ND HFD HFD-R
HFD-RK HFD-S HFD-SK
ND HFD HFD-R
HFD-RK HFD-S HFD-SK
Fig. 23. Hepatic representative anatomical views (A) and histological analysis (B) in rats fed a high-fat diet containing steamed rice, rice koji, steamed soybean and soybean koji for 8 weeks. Abbreviations: See the legend of Table 3.
(A)
(B)
10. 지방세포의 크기 변화
증자쌀, 쌀코지, 증자콩 및 콩코지를 첨가한 고지방식이를 8주간 급여한 흰쥐의 부고환지방을 채취한 후 염색하여 현미경으로 관찰한 결과는 Fig. 24A와 같고 이 를 이미지 분석 프로그램(image analyzer)로 측정한 결과는 Fig. 24B와 같다.
부고환 지방세포의 크기는 고지방식이군(HFD)이 정상식이군(ND)에 비해 유의 하게 증가하였다. 고지방식이에 증자쌀, 쌀코지, 증자콩 및 콩코지를 첨가한 식이 군들(HFD-R, HFD-RK, HFD-S, HFD-SK)은 고지방식이군(HFD)에 비해 유의하 게 감소하였으며, 특히 콩코지 첨가군(HFD-SK)이 가장 많은 감소를 보였다. 이는 본 연구 중 부고환 지방조직의 무게, 부고환 지방조직의 중성지방 및 총 콜레스테 롤이 고지방식이군(HFD)에 비해 고지방식이에 증자쌀, 쌀코지, 증자콩 및 콩코지 를 첨가한 식이군들(HFD-R, HFD-RK, HFD-S, HFD-SK)에서 감소한 것과 유사 한 결과를 나타냈다. 고지방식이로 인한 지방세포 내에 중성지방의 축적이 증가되 고(72), 증자쌀, 쌀코지, 증자콩 및 콩코지의 섭취로 인해 억제된 것을 확인할 수 있었다. 지방세포의 크기는 leptin 수준과 양의 상관관계가 있다고 알려져 있는데 (73, 74), 본 연구에서도 leptin 수준이 가장 높았던 고지방식이군(HFD)의 부고환 지방세포의 크기가 가장 크게 나타났고, 증자쌀, 쌀코지, 증자콩 및 콩코지를 첨가 한 식이군(HFD-R, HFD-RK, HFD-S, HFD-SK)들의 leptin 함량의 감소와 유사 하게 지방세포의 크기도 감소한 것으로 나타났다.
이미 형성된 지방세포의 수는 식이에 의해 감소되지 않지만 지방세포의 크기는 조절이 가능하다고 알려져 있다(75). 본 연구 결과, 고지방식이로 인해 증가된 지 방세포의 크기가 증자쌀, 쌀코지, 증자콩 및 콩코지의 급여로 인해 지방세포의 크 기가 감소한 것으로 보아 증자쌀, 쌀코지, 증자콩 및 콩코지가 중성지방의 축적을 억제하고, 항비만 효과가 있는 것으로 생각된다.
(A)
ND HFD HFD-R
HFD-RK HFD-S HFD-SK
(B)
Fig. 24. Epididymal representative anatomical views (A) and adipocytes sizesfed a high-fat diet containing steamed rice, rice koji, steamed soybean and soybean koji for 8 weeks. Abbreviations: See the legend of Table 3. Epididymal fat were visualized by H&E staining. The cell area was measured by Image analyzer program (B). The values shown are mean ± S.E (n=10) and
11. 지질대사 관련 mRNA 발현 수준
증자쌀, 쌀코지, 증자콩 및 콩코지를 첨가한 고지방식이를 8주간 급여한 흰쥐의 간 조직에서 RNA를 추출한 후 lipogenic-related enzymes인 ACC, FAS 및 G6PDH의 유전자 발현을 측정한 결과는 Fig. 25～27과 같다.
ACC (Acetyl-CoA carboxylase)는 지질대사가 증가할 때 생성되는 효소로 지방 합성이 활발한 간 또는 지방조직에는 그 양이 많은 반면, 심장, 근육과 같은 조직 에는 그 양이 적은 것으로 보고되어있다(76, 77). ACC는 미토콘드리아에서 지방산 의 산화를 조절하고, acetyl-CoA가 malonyl-CoA로 카르복실화 되도록 촉진하는 효소로서 지방산 합성을 조절하는 주요 속도조절 효소이다(78). 본 연구에서 ACC (Acetyl-CoA carboxylase)의 mRNA 수준은 Fig. 25와 같다. 고지방식이군(HFD) 의 간 조직 중 ACC mRNA 수준이 정상식이군(ND)에 비해 유의적으로 증가하였 고, 고지방식이에 증자쌀, 쌀코지, 증자콩 및 콩코지를 첨가한 식이군들(HFD-R, HFD-RK, HFD-S, HFD-SK)은 고지방식이군(HFD)에 비해 낮은 수준을 보였다.
쌀코지 첨가군(HFD-RK)을 제외한 증자쌀, 증자콩 및 콩코지 첨가군(HFD-R, HFD-RK, HFD-SK)은 정상식이군(ND) 보다도 낮은 수차를 나타내었으며, 그 중 콩코지 첨가군(HFD-SK)가 가장 낮은 수치를 보였다.
FAS (Fatty acid synthase)는 acetyl-CoA와 malonyl-CoA로부터 palmitate의 생합성 반응을 촉매하는 효소로 간에서 합성된 중성지방을 VLDL의 형태로 지방 조직에 전달하는 역할을 하는 것으로 보고되었다(79). 간 조직 중 FAS의 mRNA 발현 수준은 Fig. 26과 같다. 고지방식이군(HFD)의 FAS mRNA 발현이 정상식이 군(ND)에 비해 유의적으로 증가하였다. 고지방식이에 증자쌀, 쌀코지, 증자콩 및 콩코지를 첨가한 식이군들(HFD-R, HFD-RK, HFD-S, HFD-SK)의 FAS mRNA 발현 수준은 고지방식이군(HFD)에 비해 유의하게 감소하였고, 그 중 증자쌀 첨가 군(HFD-R)은 정상식이군(ND)와 비슷한 FAS mRNA 발현 수준을 보였다.
모든 세포 내에서 지방산 합성과 포도당 대사에 관여하는 NADPH는 hexose monophosphate (HMP) shunt의 첫 번째 반응인 glucose-6-phosphate가 6-phosphoglucono lactone으로 산화될 대 NADP+를 NADPH로 전환시키는 과정에 서 생성되는데, 이를 촉매하는 효소인 G6PDH의 효소의 작용이 억제되면 NADPH
간 조직 중 G6PDH의 mRNA 발현 수준은 Fig. 27과 같이 고지방식이군(HFD)의 G6PDH mRNA 발현이 정상식이군(ND)보다 유의적으로 증가한 것을 볼 수 있다.
고지방식이에 증자쌀, 쌀코지, 증자콩 및 콩코지를 첨가한 식이군들(HFD-R, HFD-RK, HFD-S, HFD-SK)의 G6PDH mRNA 발현 수준은 대체적으로 고지방 식이군(HFD)에 비해 감소하는 경향을 보였고, 특히 콩코지 첨가군(HFD-SK)은 정상식이군(ND)의 mRNA 발현 수준과 거의 비슷한 수준을 보였다.
본 연구결과, 지방산 생합성에 영향을 미치는 효소인 ACC, FAS 및 G6PDH는 증자쌀, 쌀코지, 증자콩 및 콩코지를 섭취함으로써 효소의 발현이 감소하는 것으로 나타났다. 이를 통해 증자쌀, 쌀코지, 증자콩 및 콩코지의 섭취가 지방산 생합성을 억제하는 효과가 있는 것으로 보인다.
Fig. 25. The changes of ACC reductase gene expressions in liver.
ACC levels were determined by RT-PCR. Abbreviations: See the legend of Table 3. Values are mean ± S. E. of 10 rats per each group and different superscript letters indicate significant differences at p<0.05 by Tukey's test.
β-actin ACC
Fig. 26. The changes of FAS reductase gene expressions in liver.
FAS levels were determined by RT-PCR. ND: Normal diet, HFD : High fat diet, HFD-R : High fat diet + Steamed rice HFD-RK : High fat diet + Rice koji, HFD-S : High fat diet + Steamed soybean, HFD-SK : High fat diet + Soybean koji.
FAS
β-actin
Fig. 27. The changes of G6PDH reductase gene expressions in liver.
G6PDH levels were determined by RT-PCR. ND: Normal diet, HFD : High fat diet, HFD-R : High fat diet + Steamed rice HFD-RK : High fat diet + Rice koji, HFD-S : High fat diet + Steamed soybean, HFD-SK : High fat diet + Soybean koji.
β-actin G6PDH
제4장 요 약
본 연구진들의 연구결과 고지방식이로 비만유도 된 흰쥐에게 고지방식이와 10%
개량식 쌀고추장 분말을 급여한 흰쥐에게 항비만효과가 있는 것(22)으로 나타나 고춧가루 외에 쌀고추장 제조 시 중요하게 첨가되는 재료인 증자쌀, 쌀코지, 증자 콩 및 콩코지 중 어느 원료 성분이 가장 항비만 및 지질대사 개선효과가 뛰어난지 알아보기 위하여 실시하였다. 먼저 이들 성분의 이화학적 성분 분석 및 대사산물 의 함량을 측정하였고, in vivo에서 Sprague Dawley계 5주령 수컷 흰쥐 60마리를 정상식이군(ND), 고지방식이군(HFD), 고지방식이와 증자쌀 3% 첨가군(HFD-R), 고지방식이와 쌀코지 3% 첨가군(HFD-RK), 고지방식이와 증자콩 3% 첨가군 (HFD-S) 및 고지방식이와 콩코지 3% 첨가군(HFD-SK)으로 나누어 8주간 급여한 후, 흰쥐의 혈청, 간 및 지방조직에서의 지질대사 개선효과와 비만억제효과 및 간 조직 중 지방함성관련 효소인 ACC, FAS 및 G6PDH의 유전자 발현 억제효과를 확인하였다. 이때 첨가한 증자쌀, 쌀코지, 증자콩 및 콩코지 함량은 항비만효과가 나타나 고추장에 첨가되어지는 양을 고려하여 식이에 3% 첨가하였다.
증자쌀, 쌀코지, 증자콩 및 콩코지의 이화학적 성분 분석 결과 일반성분은 건물 량 기준(dry basis) 증자쌀, 쌀코지, 증자콩 및 콩코지 순으로 수분 함량은 3.4%, 5.2%, 1.7%, 3.5%, 탄수화물 함량은 87.2%, 85.2%, 48.4%, 39.9%, 조단백 7.6%, 7.7%, 38.5%, 39.9%, 조지방 함량은 1.4%, 1.4%, 6.9%, 12.4%, 조회분 함량은 0.4%, 0.6%, 4.5%, 4.3% 및 식이섬유 5.4%, 5.6%, 37.3%, 34.3%이었다. 증자쌀, 쌀 코지, 증자콩 및 콩코지의 유리아미노산은 총 23종이 검출되었고, 증자쌀에서는 ㅎ GABA 이외의 아미노산은 검출되지 않았다. 쌀코지에서는 alanine, GABA, methionine 순으 로 높게 나타났고, 콩코지에서는 alanine, phenylalanine,GABA 순으로, 콩코지에서는 phenylalanine, leucine, valine 순으로 높게 나타났다. 증자쌀, 쌀코지, 증자콩 및 콩코지의 주요 지방산은 포화지방산인 palmitic acid가 증자쌀과 쌀코지에서, heneicosanoic acid와 palmitic acid가 증자콩과 콩코지에서 높은 수치로 검출되었으며, 단일불포화지방산인 oleic acid 가 증자쌀, 쌀코지, 증자콩 및 콩코지 모두에서 높은 수치로 검출되었다. 다가불포화지방산에서 는 linoleic acid가 가장 많은 양이 검출되었다.
isofalvone은 증자콩과 콩코지에서 8종 및 콩코지에서 hydroxydaidzein이 추가로 검출되었으며, 증자쌀과 쌀코지에서는 검출되지 않았다. Soyasaponins은 증자콩과 콩코지에서 soyasaponin I～V 총 5종이 검출되었고, lipids는 증자쌀과 쌀코지에서 총 8종, 증자콩에서 4종, 콩코지에서 3종이 검출되었다.
In vivo에서 증자쌀, 쌀코지, 증자콩 및 콩코지의 급여가 고지방식이로 인해 비 만이 유발된 흰쥐의 항비만 효과 및 지질대사 개선에 미치는 영향을 보면 고지방 식이로 인해 체중증가량, 식이섭취량 및 식이효율 모두 정상식이군(ND)에 비해 유 의적으로 증가하였고, 고지방식이에 증자쌀, 쌀코지, 증자콩 및 콩코지를 첨가한 식이군들(HFD-R, HFD-RK, HFD-S, HFD-SK)은 고지방식이군(HFD)에 비해 모 두 감소하는 경향이었다. 체중 100 g당 간 조직, 부고환지방조직, 장간막지방조직, 등지방조직, 신장주위지방조직 및 총 지방조직의 무게는 고지방식이군(HFD)에서 가장 높은 수치를 보였고, 증자쌀, 쌀코지, 증자콩 및 콩코지를 첨가한 식이군들 (HFD-R, HFD-RK, HFD-S, HFD-SK)은 고지방식이군(HFD)에 비해 유의적으로 감소하였다. 혈청 중 ALT와 AST의 활성은 고지방식이군(HFD)이 정상식이군 (ND)에 비해 유의적으로 증가하였으며, 고지방식이에 증자쌀, 쌀코지, 증자콩 및 콩코지를 첨가한 식이군들(HFD-R, HFD-RK, HFD-S, HFD-SK)에서는 고지방식 이군(HFD)에 비하여 유의하게 감소하였다. 혈청 중 ALP와 LDH의 활성 역시 고 지방식이군(HFD)이 정상식이군(ND)에 비해 유의적으로 증가하였으며, 고지방식이 에 증자쌀, 쌀코지, 증자콩 및 콩코지를 첨가한 식이군들(HFD-R, HFD-RK, HFD-S, HFD-SK)은 고지방식이(HFD)에 비해 감소하는 경향을 보였다. 혈청 중 중성지방 및 총 콜레스테롤 함량은 고지방식이군(HFD)에서 가장 높은 수치를 보 였고, 증자쌀, 쌀코지, 증자콩 및 콩코지를 급여함에 따라 고지방식이군(HFD)에 비해 유의적으로 감소하였다. 또한 고지방식이로 인해 증가된 LDL-콜레스테롤 함 량은 증자쌀, 쌀코지, 증자콩 및 콩코지의 급여로 인해 감소하였고, 감소된 HDL-콜레스테롤 함량은 증가하였다. 혈청 중 렙틴의 함량은 고지방식이군(HFD)이 정 상식이군(ND)에 비해 유의적으로 증가하였으며, 고지방식이에 증자쌀, 쌀코지, 증 자콩 및 콩코지를 첨가한 식이군들(HFD-R, HFD-RK, HFD-S, HFD-SK)에서는 유의적으로 감소하는 경향을 보였다. 간 조직 중 총 지질, 중성지방 및 총 콜레스 테롤 함량은 모두 고지방식이군(HFD)이 정상식이군(ND)에 비해 유의적으로 증가
경향을 보였다. 부고환 지방 조직 중 총 지질, 중성지방 및 총 콜레스테롤 함량을 보면, 고지방식이군(HFD)이 정상식이군(ND)에 비해 유의적으로 증가하였다. 고지 방식이에 증자쌀, 쌀코지, 증자콩 및 콩코지를 첨가한 식이군들(HFD-R, HFD-RK, HFD-S, HFD-SK)의 부고환 지방조직 중 중성지방은 고지방식이군(HFD)에 비해 감소하는 경향을 보였으며, 총 콜레스테롤 함량은 정상식이군(ND)과 비슷한 수치 를 보였으나, 총 지질 함량은 고지방식이군(HFD)과 유의차가 없었다. 장간막지방 조직 중 총지질, 중성지방 및 총 콜레스테롤 함량 역시 정상식이군(ND)에 비해 고 지방식이군(HFD)에서 유의적으로 증가하였고, 고지방식이에 증자쌀, 쌀코지, 증자 콩 및 콩코지를 첨가한 식이군들(HFD-R, HFD-RK, HFD-S, HFD-SK)의 장간막 지방조직 중 총콜레스테롤 함량은 고지방식이군(HFD)에 비해 유의적으로 감소하 였으나, 중성지방 함량은 증자콩 첨가군(HFD-S)만 감소하였고, 나머지 증자쌀, 쌀 코지, 콩코지 첨가군(HFD-R, HFD-RK, HFD-SK)들은 유의차가 없었으며, 총 지 질 함량 역시 고지방식이군(HFD)과 유의차가 없었다. 흰쥐의 희생 직후 간의 형 태를 살펴본 결과, 정상식이군(ND)의 간은 선홍빛을 띄었으나, 고지방식이군 (HFD)의 간은 옅은 분홍색을 띄는 것으로 보아 지방의 침착을 육안으로 확인할 수 있었다. 고지방식이에 증자쌀, 쌀코지, 증자콩 및 콩코지를 첨가한 식이군들 (HFD-R, HFD-RK, HFD-S, HFD-SK)은의 간은 고지방식이군(HFD)에 비해 지 방 침착이 적은 것을 확인할 수 있었다. 보다 정확하게 지방축적을 확인하기 위하 여 Oil Red O staining을 진행한 결과, 고지방식이군(HFD)이 정상식이군(ND)에 비하여 간 조직 내 붉은색으로 염색된 lipid droplets이 현저히 많은 것을 관찰할 수 있었고, 고지방식이에 증자쌀, 쌀코지, 증자콩 및 콩코지를 첨가한 식이군들 (HFD-R, HFD-RK, HFD-S, HFD-SK)은 고지방식이군(HFD)에 비해 지방침착이 현저히 감소되었음을 확인할 수 있었다. 흰쥐의 부고환지방세포를 채취한 후 염색 하여 지방세포의 크기를 관찰한 결과, 정상식이군(ND)에 비해 고지방식이군(HFD) 의 지방세포의 크기가 유의적으로 증가하였음을 확인할 수 있었고, 고지방식이에 증자쌀, 쌀코지, 증자콩 및 콩코지를 첨가한 식이군들(HFD-R, HFD-RK, HFD-S, HFD-SK)은 고지방식이군(HFD)에 비해 감소하는 경향을 보였고, 그 중 콩코지 첨가군(HFD-SK)의 지방세포의 크기가 가장 많이 감소한것을 확인할 수 있었다.
간 조직에서 체내 지질대사에 작용하는 효소의 mRNA 유전자 발현을 비교한 결
HFD-RK, HFD-S, HFD-SK)의 mRNA 발현은 고지방식이군(HFD)에 비해 유의 적으로 감소하였다.
이상의 실험 결과 in vivo에서 흰 쥐에게 고지방식이에 고추장원료로 사용되는 증자쌀, 쌀코지, 증자콩 및 콩코지를 첨가하였을 경우 체중증가량, 간 및 내장지방 조직의 무게가 감소하였고, 혈청 중 중성지방, 총 콜레스테롤, LDL-콜레스테롤 및 렙틴 함량이 고지방식이군에 비하여 유의하게 감소하였다. 고지방식이에 증자쌀, 쌀코지, 증자콩 및 콩코지를 첨가한 식이군들의 간 및 지방조직 중 총 지질, 중성 지방 및 총 콜레스테롤 함량이 고지방식이군에 비해 감소하였으며, 간 조직 내 지 질 침착 및 부고환 지방세포의 크기 증가가 고지방식이군에 비해 감소하였다. 또 한 증자쌀, 쌀코지, 증자콩 및 콩코지의 급여로 인해 지방산 생합성에 영향을 미치 는 효소인 ACC, FAS, G6PDH의 mRNA 발현에 긍정적인 영향을 미쳐 지질대사 개선에 효과가 있는 것으로 나타났다. 이러한 결과는 쌀코지 급여군과 콩코지 급 여군 간에는 차이는 없었고, 쌀코지와 콩코지 급여군이 증자쌀과 증자콩 급여군에 비하여 항비만효과와 지질대사 개선효과가 다소 우수한 것으로 나타났다. 이러한 항비만 효과는 증자쌀, 쌀코지, 증자콩 및 콩코지에 함유된 flavonoid, isoflavone, soyasaponin 등의 2차 대사산물의 체지방 형성 억제 및 혈중 콜레스테롤을 저하시 켜 나타난 것으로 생각되어진다. 고추장 원료의 이러한 효능은 현대인의 대사성 질환 및 예방에 기여할 수 있을 것으로 생각되나, 추가적으로 활성 성분의 규명 및 생화학적 작용기전 등의 연구가 이루어져야 할 것으로 사료된다.
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