책임저자：박명희, 서울시 종로구 연건동 28
서울대학교 의과대학 검사의학교실, 110-744 Tel: 02-2072-3388, Fax: 02-3672-3337 E-mail: [email protected]
본 논문의 요지는 2007년 대한이식학회 추계학술대회에서 구연 발표 되었음.
접수일 : 2009년 4월 1일, 게재승인일 : 2009년 6월 1일
신장이식 대기환자의 Panel Reactive Antibody (PRA)에 대한 분석
서울대학교 의과대학 검사의학교실1, 외과학교실2, 서울대학교 의학연구원 장기이식연구소3
주신영1ㆍ하종원2,3ㆍ김상준2,3ㆍ박명희1,3
Analysis of Panel Reactive Antibody in Patients Awaiting Renal Transplantation
Shin Young Joo, M.D.1, Jongwon Ha, M.D.2,3, Sang Joon Kim, M.D.2,3 and Myoung Hee Park, M.D.1,3 Departments of Laboratory Medicine1 and Surgery2, Seoul National University College of Medicine, The Transplantation Research Institute, Seoul National University Medical Research Center3, Seoul, Korea
Background: We performed panel reactive antibody (PRA) tests in renal transplantation candidates registered to the Korean Network for Organ Sharing (KONOS) and analyzed the results of PRA tests in relation to the results of HLA crossmatch (XM) tests and transplantation history.
Methods: From 833 patients awaiting cadaveric renal transplantation in the KONOS registry, 122 (98 patients) XM (NIH or AHG)-positive and 147 (147 patients) XM-negative serum samples were selected for PRA test. Enzyme linked immunosorbent assay (ELISA)-PRA screening test was performed and HLA antibody specificities were identified by NIH and AHG PRA methods.
Results: PRA positive rate was significantly higher in XM-positive group compared with XM-negative group (ELISA-PRA, 70.5% vs. 21.8%; AHG-PRA [PRA ≥10%], 73.9% vs. 9.6%). Donor specific antibodies were defined in 52.5% (64/122), whereas false positive XM results were suspected in 20.5% (25/122) of the XM-positive samples. Patients with transplantation histories showed significantly higher positive rates for ELISA-PRA (78.7% vs. 30.8%) and AHG-XM tests (78.2% vs. 29.3%). Highly sensi- tized patients (AHG-PRA ≥80%) showed significantly higher cumulative waiting rate (88.9% vs. 60.2% at 4 years) and longer waiting time (3.8 vs. 3.6 years) (Kaplan Meier method, P=0.037). PRA positive rate in the total renal transplantation candidates in the KONOS registry was estimated to be 33.9% for ELISA-PRA and 21.7% for AHG-PRA (PRA ≥10%), and the proportion of highly sensitized (PRA ≥80%) patients was estimated to be 5.4%.
Conclusions: Pre-transplantation PRA as a routine test is needed in cadaveric renal transplantation for effective and fair allo- cation of organs in Korea.
Key Words: Panel reactive antibody (PRA), Renal transplantation, Cadaveric donor, Human leukocyte antigen (HLA), Crossmatch 중심 단어: Panel reactive antibody (PRA), 신장이식, 뇌사공여자, Human leukocyte antigen (HLA), 교차시험
서 론
장기이식 환자들이 이식수술을 받기 전에 수혈, 임신, 장기이식 등을 통해 다른 사람의 HLA (human leuko- cyte antigen) 항원에 노출되는 경우 일부 환자에서 동종 면역반응에 의해 HLA 항체를 보유하게 되는데, 이러한 항체는 고형장기이식 시 초급성거부반응(hyperacute re-
jection)의 원인이 된다.(1) 따라서 장기이식, 특히 고형 장기이식 환자에서 공여자의 HLA 항원에 반응하는 HLA 항체 유무의 검출은 매우 중요하다. HLA 항체의 검출을 위해서는 크게 두 가지 방법이 사용되는데, 공여자의 림 프구와 환자의 혈청을 반응시켜서 양성 여부를 판정하는 HLA 교차시험과 여러 명의 림프구 패널과 환자의 혈청 을 반응시켜서 HLA 항체 유무를 선별하고 항체 특이성 을 동정하는 PRA (panel reactive antibody) 검사가 있 다.(2) 생존공여자의 경우 이식 전에 충분한 시간적 여유 가 있으므로 특정 공여자의 HLA 항원에 반응하는 동종 항체가 있는지 확인할 수 있는 HLA 교차시험만으로 충 분하다. 그러나 사체나 뇌사자 장기이식의 경우에는 불 필요한 HLA 교차시험 시간을 줄이고 빠른 시간 안에 적 합한 대상자를 선정하기 위해 PRA 검사를 통해 환자의
Table 1. Number of serum samples (patients) used in this study HLA crossmatch*
Total Positive Negative
ELISA-PRA† Positive Negative Total
86 (66)‡ 36 (32)‡ 122 (98)
32 (32)‡ 115 (115) 147 (147)
118 (98) 151 (47) 269 (245)
*T cell crossmatch by cytotoxicity test, NIH-CDC and/or AHG- CDC methods; †ELISA-PRA screening test for HLA class I anti- bodies; ‡CDC-PRA was tested for 154 serum samples (130 pa- tients). ELISA-PRA positive rate in crossmatch positive vs. negative patients: 67.3% (66/98) vs. 21.8% (32/147), P=9.7×1013. 동종항체 존재 여부와 그 항체 특이성을 미리 확인해 놓
는 것이 필요하다.(2,3) 또한 PRA 검사는 사체 장기이식 대기환자에서 그 지역 일반인구에서 사용 가능한 사체 장기와의 양성 교차반응(positive crossmatch)의 빈도를 반영해 줌으로써 그 환자의 이식 가능성을 예측하고 광 범위하게 감작된 환자의 이식 가능성을 높여 주기 위한 방안을 시행하는 데에도 꼭 필요하다. 외국에서는 PRA 검사를 신이식 대기자에게 실시하여 광범위하게 감작된 경우에는 가산점을 주어(미국 UNOS [United Network for Organ Sharing]에서는 PRA 80% 이상 시 4점 부여) 이들 환자에 대해서 이식 대기시간을 줄이고 이식의 기 회를 높여 주는 노력을 하고 있다.
그러나 국내에서 신장이식을 시행하는 의료기관은 50 기관 이상이지만, PRA 검사를 실시하는 기관은 6개 기관 에 불과하다.(4) 따라서 국립장기이식관리센터(Korean Network for Organ Sharing, KONOS)에 등록하는 모든 신장이식 대기환자를 대상으로 이식 전 PRA 검사 결과 를 등록해 두고 고도로 감작된 환자에 대한 가산점 부여 등에 이용하고 있지 못한 실정이다. 또한 국내에서는 만 성 신부전증 환자나 신장이식 대기환자에서 PRA에 대한 연구도 소수에 불과하여 신장이식 대기환자의 HLA 감작 상태에 대한 기본적인 자료가 부족한 실정이다.(5-7) 본 연구에서는 KONOS에 등록된 국내 신장이식 대기환자의 혈청 검체로 PRA 검사를 시행하여 PRA 결과와 HLA 교 차시험 및 이식력과의 관계를 분석하고, KONOS 전체 대 기환자에서 PRA 양성률을 추정하고자 하였다.
대상 및 방법
1) 연구대상
뇌사공여자로부터 신장이식을 위해 KONOS에 등록 후 2000년 2월부터 2004년 4월까지 이식 후보자로 선정되어 HLA 교차시험을 실시한 1,175명의 환자 중에 T 세포 교 차시험을 NIH (National Institute of Health)법과 AHG (antihuman globulin)법의 두 가지 방법으로 모두 실시 한 833명을 대상으로 하였다. 검체로는 교차시험 양성군 (한 번이라도 교차시험 양성 결과를 보인 적이 있는 환 자)에 속하는 총 220명의 환자 중에 실험에 사용할 수 있 는 충분한 양의 혈청 검체를 확보할 수 있었던 98명의 혈청 122개(한 환자 당 1∼3개; 2개 포함, 10명; 3개 포 함, 7명)와 교차시험 음성군(시행한 모든 교차시험에서 음성 결과를 보인 환자)에 속하는 613명의 환자 중에 무 작위로 선정한 147명의 혈청 147개(한 환자 당 1개)가 포함되었다(Table 1).
전체 269개의 혈청검체를 대상으로 HLA class I항체에 대한 ELISA-PRA (enzyme-linked immunosorbent assay- PRA) 선별검사를 시행하였고, 이 중에 양성으로 판정된 검체 118개와 ELISA-PRA 선별검사에서는 음성결과를 보 였으나 HLA 교차시험에서 양성결과를 보였던 검체 36개 를 합해 총 154개의 혈청 검체(130명 환자)를 대상으로 CDC-PRA (complement dependent cytotoxicity-PRA)검 사를 NIH법, AHG법으로 시행하고 HLA 항체특이성을 동정하였다. 신장이식 대기환자의 임상자료 및 검사자료 는 KONOS로부터 협조 받아 분석에 이용하였다. KONOS 자료 중에 1) 환자의 이식대기자 등록일, 2) 과거 신장이 식 여부 및 이식일, 3) KONOS에 등록 후 신장이식 여부 및 이식일, 4) 뇌사공여자와 HLA 교차시험 결과, 5) 환자 와 공여자의 HLA-A, B, DR 형별 정보 등을 분석에 이용 하였다. 본 연구에 포함시킨 대상환자 총 245명(교차시 험 양성군 98명, 음성군 147명) 중에 과거 신장이식력이 있는 환자는 47명(교차시험 양성군 38명, 음성군 9명)이 었으며, KONOS 등록 후에 신장이식을 받은 환자는 88명 (교차시험 양성군 30명, 음성군 58명)이었다.
2) 연구방법
(1) ELISA-PRA 검사: HLA class I항체 유무를 선별하 기 위한 ELISA-PRA 검사는 QuikScreen Solid Phase HLA Antibody Screening kit (GTI, Brookfield, USA)를 이용 하여 제조회사의 지침에 따라 시행하였다. 실온에서 안 정화시킨 ELISA plate를 세척액으로 한 번 세척한 후 검 체희석액으로 1：2 희석시킨 혈청 검체를 100 μL씩 분 주했다. 커버를 씌우고 37oC에서 30∼35분간 반응시킨 후 세척액으로 3회 세척하였다. 검체희석액으로 1：100 희석한 anti-human IgG conjugate를 50 μL씩 모든 well 에 분주하고 37oC에서 30∼35분간 반응시켰다. 다시 3회 세척한 후 기질(p-nitrophenyl phosphate)를 첨가하여 실
온 암소에서 30분간 반응시키고, ELISA stopping sol- ution을 가한 후 405 nm에서 흡광도를 측정하였다. 결과 판독은 cutoff 흡광도(음성대조 흡광도 평균의 2배 값)에 대한 검체 흡광도 비(OD ratio)를 구한 후 1.0 이상인 경 우를 PRA 양성으로 판정하였다.
(2) CDC-PRA 검사
① 혈청 tray의 제조: CDC-PRA 검사를 위한 혈청 검 체를 Terasaki plate (72 well)에 분주하여 혈청 tray를 제조한 후 70oC에 냉동보관 하였다가 검사 시에 해동하 여 준비된 림프구 패널을 반응시키는 방법으로 검사를 진행하였다.(5,8) 매 tray에는 검사대상 혈청 70개와 양성 대조 및 음성대조 혈청 각 1개씩이 포함되도록 준비하였 고, 각 well에 혈청을 1 μL씩 분주한 후에 그 위에 5 μL 의 mineral oil을 분주하였다. 한 종류의 tray 당 50명의 림프구 패널에 대해 각각 NIH법과 AHG법으로 검사할 수 있도록 100장씩 준비하였고, 실제로 46명의 패널에 대해 검사를 진행할 수 있었다.
② 림프구 패널: 림프구 패널은 일부는 당일에 채혈한 공혈자 전혈에서 Ficoll-Hypaque법으로 림프구를 분리하 여 사용하였고, 일부는 냉동보관된 림프구를 해동하여 사 용하였다. 림프구 패널은 46개를 사용하였고, HLA-A, B 형별은 혈청학적 방법 또는 DNA (sequence-specific oli- gonucleotide, SSO) 방법으로 확인된 검사결과를 이용하 였다. 한국인의 HLA-A, B 항원 중 1% 이상의 표현형 빈 도를 보이는 항원이 모두 포함되면서, 한국인의 항원 빈 도를 잘 반영할 수 있도록 구성하였다.(5,8)
③ NIH-PRA 및 AHG-PRA 검사방법: 준비된 림프구는 최종 세포수를 2∼3×106/mL로 맞춘 후 대상 환자의 혈 청이 분주된 Terasaki plate를 해동하여, NIH 및 AHG 검 사용 tray의 각 well에 림프구 부유액을 1 μL씩 분주하 였다. NIH 검사법에서는 실온에서 30분간 반응시킨 후에 토끼보체(Class I rabbit complement, One Lambda, Ca- noga Park, USA) 5 μL를 넣고 실온에서 60분간 반응시 켰다. AHG 검사법에서는 실온에서 60분간 반응시킨 다 음 5 μL의 IMDM (Iscove's modified Dulbecco's me- dium) 배지로 3회 세척하였다. 그 후에 항인글로불린(anti- human kappa chain, Helena Laboratories, Beaumont, USA) 1：100 희석액을 1 μL씩 넣고 실온에서 2분간 반 응시킨 후, 5 μL의 토끼 보체를 넣고 실온에서 2시간 반 응시켰다. 각 검사법에서 항원-항체 반응과 보체 반응이 종료된 다음에 5% eosin Y 2 μL를 넣고 5분간 염색한 후 formalin (pH 7.2) 7 μL를 넣어 고정하고 커버글라스 를 덮은 후 위상차 현미경으로 관찰하였다.
④ PRA 결과의 해석: ASHI (American Society for
Histocompatibility and Immunogenetics) 기준에 따라 1 점(세포독성 0∼10%), 2점(11∼20%), 4점(21∼50%), 6 점(51∼80%), 8점(81∼100%)으로 점수를 부여하고, 4점 이상인 경우를 양성 반응으로 판정하였다.(9) 전체 46개 의 패널 중 양성 반응을 보인 패널이 차지하는 비율을 계산하여 PRA 백분율(%)을 구하고, 10% 이상인 경우를 PRA 양성으로 간주하였다.(10,11)
PRA 검사 결과 1개 또는 그 이상의 패널에서 양성 반 응이 관찰되는 경우 HLA 항체 특이성을 분석하였으며, 이를 위해 꼬리분석(tail analysis) 방법을 이용하였다.(12) HLA 항체 특이성의 분석에는 기본적으로 환자 자신이 갖 고 있는 항원에 대한 항체는 갖고 있지 않다는 가정 하에 환자 자신의 HLA-A, B 형별을 고려하여 판정하였고, 그 외에 교차시험을 실시한 뇌사공여자의 HLA-A, B 형별과 교차시험 결과도 참조하였다. PRA%가 높은 경우, 교차반 응그룹(cross reactive epitope group, CREG)도 고려하여 분석하였다.(11,13-15) HLA 항체의 특이성은 해당 HLA 항원 유무와 양성반응 유무에 따라 2×2 table을 작성하 고, Chi-square test에 의한 상관계수 r값을 산정하여 판정 하였다.(16) HLA 항체의 분석은 꼬리분석에서 해당 HLA 항원이 양성인 패널의 50% 이상에서 양성 반응을 보이고 (inclusion ≥50%), 상관계수 r이 0.5 이상일 때 해당 HLA 항원에 대한 항체 특이성이 있다고 판정하였다.
(3) 통계분석: HLA 교차시험과 PRA 검사의 관계를 확 인하기 위해 2×2 table을 이용한 카이제곱검정(chi-square test)을 양측분석으로 시행하였고, HLA 감작상태와 과거 이식력 및 이후 이식 대기시간과의 관계는 카이제곱검정과 카플란 마이어 법(Kaplan Meir method) 및 로그순위검정 (log rank test)를 이용하여 분석하였다. 통계적 유의성은 P＜0.05로 판정하였고, 통계프로그램은 SPSS (version 12.0)와 Excel (Microsoft Office 2000)을 사용하였다.
결 과
1) HLA 교차시험과 ELISA-PRA 선별검사 결과의 비교 전체 연구 대상 269개 혈청에 대해 ELISA-PRA 선별검 사를 시행하고, HLA 교차시험 결과에 따른 ELISA-PRA 선별검사의 양성률을 비교하였다(Table 2). ELISA-PRA 양성률은 NIH 교차시험 양성군에서 음성군에 비해 유의 하게 높았고(75.9% vs. 28.6%, P=5.2×1013), AHG 교차 시험에서도 양성군에서 음성군에 비해 유의하게 높았다 (72.3% vs. 21.3%, P=1.2×1016). ELISA-PRA 선별검사 와 교차시험 결과의 양성/음성 일치율은 NIH, AHG 교차 시험에서 각각 72.9%, 75.8%로 모두 70% 이상의 일치율
Table 2. Comparison of HLA crossmatch (XM) and ELISA-PRA results (269 serum samples) ELISA-PRA
Concordance X2 P
Positive (n=118) Negative (n=151) NIH-XM
Positive (n=87) 66 (75.9%)* 21 (24.1%)* 196/269 53.461 5.2×1013
Negative (n=182) 52 (28.6%) 130 (71.4%) (72.9%)
AHG-XM
Positive (n=119) 86 (72.3%) 33 (27.7%) 204/269 69.916 1.2×1016
Negative (n=150) 32 (21.3%) 118 (78.7%) (75.8%)
NIH- &/or AHG-XM
Positive (n=122) 86 (70.5%) 36 (29.5%) 201/269 64.275 1.2×1015
Negative (n=147) 32 (21.8%) 115 (78.2%) (74.7%)
*ELISA-PRA positive or negative rate in CDC-XM positive and negative groups.
Table 3. Identification of HLA antibody specificity by CDC-PRA from 122 HLA crossmatch (XM) positive serum samples
HLA Ab specificity* XM by NIH/AHG
Ab DSA +/+ /+ +/ n %
Defined Confirmed 45 10 0 55 45.1
Probable 6 3 0 9 7.4
Defined Not defined 5 2 0 7 5.7 (0% ＜ Inclusion†＜50%) 3 2 0 5 4.1 (Inclusion 0%) 2 0 0 2 1.6
Not Not defined 28 20 3 51 41.8
defined (0% ＜ Inclusion ＜50%) 19 9 0 28 23.0 (Inclusion 0%) 9 11 3 23 18.8 Abbreviations: Ab, antibody; DSA, donor specific antibody.
*Antibody specificities detected by NIH-PRA and/or AHG-PRA methods; †Proportion of positive panels out of total panels with corresponding HLA antigen.
Table 4. Estimation of PRA positive rate by ELISA screening test in patients registered to the KONOS for kidney transplantation (n=833)
XM positive* (n=220) XM negative* (n=613)
ELISA-PRA n %† n %†
Positive‡ 148 67.4 134 21.8
Negative 72 32.6 479 78.2
Total 220 100.0 613 100.0
*crossmatch (XM) positive by NIH- and/or AHG-CDC, and cross- match negative by both methods; †the proportion of ELISA-pos- itive and ELISA-negative patients obtained from this study (XM positive, n=98; XM negative, n=147) was used for the estimation of the number of each category of patients in the KONOS registry;
‡estimated ELISA-PRA positive rate of the patients in the KONOS registry, 33.9% (282/833).
을 보였다. 또한 CDC-PRA (10% 이상 시 양성)와 교차시 험 결과의 양성/음성 일치율도 NIH, AHG 교차시험에서 각각 72.1%, 77.9%로 모두 70% 이상의 일치율을 보였다.
2) HLA 항체와 공여자 특이 항체의 동정
HLA 교차시험 결과 양성을 보인 122개 혈청 검체에 대해 CDC-PRA로 동정된 HLA 항체 특이성을 토대로 공 여자 특이 항체(donor specific antibody, DSA) 여부를 판단하였다. 교차시험 양성을 보인 122건 중 64건(52.5%) 에서 HLA 항체 특이성이 DSA로 확인되거나 DSA일 가 능성이 높다고 생각되었다(Table 3). 나머지 58건(47.5%) 에서는 DSA를 확인할 수 없었는데, 그 중 25건(20.4%)에 서는 교차반응 때 사용된 공여자 HLA 항원과 같은 항원 을 가지는 림프구 패널에 대한 반응률(inclusion)이 0%를 보여 기왕의 교차시험이 위양성일 가능성이 높다고 생각 되었다. 이 중에는 공여자와 환자의 HLA 형별이 완전히 일치하거나 부적합 항원이 0개(0 mismatch)인 예가 2예
(1.6%) 포함되어 있었다.
3) KONOS 신장이식 대기환자에서 PRA 양성률 추정 신장이식을 위해 KONOS에 등록된 후 2000년 2월부터 2004년 4월까지 이식 후보자로 선정되어 HLA 교차시험 을 실시한 1,175명의 환자 중에 NIH법과 AHG법의 두 가지 방법으로 모두 교차시험을 실시한 833명을 전체 신 장이식 대기환자로 간주하여 ELISA-PRA와 CDC-PRA 양 성률을 추정하였다(Table 4, 5). 833명의 전체 KONOS 대기환자 중 교차시험 양성군에 220명(26.4%), 음성군에 613명(73.6%)이 속하였다. 본 연구에서는 교차시험 양성 군 98명, 음성군 147명에 대해 ELISA-PRA 검사를 실시하 고 그 결과로부터 추정한 전체 KONOS 대기환자의 ELISA- PRA 양성률은 33.9% (282/833)이었다(Table 4).
ELISA-PRA 검사를 실시한 환자 중에서 CDC-PRA 검사 는 HLA 교차시험 양성군 98명에 대해서는 모두 실시하 였으며, 음성군 147명 중에는 ELISA-PRA 양성 결과를 보
Table 5. Estimation of PRA positive rate by NIH-CDC and AHG-CDC method in patients registered to the KONOS for kidney trans- plantation (n=833)
XM positive* (n=220) XM negative* (n=613) Total (n=833)
PRA% n %† n %† n‡ %‡
by NIH method
0.0 79 35.7 567 92.5 646 77.6
1.0∼9.9 22 10.2 21 3.4 43 5.2
10.0∼100 119 54.0 25 4.1 144 17.3
20.0∼100 106 47.9 13 2.1 119 14.3
50.0∼100 58 26.5 4 0.7 62 7.4
80.0∼100 16 7.1 0 0.0 16 1.9
by AHG method
0.0 31 14.3 521 85.0 552 66.3
1.0∼9.9 56 25.5 42 6.8 98 11.8
10.0∼100 132 60.1 50 8.1 182 21.8
20.0∼100 121 55.0 24 4.0 145 17.4
50.0∼100 83 37.7 12 2.0 95 11.4
80.0∼100 45 20.4 0 0.0 45 5.4
*crossmatch (XM) positive by NIH- and/or AHG-CDC, and crossmatch negative by both methods; †the proportion of patients belonging to each category of PRA% obtained from this study (XM positive, n=98; XM negative, n=147) was used for the estimation of the number of each category of patients in the KONOS registry; ‡calculated from the estimated number of patients in the KONOS registry
Table 6. Relationship between ELISA-PRA results and previous or later kidney transplantation
ELISA-PRA
Positive (n=98) Negative (n=147)
n % n % X2 P
Previous transplantation Yes (n=47) No (n=198)
37 61
(78.7%) (30.8%)
10 137
(21.3%) (69.2%)
36.336 3.4×109 Later transplantation
Yes (n=88) No (n=157)
32 66
(36.4%) (42.0%)
56 91
(63.6%) (58.0%)
0.757 0.77 인 32명에 대해서만 실시하고 음성 결과를 보인 115명은
CDC-PRA 음성(0%)으로 간주하였다. CDC-PRA 검사가 시행된 130명의 결과로부터 KONOS 전체 대기환자 833 명의 CDC-PRA양성률을 추정하였다(Table 5). 전체 대기 환자 중 NIH-PRA와 AHG-PRA에서 PRA 10% 이상의 양 성결과를 보이는 환자는 각각 17.3% (144/833), 21.8%
(182/833)로 추정되었고, PRA 80% 이상의 광범위한 감 작상태를 보이는 환자는 각각 1.9% (16/833), 5.4% (45/
833)로 추정되었다.
4) HLA 감작상태와 신장이식력의 관계
(1) 이전 신장이식력과 HLA 감작상태의 관계: ELISA- PRA 검사를 실시하였던 245명의 환자에 대해 과거 신장 이식력 유무와 ELISA-PRA 양성 여부의 연관성을 분석해 본 결과 과거 이식력이 있는 환자(47명, 19.2%)에서는 이식력이 없는 환자(198명)에 비해 ELISA-PRA 선별검사 양성률이 유의하게 높은 것으로 나타났다(78.7% vs 30.8%, P=3.4×109) (Table 6).
(2) HLA 고도감작과 이후 신장이식의 관계: ELISA-PRA 검사를 실시하였던 245명의 환자에 대해 분석한 결과, 연구 기간(2000년 2월∼2004년 4월) 내에 이식을 받은 환자가 88명(35.9%)이었는데 신장이식을 받은 환자에서 신장이식을 받지 못한 환자에 비해 ELISA-PRA 양성률이 낮은 경향을 보이기는 했으나 통계적으로 유의한 차이는
아니었다(36.4% vs. 42.0%, P=0.77) (Table 6).
한편, CDC-PRA (AHG-PRA)에서 PRA%가 80% 이상인 환자군(20명)과 80% 미만인 환자군(110명)을 비교한 결 과, 신장이식 대기시간에서 유의한 차이가 있는 것으로 나타났다. PRA 80% 이상으로 광범위하게 감작된 환자에 서는 그렇지 않은 환자에 비해 4년째 누적대기율(88.9%
vs. 60.2%)이 높았고, 평균 대기기간(3.8년 vs. 3.6년)도 길었다(Kaplan-Meir 방법, P=0.037) (Fig. 1).
고 찰
PRA 검사방법으로 현재 사용되는 방법은 크게 살아
Fig. 1. Waiting time for kidney transplantation in relation to PRA (AHG-PRA) values. Cumulative waiting rate at 4 years, PRA ≥ 80% vs. PRA ＜80%: 88.9% vs. 60.2%; Mean waiting time, PRA
≥80% vs. PRA ＜80%: 3.8 years vs. 3.6 years (Kaplan-Meier method, P=0.037).
있는 림프구를 사용하는 방법과 ELISA plate의 well이나 플라스틱 비드 표면에 가용성의 HLA 항원을 부착시켜 사용하는 방법으로 대별된다.(2,17) 살아 있는 림프구를 사용하는 방법으로는 고전적인 보체의존성 림프구독성법 (CDC-PRA)과 유세포분석법(flow-PRA)이 있으며 검사실 에서 림프구 패널을 준비하여 검사가 가능하다. 가용성의 HLA 항원을 사용하는 방법으로는 효소면역측정법(ELISA- PRA)과 flow-PRA가 있으며 최근에는 HLA class I 및 class II 항체를 각각 선별하고 동정할 수 있는 상품 kit가 시판 되어 손쉽게 검사할 수 있게 되었다. 이 중에 본 연구에 서는 KONOS에 등록된 신장이식 대기환자를 대상으로 HLA class I 항체의 선별 및 동정을 위하여 ELISA-PRA 선별검사와 CDC-PRA 검사를 이용하였다. CDC-PRA 검 사는 패널 확보의 어려움, 림프구 동결 및 해동의 어려 움, 세포독성 판단의 주관성, 검사실간 표준화의 어려움 때문에 보다 간편하게 HLA 항체를 선별하는 검사의 필 요성이 제기되었다.(18,19) ELISA-PRA 검사는 살아있는 림프구를 사용하는 대신 분리된 HLA 항원을 well 바닥에 고정하여 항원항체 반응을 발색반응으로 확인하기 때문 에 림프구 패널 확보나, 림프구 생존도, 판독의 주관성, 검사실 표준화 등의 문제를 해결할 수 있다. 또한 선별검 사 외에도 수십 명의 패널로부터 추출한 HLA 항원을 부 착시킨 각 well의 반응을 종합하여 판정함으로써 HLA 항 체 동정과 PRA%의 산출이 가능하여, CDC-PRA를 대치하 여 사용할 수 있는 것으로 알려졌다. 그러나 현재 국내에 수입되어 사용되는 ELISA-PRA kit는 외국인 패널로 구성 되어 한국인의 HLA 분포와 상당한 차이가 있으므로 PRA
동정검사에서 한국인에 맞는 실제적인 PRA%를 반영하지 못하는 문제점이 있다.(3) 하지만 PRA 선별검사 목적으 로는 편리하게 이용할 수 있고, 한국인에서도 선별검사로 이용하는 데에는 별 문제가 없다고 생각된다.
본 연구에서 HLA 교차시험 양성을 보인 122개의 혈청 검체에 대해 CDC-PRA 검사를 실시한 결과 반 이상의 검 체(71/122, 58.2%)에서 HLA 항체 특이성을 동정할 수 있 었고, 항체 특이성이 동정된 예의 대부분(64/71, 90.1%) 에서 공여자 특이 항체가 확인되거나 공여자 특이 항체 일 가능성이 높은 것으로 생각되었다(Table 3). 그러나 교차시험 양성이었던 검체 중에 약 1/5 (25/122, 20.4%) 에서는 공여자 항원이 포함된 패널에 대한 양성반응 (inclusion)이 0%인 것으로 보아 기왕의 교차시험이 위양 성일 가능성이 제기되었으며, 이 중 공여자와 환자의 HLA 형별이 완전히 일치했던 예와 부적합 항원이 0개(zero mismatch)였던 예도 각각 1예씩 있었다. 교차시험이 전 국의 여러 기관에서 시행되었고, 세포독성 강도나 기타 검사에 관한 다른 정보가 없기 때문에 원인 추정이 어렵 지만, 이들 교차시험은 비 HLA 항체나 기술적 문제에 의 한 위양성 결과로 생각된다. 따라서 PRA 검사결과를 미 리 안다면 불필요한 교차시험을 줄이고, HLA 교차시험 결 과의 해석과 임상적 판단에 도움을 받을 수 있을 것이다.
신장이식 대기환자 또는 말기신부전증 환자에서 PRA 양성률은 검사방법이나 환자의 수혈력, 임신력, 이식력 유무 등에 따라 달라진다.(20,21) 외국에서 보고된 신장 이식 대기환자의 PRA 양성률을 살펴보면 1985년 이후 수혈이 줄어들면서 약 10년의 기간에 걸쳐 점차 감소하 는 경향을 보였다. 미국 UNOS의 경우 신장이식 대기환 자 중에 PRA 20% 이상인 환자가 1988년 41.2%에서 해마 다 감소를 보여 1994년에는 25.5%로 감소되었다.(22,23) 그 이후의 추이를 보면 PRA 10% 이상인 환자와 80% 이 상의 고감작 환자의 비율이 각각 1996년에 42.3%와 15.6%, 2005년에 35.9%와 15.1%로 최근 10년간은 큰 변화가 없 는 것으로 나타났다.(24) 본 연구에서는 이에 비해서는 낮아 KONOS에 등록된 신장이식 대기환자 중에 AHG-PRA 10% 이상이 21.8% (182/833), 20% 이상이 17.4% (145/
833), 80% 이상이 5.4% (45/833)로 추정되었다(Table 5).
한편, 국내에서 신장이식이 시행된 환자에서 이식 전 PRA 양성률은 AHG-PRA (PRA＞0%) 7∼19%, HLA class I ELISA-PRA 15%로 보고되어,(6,7,25) 본 연구에서 KONOS 신장이식 전체 대기환자에서 추정한 양성률(Table 4, 5) 인 AHG-PRA 21.8% (182/833)와 ELISA-PRA 33.9% (282/
833)에 비해 낮았다. 이러한 차이는 HLA 항원에 감작되 어 이식 전 교차시험에서 양성으로 나온 환자는 이식에
서 제외되었기 때문으로 생각된다. 그 외에도 검사법의 예민도 차이와 단일기관의 환자 구성과 전국적인 대기환 자의 환자 구성에서 수혈력이 있는 환자의 비율이 상당 한 차이가 있을 가능성을 생각해 볼 수 있겠다. 본 연구 에서 KONOS에 등록된 신장이식 대기환자 중에 과거 이 식력이 있는 환자는 21.8% (182/833)로 UNOS 자료(1998 년, 19.9%)와 유사한 수준이었다.(26) 고형장기 이식 환 자 중에 과거 이식력이 있는 환자는 일차 이식 환자에 비해 HLA 항원에 감작되어 있을 가능성이 높다. 본 연구 에서도 이를 확인할 수 있었는데, 과거 이식력이 있는 환 자는 없는 환자에 비해 ELISA-PRA 양성률이 유의하게 높 았다(78.7% vs. 30.8%, P=3.4×109).
HLA 동종면역 반응으로 HLA 항체를 갖고 있는 환자 는 뇌사공여자가 발생하여 이식대상자 후보로 선정된 경 우에도 공여자와의 HLA 교차시험에서 양성 반응이 나와 이식을 받지 못할 가능성이 높다. 특히 HLA 항원에 광범 위하게 감작되어 높은 PRA를 보이는 경우 HLA 교차시험 음성인 공여자를 만날 기회가 매우 낮아져 이식을 받을 가능성이 떨어지고 이식 대기시간이 길어지게 된다. UNOS 에서 이식 대기자의 대기시간을 연장시키는 인자에 대해 36개 변수를 분석한 결과, 80% 이상의 high PRA가 가장 강력한 인자였다.(27) 실제로 1994년에 등록된 환자의 경 우 PRA% 값에 따른 이식 대기시간을 보면 PRA ＜20%, 606일; PRA 20∼79%, 1316일; PRA ≥80%, 2365일로 나 타났고, PRA 80% 이상이거나 2회 이상 거부반응의 과거 력이 있는 환자에서는 이식 대기시간이 수년 정도로 길 어지는 것으로 나타났다.(28) 본 연구에서도 CDC-PRA가 시행된 130명의 환자를 분석한 결과, PRA 80% 이상 군 과 80% 미만 군에서 신장이식 대기율과 대기시간이 유의 하게 다른 것을 확인할 수 있었다(4년째 누적대기율 88.9%
vs. 60.2%; 평균대기시간 3.8년 vs. 3.6년) (Fig. 1). 이 때 KONOS 점수 항목들 중에서 HLA match 정도를 제외 한 이식대기시간, 과거 교차시험 양성여부, 과거 이식력 으로 산출한 평균 점수를 비교한 결과 두 군에서 유의한 차이가 없어 이들 항목에 의한 교란변수 효과는 배제할 수 있었다. 이는 KONOS가 설립된 이후 2000년 2월부터 2004년 4월까지 수집된 자료에서 얻어진 결과로 이후 추 적 대상과 추적 기간을 늘리면 보다 확연한 차이를 확인 할 수 있을 것으로 기대된다.
고도로 감작되어 높은 PRA를 보이는 환자들에서 이식 대기시간이 길어지는 문제를 해결하기 위해 다양한 시도 가 이루어지고 있고, 그 중 한 가지 방법으로 HLA 일치 시 가산점을 주어 우선적으로 이식하는 방안이 제시되었 다.(29-31) 미국 UNOS에서는 신장이식 대기자 중 80%
이상의 PRA를 보이는 환자에게는 가산점을 주어 HLA 교 차시험 음성인(HLA 일치도가 높은) 공여자가 나타나는 경우 이식신이 우선적으로 배정되도록 하는데 도움을 주 고 있다.(32) 즉, 이식대상자 선정에서 적용하는 점수제 에서 최고점 7점 중에 HLA 적합성 2점, 대기시간 1점, high PRA (PRA ≥80%) 4점으로 구성되어 high PRA를 보이는 환자가 우선적으로 선정되는데 도움을 주고 있 다. 그러나 국내에서는 신장이식을 시행하는 의료기관은 50기관 이상이지만, PRA 검사를 실시하는 기관은 6개 기 관에 불과하여,(4) PRA 검사결과를 점수제에 적용하지 못하고 있는 실정이다. KONOS에서는 고도로 감작된 환 자를 위해 high PRA 대신에 과거 2회 이상 교차시험 양 성이거나 과거에 1∼2회의 신장이식 과거력이 있는 경우 에 가산점을 주는 방안을 채택하여 사용하고 있다. 즉, 이식대상자 선정 점수제에서 최고점 10점 중에 HLA 적 합성 4점, 대기시간 4점, 교차시험 2회 이상 양성이거나 또는 신장이식 과거력 1∼2회가 있는 경우 2점을 부여하 고 있다.(33) 그러나 이러한 간접적인 방법을 사용하기보 다는 PRA 검사를 KONOS 등록사항에 필수사항으로 채 택하여 그 결과를 활용하는 것이 꼭 필요하다고 생각된 다. 즉, 신장이식 대기환자에 대해 정기적으로 PRA 검사 를 실시하고 그 결과를 KONOS 데이터베이스에 입력함 으로써 이식대상자 선정 과정에서 불필요한 교차시험을 줄이고 고감작된 환자의 이식기회를 높여 주어 공정한 장기 분배가 이루어질 수 있도록 하는 것이 필요하다고 생각된다.
감사의 글
본 논문은 2006년도 서울대학교병원 일반연구과제 연 구비(04-2006-075) 지원으로 이루어졌음.
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