고추장은 쌀, 밀가루, 보리 등 의 전분질 원료를 증자한 다음 국균을 접종하여 2-3일 보온 시킨 후 고춧가루, 소 금, 콩 등을 넣고 숙성시킨 뒤 마쇄, 살균, 포장하여 제조하는 방법이다(17).

고추장 제조 시 단백질 분해효소 및 전분질 분해효소 생성, 축적 목적으로 호화 된 전분질 원료에 코지를 접종한다. 코지란 곰팡이(Aspergillus species)의 한 종류 로 고추장을 만들 때 사용되는 미생물이다. 코지는 쓰이는 목적에 따라 쌀, 보리, 밀, 콩 등을 기질로 하여 선택된 미생물을 접종 후 생육할 수 있는 조건에서 발효 시킨다(18). 주로 Aspergillus oryzae를 접종시켜 효소작용과 효모의 발효작용에 의해 대사산물들이 만들어져 특유의 맛을 내는 것으로 알려져 있다(19). 코지의 사 용은 품질이 일정한 제품을 만들 수 있을 뿐만 아니라 그 자체로도 항산화 및 항 비만 활성 등 기능성을 가지고 있다(20). 따라서 코지와 다른 고추장 원료들이 혼 합되어 발효과정을 거치면서 각종 성분들이 형성되어 기능성이 향상되는 것으로 알려졌다. 최근에 와서 건강에 관한 관심이 높아지면서 장류의 고급화, 다양화 및 건강증진 기능성에 대한 연구가 요구되고 있다. 따라서 다양한 코지를 이용하여 제조한 고추장의 체중 감소효과와 콜레스테롤 저하효과 연구 등이 보고되고 있다 (21,22). CJ1354 곰팡이로 발효한 쌀 코지와 CJ14-5 세균으로 발효한 콩코지를 섞어서 제조한 발효 고추장이 다른 고추장에 비하여 체중 감소 및 혈청 지질대사 개선효과가 우수하였으며, tabasco hot sauce에 비해서도 항비만 효과가 우수한 것 으로 나타났다고 보고하였다(21).

이미 고추장의 원료 중 가장 중요한 고춧가루는 항비만 효과가 이미 밝혀져 고 춧가루를 제외하고 고추장 제조 원료의 많은 부분을 차지하고 있는 쌀과 콩 중 어 느 것이 항비만 기능성 유래 원료인지 확인하기 위하여 본 연구를 실시하였다. 또 한 발효과정 중 생성되는 대사산물의 조성 및 기능성을 알아보고자 쌀코지와 콩코 지의 영양성분 및 2차 대사발효산물을 비교 분석하였다. 또한 고지방식이에 이들 증자쌀, 쌀코지, 증자콩 및 콩코지를 첨가한 고지방식이를 흰쥐에게 급여하여 8주 동안 사육한 후, 체중, 혈청 지질 농도, 간의 지질합성관련 효소의 유전자 발현, 간 조직의 지질 축적, 지방세포의 크기와 같은 비만 관련 지표에 미치는 영향을 살펴 보고자 실시하였다.

제2장 재료 및 방법

제1절 실험재료

본 실험에 사용된 증자쌀, 쌀코지, 증자콩 및 증자코지는 CJ 제일제당으로부터 제공받아 연구하였다. 쌀코지는 증자한 큰눈 영양쌀에 곰팡이 종국인 Aspergillus oryzae CJ1354를을 접종한 후, 제국하여 쌀코지를 제조 하였으며, 콩코지는 세균 균주인 Bacillus amyloliquefaciens CJ(14-6를 간장 base 배지에서 37℃, 200 rpm 에서 24시간 배양한 후 그 배양액을 증자한 콩에 원곡대비 2% 접종하였다. 세균 이 접종된 콩을 배양설비를 이용하여 37℃에서 36시간 품온 관리를 해주며 제국하 여 완료된 콩코지를 40℃, 24시간 건조한 후 분쇄하여 분말로 만들었다.

제2절 이화학적 성분

1. 이화학적 성분분석

가. 일반성분 분석

증자쌀, 쌀코지, 증자콩 및 콩코지의 일반성분 분석의 방법은 Association of Official Analytical Chemists (A.O.A.C.)방법(23)에 준하여 실시하였다. 수분은 105℃

상압가열건조법을 사용하였으며, 조단백질은 micro-kjeldahl법, 조지방은 soxhlet 추출 법 그리고 조회분은 회화법을 통해서 분석하였고, 식이섬유소는 효소중량법 (enzymatic-gravimetric method)에 의하여 분석하였다. 탄수화물의 분석은 100에 서 수분, 조단백질, 조지방 및 조회분의 함량을 제외한 값으로 나타내었다. 모든

나. 유리 아미노산 분석

유리 아미노산의 분석은 분해관에서 건조시킨 시료 0.5 g과 6 N HCl 3 mL를 취한 다음 탈기하여 121℃에서 24시간 가수분해한 후 남은 여액을 rotary vacuum evaporator로 감압 농축시켜 sodium phosphate buffer (pH 7.0) 10 mL로 정용하였고 (24), 용액 1 mL를 취한 후 membrane filter (0.2 μm)로 여과하였다. 그 다음 아미 노산자동분석기(Biochrom 20, Pharmacia, Cambridge, England)로 정량 분석하였 다. 그 결과 총 23종의 아미노산이 검출되었으며, 분석조건은 Table 1와 같다.

Table 1. Operating conditions of amino acid auto-analyzer

Item Condition

Instrument S433-H (SYKAM)

Column Cation separation column (LCA K07/Li)

Column size 4.6 × 150 mm

Column temperature 57 - 74℃

Flow rate Buffer 0.45 mL/min, reagent 0.25 mL/min

Buffer pH range 3.45 - 10.85

Wavelength 440 m and 570 m

다. 지방산 분석

지방산 분석은 Wungaarden의 방법(25)에 준하여 시행하였다. 시료 2 g을 ether 용액으로 추출․여과하여 감압농축시킨 지방질 약 100 mg을 가지형 플라스크에 취하였다. 그리고 1 N KOH․ethanol 용액 4 mL를 섞은 후 유지방울이 없어질 때까지 교반시켜 14% BF3-Methanol 5 mL를 가한다. 냉각기를 부착하고 80℃에 서 5분간 가열하여 methylester화 시킨다. 이 용액에 NaCl 포화용액 3 mL를 첨가 한 후 hexane 1 mL를 첨가하여 흔들어서 섞은 후 시험관에 옮겨 정치하였다. 그 리고 상층을 분취하여 무수 Na2SO4를 넣고 수분을 제거하여 Gas Chromatography (GC-10A, Shimadzu, Kyoto, Japan)로 분석하여 총 22종의 지방 산이 분석되었다. 분석조건은 Table 2과 같다.

Table 2. Operating conditions of gas chromatography for fatty acids

Item Condition

Instrument GC-17A (Shimadzu, Japan)

Column SP^™-2560 capillary column (100 mm length × 0.25 mm i.d. × 0.25 μm film thickness)

Oven temp. 140℃

Detector FID detector

Analytic time 80 min/sample

라. UPLC-LTQ-IT-MS/MS 분석

UPLC-LTQ-IT-MS/MS분석은 Lee의 방법(26)에 준하여 시행하였다. 초고성능 액체 크로마토그래피 및 질량분석기 (UHPLC-LTQ-IT-MS/MS)는 formononetin 을 내부 표준물질로 첨가하고, 건조된 샘플을 80% 메탄올 200 μL에 용해시킨 후 0.2 μm의 polytetrafluoroethylene (PTFE) 필터에 여과하였다.

UHPLC-LTQ-IT-MS/MS는 binary solvent delivery system, autosampler, photodiode array detector (Ultimate 3000)를 갖춘 LTQ XL Linear ion-trap mass spectrometer (Thermo scientific, Pittsburgh, USA)에서 수행되었다. 분석 column 은 Syncronis C18 column(100 mm ✕ 2.1 mm, 5 μm, Thermo Corp.)을 사용하였 다. 이동상 용매는 0.1% formic acid가 함유된 수용액 및 0.1% formic acid가 함유 된 acetonitrile로 분석하였다. Solvent gradient system은 1분 간 acetonitrile의 비 율은 10%로 유지하고, 14분에 걸쳐 acetonitrile의 비율을 100%로 점차 증가시킨 후, 3분 동안 acetonitrile의 비율을 100%로 유지시켰다. 이후 1분 동안 acetonitrile 의 비율을 10%로 감소시켰다. 전체 분석 시간은 22분 이었고, sample injection volume 및 유속은 각각 10 μL 및 0.3 mL/min으로 설정하였다. Electron spray ionization(ESI)는 100-1000 m/z의 범위에서 positive and negative mode로 수행하 였다.

2. 실험기기

가. 실험기기

1. Centrifuge : Combi-514R, Hanil, Incheon, Korea

2. Evaporator : Rotary vacuum evaporator, Eyela, Tokyo, Japan 3. Spectrophotometer : UV-spectrophotometer, Bio-rad, Hercules, USA 4. Deep freezer : MDF-U52V, Sanyo, Osaka, Japan

5. Shaking water bath : JEIO-TEK SWBO3, Incheon, Korea 6. PCR : T100 Thermal cycler Bio-rad, Hercules, USA 7. Freeze dryer : ED 8512, Ilshin, Yangju, Korea

8. Clinical chemistry analyzer : Fuji Dry-Chem 3500, Fujifilm, Tokyo, Japan 9. Light microscope : Motic AE31, Motic Instrument Inc, Richmond, BC,

Canada

10. Liquid scintillation counter : LS1000C, Beckman Co., USA

제3절 In vivo에서 지질대사 개선 및 비만 억제효능

1. 실험동물의 사육 및 식이

실험동물은 Sprague Dawley계 5주령 수컷 흰쥐 60마리를 오리엔트바이오㈜

(Seongnam, Korea)에서 구입하여 조선대학교 실험동물센터에서 1주일간 고형배합 사료로 적응시킨 다음 난괴법(randomized block design)에 의해서 각 처리 군 당 10마리씩 6군으로 나누어 스테인리스 케이지에 1마리씩 분리하여 8주간 사육하였 다. 실험군은 Table 1에서와 같이 정상식이군(ND), 고지방식이군(HFD), 고지방식 이와 증자쌀 3% 첨가군(HFD-R), 고지방식이와 쌀코지 3% 첨가군(HFD-RK), 고 지방식이와 증자콩 3% 첨가군(HFD-S) 및 고지방식이와 콩코지 3% 첨가군 (HFD-SK)으로 나누어 실험하였다. 실험에 사용된 식이는 AIN-93 정제식이를 기 준(27)으로 변형하여 조제하였으며, Table 1과 같다. 고지방식이는 식이 무게의 10%의 Lard를 첨가한 식이를 공급하였다. 물과 식이는 제한 없이 공급하였으며, 사육실 온도는 18±2℃로 유지하였으며, 조명은 12시간 주기(08:00~20:00)로 조절하 였다. 체중증가율은 최종 체중에서 실험개시 전의 체중을 감하고 실험개시 전의 체중으로 나누어 표시하였으며, 식이효율(feed efficiency ratio, FER)은 사육기간의 체중증가량을 동일 기간의 식이섭취량으로 나누어서 구하였다. 본 연구의 동물실 험은 조선대학교 동물실험유리위원회의 승인을 거쳐 진행하였다. (승인의결번호 : CIACUC2015-A0028)

Table 3. Experimental design

Groups Diet composition

ND¹⁾ Normal diet

HFD²⁾ Control diet (High-fat diet)

HFD-R High-fat diet + 3% Steamed rice

HFD-RK High-fat diet + 3% Rice koji

HFD-S High-fat diet + 3% Steamed soybean

HFD-SK High-fat diet + 3% Soybean koji

1),2) Modified AIN-93 diet(27).

Table 4. Composition of experimental diet

(g/kg)

Groups¹⁾ Diet

Composition

ND HFD HFD-R HFD-RK HFD-S HFD-SK

Casein 200 192.72 197.72 197.72 197.72 197.72

L-cystine 3 3 3 3 3 3

Corn starch 397.486 297.486 267.486 267.486 267.486 267.486

dextrose 132 132 132 132 132 132

Sucrose 100 100 100 100 100 100

Cellulose 50 50 50 50 50 50

Lard - 100 100 100 100 100

Soybean oil 70 70 70 70 70 70

Mineral mix²⁾ 35 35 35 35 35 35

Vitamin mix³⁾ 10 10 10 10 10 10

Choline chloride 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5

Tert-butyl

hydroquinone 0.014 0.014 0.014 0.014 0.014 0.014

Steamed rice - - 30 - - -

Rice koji - - - 30 - -

Steamed soybean - - - - 30 -

Soybean koji - - - - - 30

1)See the legend of Table 3.

2),3)

AIN-93-MX mineral mixture and AIN-93-VX vitamin mixture(27).

2. 실험동물의 처리

실험동물은 사양시험 종료 후 12시간 동안 절식시키고 CO2로 마취하여 단두 절 단하여 혈액을 채취하였다. 채취된 혈액을 1,150 ×g에서 20분간 원심분리 시킨 다 음 혈청을 분리하여 혈청 지질 함량 및 효소 활성 측정용 시료로 사용하였다. 그 리고 간과 지방조직을 적출한 후 0.9% 생리식염수로 남아 있는 혈액 및 기타 부 착물질을 제거하였고, 여지로 수분을 제거한 다음 중량을 측정하여 효소 활성 저하를 예방하기 위해서 급속 동결하여 -70℃의 deep freezer에 보관하였다.

3. 혈청 효소 활성 측정

혈청 중 alanine aminotransferase (ALT), asparate aminotransferase (AST), alkaline phosphatase (ALP) 및 lactate dehydrogenase (LDH) 활성은 혈액생화학 적 검사 자동분석기(Fuji Dri-Chem 3500, Fujifilm, Tokyo, Japan)를 이용하여 측 정하였다.

4. 혈청 지질 함량 측정

혈청 중 중성지방(TG), 총 콜레스테롤(TC) 및 HDL-콜레스테롤의 함량을 측정하 기 위해 혈액생화학적 검사 자동분석기(Fuji Dri-Chem 3500, Fujifilm, Tokyo, Japan)를 이용하여 측정하였다. LDL-콜레스테롤의 함량은 Friedwald식 {총콜레스 테롤 - (HDL-콜레스테롤 – 중성지방/5)}(28)을 이용하여 계산하였다. 심혈관계질환 의 위험도 판정에 사용되는 동맥경화지수(atherogenic index, AI)는 {(총콜레스테롤 – HDL-콜레스테롤) / HDL-콜레스테롤}(29)에 의하여 구하였으며, 심혈관위험지수 (cardiac risk factor, CRF)(52)는 총콜레스테롤을 HDL-콜레스테롤로 나누어 구하였 다.

5. 혈청 렙틴 함량 측정

혈청 중의 렙틴(leptin) 함량은 렙틴 측정용 kit를 사용하여 radioimmunoassay법 으로 측정하였다.

6. 간 조직의 지질 함량 측정

간 조직 중 중성지방과 총 콜레스테롤 함량 분석을 위해 먼저 Folch 방법(30)에 따라 간 조직에서 총 지질을 추출하였다. 적출한 간 조직 중 0.1 g을 칭량한 다음 6 mL CHCl3-MeOH (2 : 1, v/v)을 첨가하고 냉장상태에서 3일 동안 방치하였다.

방치한 후 H2O를 첨가한 다음 1,900 ×g에서 20분간 원심분리 시킨 후 지질층인 하층부를 취하여 중성지방과 총 콜레스테롤의 함량 분석을 위하여 사용하였다. 총 콜레스테롤의 함량은 Zlatkis와 Zak의 방법(31)을 통하여 측정하였고, 중성지방 함 량은 Biggs 등(32)의 방법을 통하여 측정하였다.

7. 지방조직의 지질 함량 측정

적출한 장간막지방조직과 부고환지방조직은 Folch 등(30)의 방법을 통해 지질을 추출한 다음 간 조직의 지질 함량 측정과 동일한 방법으로 중성지방과 총 콜레스 테롤의 함량을 측정하였다.

8. 간 조직의 병리조직학적 검사

실험에 이용 된 흰 쥐의 해부 직후 적출한 간 조직 중 일부를 채취하여 4%의 paraformaldehyde 용액에 고정시킨 다음, –25℃에서 동결절편기(cryocut microtome)를 사용하여 3-4 μm 두께의 절편을 제작하여 슬라이드에 부착시킨 후 건조하였다. 이를 Oil-Red-O로 염색한 후, 수세, 중화 및 탈수단계를 차례로 거친 후 봉입제로 봉입한 후 Light microscope(Motic AE31, Motic Instrument Inc., Richmond, BC, Canada)을 사용하여 관찰하였다.

9. 지방세포의 크기 측정

실험에 이용 된 흰 쥐의 해부 직후 적출한 부고환지방조직의 크기를 일정하게 자른 다음 10%의 formalin으로 고정시킨 다음, 파리핀 블록으로 제작한 절편을 만 들어 이를 슬라이드로 만든 다음 다시 hematoxylin and eosin (H&E) 염색액을 사 용하여 염색하였다. 이것을 전자현미경을 통해 지방세포의 사진을 찍은 후, Image analyzer 프로그램을 통하여 처리구간에 있는 지방세포를 비교하였다.

10. Reverse transcription-polymerase chain reaction

RNeasy mini kit (QIAGEN, Maryland, USA)를 이용하여 RNA를 분리하였다.

분리된 RNA 1 μg에 oligo (dT) 1 μL (Invitrogen, Carlsbad, USA)와 DEPC를 첨 가하여 20 μL으로 혼합한 후, AccuPower RT-premix (Bioneer, Seoul, Korea)에 넣어 42℃에서 60분, 94℃에서 5분간 반응시켜 cDNA를 합성하였다. 합성한 cDNA 를 이용하여 acetyl-CoA carboxylase (ACC), fatty acid synthase (FAS) 및 glucose 6-phosphate dehydrogenase (G6PDH)이 군별로 어떠한 차이를 보이는지 PCR (PCR-preMix, Bioneer, Seoul, Korea)을 통해 확인하였다. PCR 조건은 95℃

에서 10분 (initial denatureation), 95℃에서 15초 (denaturation), 60℃에서 1분 (primer annealing), 72℃에서 30초 (extension)의 조건으로 30cycle 시행한 후, 7 2℃에서 5분 (post extenstion), 12℃에서 ∞ (final extension)의 조건으로 실시하 였다. PCR 생성물은 2% agarose 젤에서 전기영동을 통해 각 유전자의 발현을 검 출하였으며, β-actin은 house-keeping gene 중 하나로서, mRNA level control로 사용하였다. 각각의 PCR product의 크기는 Table 5과 같다.

Gene primers

size (bp)

ACC

Forward 5'-CAACGCCTTCACACCACCTT-3'

96 Reverse 5'-AGCCCATTACTTCATCAAAGATCCT-3'

FAS

Forward 5'-GGAACTGAACGGCATTACTCG-3'

153 Reverse 5'-CATGCCGTTATCAACTTGTCC-3'

G6PDH

Forward 5'-GTTTGGCAGCGGCAACTAA-3'

98 Reverse 5'-GGCATCACCCTGGTACAACTC-3'

β-actin

Forward 5'-GTGGGGCGCCCCAGGCACCAGGGC-3'

540 Reverse 5'-CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3'

Table 5. Sequences of primers used for reverse transcription- polymerase chain reaction

11. 통계처리

본 실험에서 얻어진 결과는 SPSS (Statistical Package for Social Science)를 이 용하여 통계 분석하였고, 실험군당 평균±표준오차로 표시하였으며, 그룹간의 평균 차이에 대한 유의성 검정을 위하여 일원배치 분산분석(one-way analysis of variance)을 통해 실시하였고, p<0.05 수준에서 Tukey's test를 이용하여 사후 검 정(Post-Hoc test)을 실시하였다.

제3장 실험결과 및 고찰

제1절 이화학적 성분

1. 이화학적 성분분석

가. 일반성분

증자쌀, 쌀코지, 증자콩 및 콩코지의 일반성분 함량을 분석한 결과는 Table 6와 같다. 건물량 기준(dry mateer basis) 증자쌀, 쌀코지, 증자콩 및 콩코지의 순서대 로 수분 함량은 각각 3.4%, 5.2%, 1.7% 및 3.5%, 탄수화물 함량은 87.2%, 85.2%, 48.4% 및 39.9%, 조단백질 함량은 7.6%, 7.7%, 38.5% 및 39.9%, 조지방 함량은 1.4%, 1.4%, 6.9% 및 12.4%, 회분 함량은 0.4%, 0.6%, 4.5% 및 4.3%, 식이섬유소 함량은 5.4%, 5.6%, 37.3% 및 34.3%로 나타났다. 증자쌀과 쌀코지는 증자콩과 콩 코지에 비하여 탄수화물의 함량이 유의하게 높게 나타났다. 반면에 증자콩과 콩코 지는 증자쌀과 쌀코지에 비하여 조단백질, 조회분, 조지방 및 식이섬유소 함량이 유의하게 높게 나타났다. 증자쌀과 쌀코지 간에는 일반성분 조성의 차이가 없었고, 증자콩과 증자코지 간에는 조지방 함량의 차이만 있을 뿐 다른 성분에는 차이가 없는 것으로 나타났다.

Hwang 등(33)의 연구에서는 쌀의 일반성분 분석결과 수분 12.85%, 단백질 5.81%, 지방 0.56%, 회분 0.28%로 나타났고, 메밀, 수수, 율무 등은 수분 11.12∼

11.84%, 단백질 10.00∼16.24%, 지방 2.89∼4.36%, 회분 1.23∼1.93%으로 나타나 본 연구의 증자쌀과 쌀코지의 일반성분 함량과 차이를 보였는데, 이는 시료의 처 리 방식에 따른 차이라고 생각된다.

Table 6. Proximate compositions of Steamed rice, rice koji, steamed s oybean and soybean koji

(%)

Steamed rice Rice koji Steamed

soybean Soybean koji Moisture 3.4±0.09^b 5.2±0.16^a 1.7±0.17^c 3.5±0.17^b Carbohydrate 87.2±8.14^a 85.2±5.20^a 48.4±2.96^b 39.9±1.96^b Crude protein 7.6±0.3^b 7.7±0.07^b 38.5±0.9^a 39.9±2.1^a

Crude fat 1.4±0.03^c 1.4±0.03^c 6.9±0.44^b 12.4±0.61^a Ash 0.4±0.02^b 0.6±0.03^b 4.5±0.18^a 4.3±0.11^a Dietary fiber 5.4±0.29^b 5.6±0.23^b 37.3±2.64^a 34.3±1.29^a

1)Carbohydrate = 100 - (moisture + crude protein + crude fat + crude ash).

2)All values are expressed as mean ± SE of triplicate determinations.

나. 유리 아미노산

증자쌀, 쌀코지, 증자콩 및 콩코지의 유리 아미노산 함량을 분석한 결과는 Table 7과 같다. 총 23종의 유리 아미노산이 검출되었으며, 총 아미노산 함량은 증자쌀 0.19 mg%, 쌀코지 12.7 mg%, 증자콩 15.42 mg% 및 콩코지 65.8 mg%였다. 증자 쌀에서는 총 6종이 검출되었는데, 그 중 glutamic acid와 γ-amino-n-butyric acid (GABA)가 각각 0.05 mg%와 0.08 mg%로 가장 많은 함유량을 보였다. 쌀코지에 서는 총 17종이 검출되었다. 그 중 alanine과 GABA가 각각 3.82 mg%와 2.56 mg%로 가장 많은 함유량을 보였다. 증자콩에서는 총 20종이 검출되었는데, alanine, tyrosine, phenylalanine 및 GABA이 각각 2.16 mg%, 1.15 mg%, 2.08 mg% 및 1.9 5mg%로 가장 많은 함유를 보였다. 콩코지에서는 17종이 검출되었고, glutamic acid, valine, leucine 및 phenylalanine가 각각 5.93 mg%, 7.1 2mg%, 10.6 mg% 및 26.17 mg%를 함유한 것으로 나타났다. 그리고 쌀코지에는 β -aminobutyric acid가 0.07 mg%로 특이적으로 함유되어 있었고, 증자콩에는 α-aminoadipic acid와 arginine이 각각 0.53 mg%와 0.68 mg%, 콩코지에는 citrulline이 0.18 mg%로 특이 적으로 함유되어 있었다.

Table 7. Contents of free amino acids of steamed rice, rice koji, steamed soybean and soybean koji

(mg%) Steamed

rice Rice koji Steamed soybean

Soybean koji

Urea - - 0.1±0.01^b 0.38±0.01^a

Aspartic acid 0.03±0.00^b 0.08±0.00a 0.09±0.00^a - Threonine - 0.2±0.01^c 0.26±0.00^b 0.49±0.01^a

Serine 0.01±0.00^d 0.25±0.01^a 0.2±0.01^b 0.1±0.00^c Asparagine - 0.28±0.01^c 0.75±0.02^a 0.6±0.02^b Glutamic acid 0.05±0.01^d 0.43±0.02^c 0.88±0.03^b 5.93±0.03^a α-aminoadipic acid - - 0.53±0.03 -

Proline - 1.37±0.1^a 0.72±0.01^b - Glycine 0.01±0.00^d 0.31±0.01^a 0.18±0.01^c 0.26±0.01^b Alanine 0.01±0.00^d 3.82±0.09^a 2.16±0.06^b 1.29±0.06^c

Citrulline - - - 0.18±0.01

Valine - 0.24±0.01^c 0.96±0.04^b 7.12±0.27^a Methionine - 1.85±0.04^a - 0.74±0.02^b Isoleucine - 0.13±0.00^c 0.54±0.03^b 3.24±0.1^a

Leucine - 0.15±0.01^b 0.69±0.02^b 10.6±0.36^a Tyrosine - 0.11±0.01^c 1.15±0.04^b 5.07±0.14^a Phenylalanine - 0.79±0.02^bc 2.08±0.07^b 26.17±0.73^a

β-alanine - 0.06±0.00^b 0.29±0.02^a - β-aminoisobutyric

acid - 0.07±0.00 - -

γ-amino-n-butyric

acid 0.08±0.00^d 2.58±0.08^a 1.95±0.04^b 0.52±0.01^c Histidine - - 0.36±0.01^b 1.26±0.02^a Tryptopan - - 0.85±0.03^b 1.84±0.09^a

Arginine - - 0.68±0.07 -

Total 0.19±0.01^c 12.7±0.31^b 15.42±0.41^b 65.8±2.21^a

1)All values are expressed as mean±SE of triplicate determinations.

다. 지방산

증자쌀, 쌀코지, 증자콩 및 콩코지의 지방산 함량을 분석한 결과는 Table 8과 같 다. 증자쌀, 쌀코지, 증자콩 및 콩코지의 지방산 조성은 포화지방산 11종, 단일불포 화지방산 5종, 다가불포화지방산 6종으로 총 22종의 지방산이 검출되었다. 증자쌀, 쌀코지, 증자콩 및 콩코지의 구성 지방산 중 포화지방산에서는 palmitic acid의 함 량이 증자쌀, 쌀코지, 증자콩 및 콩코지에서 각각 31.52%, 27.08%, 13.8% 및 16.03%로 가장 높은 함량을 보였고, stearic acid는 증자쌀에는 함유되어 있지 않 지만 쌀코지, 증자콩 및 콩코지 순으로 5.06%, 5.53%, 6.43%로 palmitic aicd 다음 으로 높은 함량을 나타냈다. 포화지방산 중 caproic acid, tricosanoic acid는 증자 쌀에서만 특이적으로 함유되어 있는 것으로 나타났다. 단일불포화지방산에서는 oleic acid가 증자쌀, 쌀코지, 증자콩 및 콩코지에서 각각 38.84%, 30.34%, 18.2%

및 20.39%로 가장 높은 함량을 보였고, myristoleic acid는 콩코지에서, nervonic acid는 증자쌀에서 특이적으로 함유되어 있는 것으로 나타났다. 다가불포화지방산 에서는 linoleic acid가 증자쌀, 쌀코지, 증자콩 및 콩코지에서 각각 16.82%, 29.51%, 29.01%, 33.41%로 가장 높은 함량을 보였고, linolelaidic acid와 cis-11,14-eicosadienoic acid가 증자콩에서 특이적으로 함유되어 있는 것을 확인할 수 있었다.

Table 8. Compositions of fatty acids in steamed rice, rice koji, steamed soybeanand soybean koji

(% total fatty acids)

Fatty acid Steamed

rice Rice koji Steamed soybean

Soybean koji

Caproic acid (C6:0) 0.96±0.01 - - -

Myristic acid (C14:0) 0.71±0.04^a 0.64±0.03^a 0.15±0.01^b 0.17±0.02^b

Pentadecanoic acid (C15:0) - 0.25±0.02^b - 0.49±0.06^a

Palmitic acid (C16:0) 31.52±1.91^a 27.08±1.36^a 13.8±0.76^b 16.03±0.61^b Heptadecanoic acid (C17:0) 0.78±0.06^a 0.74±0.01^a 0.76±0.02^a 0.52±0.04^b

Stearic acid (C18:0) - 5.06±0.15^c 5.53±0.05^b 6.4±0.07^a

Arachidic acid (C20:0) 1.2±0.04^a 1.02±0.03^b 0.59±0.02^c 0.55±0.2^c

Heneicosanoic acid (C21:0) - - 22.05±0.18^a 10.72±0.39^b

Behenic acid (C22:0) 0.54±0.03^b 0.3±0.02^c 0.61±0.05^ab 0.69±0.03^a

Tricosanoic acid (C23:0) 0.35±0.02 - - -

Lignoceric acid (C24:0) 0.5±0.02^a 0.5±0.03^a 0.19±0.01^b 0.22±0.02^b

Saturated 36.56±0.61^b35.58±0.93^b 43.67±0.8^a 35.8±0.27^b

Myristoleic acid (C14:1) - - - 0.16±0.02

Palmitoleic acid (C16:1) 0.31±0.02^b 0.47±0.02^a 0.13±0.01^c 0.16±0.01^c Oleic acid (C18:1n9c) 38.84±0.71^a 30.34±0.39^b 18.2±0.07^d 20.39±0.45^c cis-11-Eicosenoic acid (C20:1) 0.65±0.03^a 0.63±0.02^a 0.36±0.03^b 0.3±0.01^b

Nervonic acid (C24:1) 0.36±0.02 - - -

Monounsaturated 40.17±1.62^a 31.44±0.5^b 18.69±0.2c 21.01±0.77^c

Linolelaidic acid (C18:2n6t) - - 0.28±0.2 -

Linoleic acid (C18:2n6c) 16.82±0.11^c 29.51±0.91^b 29.01±0.56^b 33.41±0.88^a

cis-11,14-Eicosadienoic acid (C20:2) - - 0.09±0.01 -

Linolenic acid (C18:3n3) 0.63±0.04^d 2.33±0.13^c 7.66±0.18^b 9.67±0.35^a cis-11,14,17-Eicosatienoic acid (C20:3n3) 3.74±0.15^a 0.84±0.02^b - - cis-5,8,11,14,17-Eicosapentaenoic

acid(C20:5n3) 2.09±0.11^a 0.3±0.05^c 0.61±0.05^b 0.1±0.02^c Polyunsaturated 23.27±0.71^d32.98±1.03^c 37.64±0.67^b43.19±0.85^a

1)All values are expressed as mean±SE of triplicate determinations.

라. 2차 대사산물

증자쌀, 쌀코지, 증자콩, 콩코지의 2차 대사산물을 측정한 결과는 Table 9과 같 다.

과일 껍질, 채소의 잎, 줄기, 뿌리 씨앗 등 식물에 광범위하게 존재하는 천연물 질(34)인 flavonoid는 지방세포의 생성 억제에 영향을 미친다고 보고되었다(35).

Flavonoid 조성과 농도를 살펴본 결과 증자쌀과 쌀코지는 6종의 flavonoid를 함유 한 것으로 나타났는데, apigenin-C-glucosyl-C-carabinoside, chrysoeriol-hexoside, chrysoeriol-rutinoside, tricin-7-O-rutinoside, tricin-O-glucoside, tricin이었다. 이 6종의 flavonoid는 모두 쌀코지가 증자쌀에 비해 많이 함유된 것으로 나타났다. 그 러나 증자콩과 콩코지는 kaempferol을 제외하고는 다른 종류의 flavonoid를 함유 하고 있지 않은 것으로 나타났고, 콩코지의 kaempferol 함량은 증자콩에 비하여 높게 나타났다.

Isoflavone은 혈중 콜레스테롤 저하작용, 항산화 작용 및 estrogen 유사작용 등 의 효과가 보고되었다(36-39). Isoflavone 조성을 살펴보면 증자콩과 콩코지에는 총 9종류의 isoflavone이 검출되었다. Malonylgenistin, acetyldaidzin, acetylgenistin, daidzin, genistin, daidzein, glycitein, genistein 및 hydroxydaidzein 이 검출되었으며, 증자콩에서는 acetyldaidzin, acetylgenistin 및 genistin이, 콩코지 에서는 malonylgenistin, daidzin, daidzein, glycitein 및 genistein이 더 많이 함유 하는 것으로 나타났다. 그러나 증자쌀과 쌀코지에서는 isoflavone이 검출되지 않았 다.

Soyasaponin은 콩의 화합물 중 하나이며, 혈중 콜레스테롤 감소효과(40)를 비롯 한 항산화활성(41), 간 독성 물질 제거(42,43) 등의 효능이 있다고 보고하였다.

Soyasaponins은 증자쌀과 쌀코지에서는 검출되지 않았으나 증자콩과 콩코지에서 는 soyasaponin I～V, 총 5종류가 검출되었으며, 증자콩이 콩코지에 비하여 soyasaponin I～V 5종 모두 함량이 높게 나타났다.

Lipids의 조성과 함량을 살펴보면 증자쌀과 쌀코지는 lysoPE14:0, lysoPC14:0, lysoPC16:1, lysoPE18:2, lysoPC18:2, lysoPE16:0, lysoPC16:0, lysoPC18:1 총 8종류 가 검출되었고, 증자콩에는 lysoPC14:0, lysoPE18:2, lysoPC18:2, lysoPE16:0, 4종

쌀코지를 비교하면 lysoPC18:1은 증자쌀에 더 많이 함유한 것으로 나타났고 그 외 나머지 7종의 lipids는 모두 쌀코지에 더 많이 함유한 것으로 나타났다. 증자콩과 콩코지에서는 lysoPE18:2와 lysoPC18:2가 공통적으로 검출되었고, lysoPE18:2는 콩 코지에서, lysoPC18:2는 증자콩에서 더 많이 함유한 것으로 나타났다. 그리고 증자 콩에서는 lysoPC14:0과 lysoPE16:0이 추가로 검출되었고, 콩코지에서는 lysoPC16:1 이 검출되었다.

Table 9. Relative contents of targeted secondary metabolites in steamed rice, rice koji, steamed soybean and soybean koji

( mg/ L)

Tentativematabolite RTa [M+H]+ Ms fragment pattern b

Relative peak areas per sample

Steamed rice Rice koji Steamed soybean Soybean koji

Flavonoids

Apigenin-C-glucosyl-C- Carabinoside

6.78 565 565>547>499 47,205±1,515^** 60,715±1,361 - -

Chrysoeriol-hexoside 7.80 463 - 7,156±499^* 9,771±496 - -

Chrysoeriol-rutinoside 8.10 609 - 6,975±278 16,544±303 - -

Tricin-7-O-rutinoside 8.10 639 639>493>331 24,676±442^** 46,285±2,222 - -

Tricin-O-glucoside 8.49 493 493>331 14,940±662^*** 34,218±878 - -

Tricin 10.80 331 - 29,963±764^*** 128,625±7,241 - -

Kaempferol 10.91 287 - - - 5,939±249 6,112±13

Isoflavone

Malonylgenistin 8.75 519 519>271 - - 1,523,524±108,049^*** 5,219,268±99,621

Acetyldaidzin 8.52 459 459>255 - - 1,008,113±115,082 931,206±26,081

Acetylgenistin 9.37 475 475>271 - - 1,052,903±61,315 966,798±30,021

Daidzin 6.54 417 417>255>199 - - 3,257,912±181,942^** 15,180,505±105,219

Genistin 7.90 433 433>271>153 - - 1,507,780±101,439 1,185,921±76,966

Daidzein 9.56 255 255>199>181 - - 1,416,505±111,639 1,692,950±100,005

Glycitein 9.75 285 285>270>242 - - 401,404±12,510 441,534±16,497

Genistein 10.74 271 271>153 - - 1,084,265±43,032 1,124,680±99,099

Hydroxydaidzein 8.82 271 271>253 - - - 83,812±64,163

Tentativematabolite RTa [M+H]+ Ms fragment pattern b

Relative peak areas per sample

Steamed rice Rice koji Steamed soybean Soybean koji

Sayasaponins

Soyasaponin Ⅴ 11.44 959 960>599 - - 725,723±20,167 690,578±22,595

Soyasaponin Ⅰ 11.63 943 944>797>599 - - 2,347,278±130,429 2,087,080±63,645

Soyasaponin Ⅱ 11.91 913 - - - 898,833±6,904^** 763,020±18,312

Soyasaponin Ⅲ 12.02 797 - - - 997,368±10,059^** 932,584±3,172

Soyasaponin Ⅳ 12.25 767 - - - 432,011±14,538 376,098±16,746

Lipids

LysoPE14:0 13.5 426 426>408>365 33,158±1,478^** 43,755±429 - -

LysoPC14:0 13.7 468 486>450 562,226±18,146^***b 2,402,171±112,597^a 6,668±86^c -

LysoPC16:1 14.3 494 494>476 19,016±636^***b 37,479±304^b - 1,596,662±66,000^a

LysoPE18:2 14.5 478 478>460>263 119,973±2,005^***c 374,237±3,784^b 481,258±11,277^***b 4,994,014±117,317^a

LysoPC18:2 14.59 520 520>502 540,581±10,735^***c 1,387,051±16,717^b 2,712,419±149,824^***a 183,929±7,614^d

LysoPE16:0 15.2 454 454>436>393 71,381±482^***c 285,645±9,354^a 188,871±2,081^b

LysoPC16:0 15.69 496 496>478,184 533,713±7,201^*** 2,489,700±48,201 - -

LysoPC18:1 16.22 522 522>504 889,266±6,608^*** 338,543±1,875 - -

1)Values are mean ± SE (N=6)

2)Values with different superscripts in the same row are significantly different (p<0.05) between groups by Tukey’s Test.

제2절 In vivo에서 지질대사 개선 효과

1 . 체중증가량, 식이섭취량 및 식이효율

증자쌀, 쌀코지, 증자콩 및 콩코지를 첨가한 고지방식이를 8주간 급여한 흰쥐의 체중증가량, 식이섭취량 및 식이효율을 비교한 결과는 Table 10과 같다.

흰쥐의 체중증가량은 고지방식이군(HFD)이 정상식이군(ND)에 비하여 유의적으 로 증가하여 고지방식이로 인해 비만이 유도된 것을 확인할 수 있었다. 고지방식 이에 증자쌀, 쌀코지, 증자콩 및 콩코지를 급여한 식이군들(HFD-R, HFD-RK, HFD-S, HFD-SK)은 고지방식이군(HF)에 비하여 체중이 저하되는 경향이었으나 유의차는 없었다.

식이섭취량은 정상식이군(ND)에서 가장 높게 나왔고, 고지방식이군(HFD)은 정 상식이군(ND)에 비해 감소하였다. 증자쌀, 쌀코지, 증자콩 및 콩코지를 급여한 식 이군들(HFD-R, HFD-RK, HFD-S, HFD-SK)은 고지방식이군(HFD)에 비해 감소 하였지만 유의한 차이는 보이지 않았다. Dodge(44)는 식이지방이 위 내의 체류시 간을 지연시키기 때문에 고지방식이를 섭취한 군에서 식이섭취량이 감소한다고 하 였고, Pellizzon 등(45)의 연구에서도 흰쥐에서 에너지 밀도가 높은 고지방식이군이 에너지 밀도가 낮은 저지방식이군에 비하여 식이섭취량이 낮았다고 보고하였다.

식이효율은 에너지 밀도가 높은 고지방식이군(HFD)이 정상식이군(ND)에 비해 유의적으로 증가하였으며, 증자쌀, 쌀코지, 증자콩 및 콩코지를 급여한 식이군들 (HFD-R, HFD-RK, HFD-S, HFD-SK) 대부분이 고지방식이군(HFD)에 비해 감 소하는 경향이었으나, 증자쌀 투여군(HF-R)은 고지방식이군(HFD)에 비해 증가하 였다.

본 연구 결과 고지방식이로 비만이 유도된 흰쥐에서 증자쌀, 쌀코지, 증자콩 및 콩 코지의 첨가로 인하여 체중증가량, 식이효율이 감소하는 것으로 보아, 증자쌀, 쌀코 지, 증자콩 및 콩코지는 체중 감소효과가 있는 것으로 사료된다. 그러나 이들 증자 쌀, 쌀코지, 증자콩 및 콩코지를 급여한 군들 간의 체중차이는 없는 것으로 나타났 다.

Table 10. Changes in body weight gain, food intake and food efficiency ratio of rats fed the experimental diets

Groups¹⁾ Body weight gain (g/day)

Food intake

(g/day) FER²⁾

ND 5.02±0.21^3)b4) 22.05±0.48^a 0.23±0.01^c HFD 6.08±0.19^a 20.71±0.15^b 0.29±0.01^ab HFD-R 5.90±0.21^ab 19.01±0.21^c 0.31±0.01^a HFD-RK 5.58±0.13^ab 19.97±0.25^bc 0.28±0.00^b HFD-S 5.68±0.30^ab 20.57±0.66^b 0.28±0.01^b HFD-SK 5.55±0.21^ab 19.82±0.16^bc 0.28±0.01^b

1)See the legend of Table 3.

2)FER (food efficiency ratio) : weight gain (g/day)/food intake (g/day).

3)The results are mean±SE of 10 rats per each groups

4)Values with different superscripts in the same column are significantly different(p<0.05) between groups by Tukey's test.

2. 간 및 지방 조직의 무게

증자쌀, 쌀코지, 증자콩 및 콩코지를 첨가한 고지방식이를 8주간 급여한 흰쥐의 간 및 지방조직의 무게를 비교한 결과는 Figure 1,2 및 Table 11과 같다.

체중 100g 당 간 조직의 상대적 무게를 측정한 결과는 Fig. 2와 같다. 정상식이 군(ND)와 고지방식이군(HFD)간의 유의차가 없었다. 고지방식이에 증자쌀, 쌀코지, 증자콩 및 콩코지를 첨가한 군들 중 쌀코지와 증자콩을 첨가한 식이군은 고지방식 이군(HFD)과 유의차가 없었으나, 증자쌀을 첨가한 식이군(HFD-R)은 고지방식이 군(HFD)에 비해 유의하게 감소하였다.

체내 지방조직은 에너지를 저장하고, 몸 전체에 분포시키는 백색지방과, 많은 수 의 미토콘드리아를 함유하여 열을 생산하는 기능을 하는 갈색지방으로 구분된다.

주로 비만환자들에게는 갈색지방보단 백색지방이 증가된 형태를 보이게 되는데 (47), 따라서 증자쌀, 쌀코지, 증자콩 및 콩코지의 급여에 따른 체중감소 효과를 확 인하기 위하여 백색지방에 해당하는 부고환지방, 장간막지방, 등지방 및 신장주위 지방조직의 무게를 분석하였다.

총 지방, 부고환지방, 장간막 지방, 등지방 및 신장주변의 지방의 무게를 측정한 결과는 Table 11과 같다. 총 지방, 부고환지방, 장간막 지방, 등지방 및 신장주변의 지방의 무게는 고지방식이군(HFD)이 정상식이군(ND)에 비하여 유의하게 증가하 였다. 부고환지방의 무게는 고지방식이군(HFD)에 비하여 증자쌀, 쌀코지, 증자콩 및 콩코지 첨가군(HFD-R, HFD-RK, HFD-S, HFD-SK)들이 감소되었으나 유의 차는 없었다. 총 지방 및 장간막지방의 무게는 고지방식이에 쌀코지 또는 콩코지 를 첨가한 군(HFD-RK, HFD-SK)이 고지방식이군(HFD)에 비하여 유의하게 감소 하였다. 등 지방조직과 신장주변 지방조직의 무게는 고지방식이에 증자쌀과 쌀코 지를 첨가한(HFD-R,. HFD-RK)군이 고지방식이군(HFD)에 비하여 유의하게 감소 되었다.

본 연구결과 증자쌀, 쌀코지, 증자콩 및 콩코지의 급여로 인해 고지방식이로 증 가된 간 및 지방조직의 무게가 감소한 것으로 나타났고, 특히 쌀코지와 콩코지가 증자쌀과 증자콩에 비하여 장간막 및 총 지방조직의 무게가 유의하게 감소되었다.

따라서 증자쌀, 쌀코지, 증자콩 및 콩코지가 간 및 지방조직에 지방이 축적되는 것

비만의 억제효과가 있을 것으로 사료된다.

Fig. 2. Liver index of rats fed a high-fat diet containing steamed rice, rice koji, steamed soybean and soybean koji for 8 weeks. Abbreviations: See the legend of Table 3. Liver index: liver weight/100g body weight. Values are mean ± S. E. of 10 rats per each group and different superscript letters indicate significant differences at p<0.05 by Tukey's test.