LPS로 유도된 RAW 264.7 세포에 대한 오디 발효액의 항산화 및 항염증 효과
최영주․박미화․김미향․정경임 신라대학교 의생명과학대학 식품영양학과
Antioxidant and Anti-Inflammatory Effects of Mulberry (Morus alba L.) Fermented Liquid in LPS-Induced RAW 264.7 Cells
Young Ju Choi, Mi Hwa Park, Mi Hwang Kim, and Kyung Im Jung Department of Food and Nutrition, College of Medical Life Sciences, Silla University
ABSTRACT Mulberry (Morus alba L., oddi) is one of the most popular functional foods with many physiological ingredients. The purpose of this study was to investigate the free amino acid content, antioxidant, nitrite scavenging activity, alcohol metabolism effects, and anti-inflammatory effects of mulberry fermented liquid (MFL). The pH of MFL was 3.09 and sugar content was 54.16°Brix. The main free amino acids of MFL were phosphoserine and γ- aminobutyric acid. The total phenol content of MFL was 2.67 mg tannic acid equivalents/mL. 1,1-Diphenyl-2-picrylhy- drazyl radical scavenging activity of MFL was increased in a dose-dependent manner (P<0.05), which was 99.14%
at 5% concentration. Superoxide dismutase activity of MFL was 85.07% at 10% concentration. Influences of MFL on alcohol metabolizing activity were determined by measuring the generation of reduced nicotinamide adenine dinucleo- tide by alcohol dehydrogenase (ADH) and acetaldehyde dehydrogenase (ALDH). ADH and ALDH activities of MFL were 160.08% and 148.70% at 10% concentration, respectively. Nitric scavenging activities of MFL were 78.72%, 62.71%, and 42.86% at pH values of 1.2, 3.0, and 6.0 at 20% concentration, respectively. Moreover, MFL decreased the levels of radical oxygen species production and pro-inflammatory cytokine, such as interleukin-1β in lipopoly- saccharide-stimulated RAW 264.7 cells. These results suggest that mulberry fermented liquid may have the potential to be a source for natural health products.
Key words: mulberry (Morus alba L.), fermentation, alcohol dehydrogenase, antioxidant, anti-inflammatory
Received 24 July 2018; Accepted 29 August 2018
Corresponding author: Kyung Im Jung, Department of Food and Nutrition, College of Medical Life Science, Silla University, Busan 46958, Korea
E-mail: [email protected], Phone: +82-51-999-7618
서 론
뽕나무과(Moraceae)에 속하는 낙엽교목으로 6~10 m까 지 자라는 뽕나무(Morus alba L.)는 온대에서 아열대까지 넓은 지역에 서식하는데, 주로 동아시아 지역에서 많이 재배 되고 있으며(1) 우리나라에서도 전역에 분포하고 있다(2).
뽕나무의 열매인 오디(mulberry)는 5월에서 6월에 걸쳐 과 실이 자홍색 또는 검은색을 띨 때 채취하여 식용하거나 건조 한 후 한약재로 사용되고 있다(3). 한방에서 ‘상심자’라고 불리는 오디는 동의보감에서 ‘오장을 편안하게 하고 오래 먹으면 백발이 검게 변하며 노화를 예방한다’고 기록되어 있다(4). 오디의 주요성분은 과당과 포도당, 탄닌, 사과산, 시트르산 및 펙틴이며, 미량성분으로는 비타민 A와 비타민 B1, 비타민 B2, 비타민 D 및 철, 인, 칼슘 등이 있다(5). 또한 오디는 항산화 물질인 anthocyanin 색소를 다량 함유하고
있을 뿐만 아니라 항당뇨 성분인 moracin 유도체와 항노화 성분인 dihydroquercetin, 항고혈압 성분인 rutin 및 항고지 혈증, 항염증, 항암, 피부탄력증진물질로 알려진 resvera- trol을 함유하고 있어 인체에 무해한 천연 색소 및 웰빙건강 식품으로 각광받고 있다(6,7). 그러나 오디는 높은 수분함량 으로 수확작업이 어렵고 쉽게 물러질 뿐만 아니라 부패가 용이하고 저장성이 떨어져 생과로서의 이용이 불안정하므 로 오디를 이용한 다양한 제품으로의 적용이 요구되고 있다 (8). 지금까지 오디를 이용한 식품에 관한 연구로는 오디를 첨가한 샐러드드레싱(9), 오디를 첨가한 설기떡(10), 오디를 첨가한 술(11-13) 및 오디를 첨가한 파운드케이크(14)와 약과(15) 등의 과자류 등이 있으며, 당침출액 및 발효액에 관한 연구로는 간세포 보호효과(16)와 품질 특성(17) 및 발 효기간에 따른 식중독 세균수 변화(18)에 관한 연구가 이루 어져 있으나 오디 발효액의 항산화 활성과 알코올 대사효소 활성 및 항염증 효과에 관한 연구는 미비한 실정이다.
Apoptosis는 세포의 내부 및 외부의 다양한 신호에 의해 진행되어 여러 단계를 거쳐서 일어나는 자가세포사멸 과정 으로(19) 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)과 많은 관련이 있다고 보고되고 있다(20). 세포 대사과정에서
생성되는 ROS는 생성 즉시 불활성화되지만 산화-환원 균 형이 깨지게 되면 세포손상이 유발되는데, 과량의 ROS는 산화적 스트레스를 일으켜서(19) 노화와 퇴행성 신경계 질 환, 당뇨 및 합병증 등 다양한 질환을 일으키게 된다(21).
따라서 이로 인해 발생할 수 있는 피해를 감소시키기 위하여 경제성을 갖는 천연 항산화제의 개발 연구가 활발히 이루어 지고 있다(22).
한편 외부 자극에 대한 신체의 방어기작인 염증 반응은 외 부로부터 발생한 화학적 및 물리적 자극에 따른 신체 손상을 회복시키려는 기작으로(23) 염증 반응에 관여하는 대식세포 는 염증성 매개물질인 interleukin(IL)-1β, IL-4, IL-6와 같 은 pro-inflammatory cytokine 등을 생성한다(24). 이와 같 은 염증 매개 인자가 과다하게 발현되면 만성 염증성 질환이 유도되어(23) 인슐린 저항성 증가와 동맥경화 악화 및 암세포 성장 촉진 등 다양한 병리학적 기전에 관여하게 된다(22).
따라서 본 연구에서는 전통 발효 방법으로 오디 발효액을 제조하여 오디 발효액의 항산화 활성과 알코올 분해 효과 및 항염증 효과를 규명함으로써 오디 발효액에 대한 기초 자료를 제공하고자 한다.
재료 및 방법
실험재료 및 시료 제조
본 연구에 사용한 오디(Morus alba L.)는 전라북도 김제 의 한 농가에서 2015년 수확한 것을 냉동상태로 구입하여 -20°C에서 냉동보관하며 시료로 사용하였다. 오디 발효액 은 Park과 Rha(25) 및 Ahn 등(26)의 방법을 참고하여 제조 하였다. 오디 500 g과 황설탕(Samyang, Seoul, Korea) 320 g을 혼합하여 실온에서 100일간 발효시킨 다음 오디는 건져 내고 얻은 발효액을 4°C의 냉장고에서 90일간 숙성시켜 시 료로 사용하였다. 오디 발효액은 냉동원심분리기(MEGA 17R, Hanil Science Industrial Co., Ltd., Incheon, Korea) 를 이용하여 12,000 rpm으로 4°C에서 15분간 원심분리 하 여 상등액을 취한 다음 Whatman No. 2 filter paper(What- man International Ltd., Maidstone, UK)로 여과하여 -70
°C에서 보관하면서 본 실험에 사용하였다.
pH 및 당도 측정
오디 발효액의 pH는 pH meter(S 20, SevenEasy, Gre- ifensee, Switzerland)를 이용하여 측정하였고, 당도는 당 도계(PAL-3, ATAGO Co., Ltd., Tokyo, Japan)를 사용하 여 °Brix를 측정하였다.
유리 아미노산 측정
전처리한 오디 발효액을 30배로 희석하여 0.2 μm sy- ringe filter로 여과한 다음 아미노산 자동분석기(Hitachi L- 8900 Amino acid Analyzer, Hitachi Ltd., Tokyo, Japan) 를 이용하여 분석하였다. 분석에 사용한 column은 Ion ex-
change column(4.6×60 mm), 검출기는 UV detector를 사 용하여 570 nm에서 측정하였고, 시료 주입량 20 μL, 유속 0.35 mL/min, column 온도 50°C 및 반응 온도 135°C의 조건으로 측정하였다.
총 폴리페놀 함량 측정
총 폴리페놀 함량은 Folin-Ciocalteu법(27)을 약간 변형 시켜 측정하였으며 표준물질로는 tannic acid(Sigma-Aldrich Co., St. Louis, Mo, USA)를 사용하여 분석하였다. 오디 발 효액을 시험관에 취한 후 증류수를 가하여 2 mL로 정용하고 Folin-Ciocalteu reagent 0.3 mL를 가하여 잘 혼합한 다음 3분간 실온에서 반응시켰다. 혼합물에 7.5% Na2CO3 용액 0.4 mL를 가하여 혼합하고 50°C에서 5분간 발색시킨 후 760 nm에서 흡광도를 측정하였다. 오디 발효액의 총 페놀 함량은 mg tannic acid equivalents(TAE)/mL로 나타내었다.
DPPH 라디칼 소거능 측정
오디 발효액의 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH) 라디칼 소거능은 Blois(28)의 방법을 약간 변형하여 DPPH 에 대한 수소공여 효과로 측정하였다. 96-well plate에 시 료와 0.4 mM DPPH 용액을 1:4 비율로 혼합하여 37°C에서 30분간 반응시킨 후 ELISA reader(Molecular Device, Versa Max Microplate Reader, Sunnyvale, CA, USA)를 이용하여 520 nm에서 흡광도를 측정하였다. DPPH 라디칼 소거능은 시료를 첨가하지 않은 대조군과 흡광도 차를 비교 하여 free radical의 제거 활성을 백분율로 나타내었다.
DPPH radical scavenging activity (%)＝
대조구 흡광도－시료 첨가구 흡광도 대조구 흡광도 ×100
SOD 유사활성 측정
Superoxide dismutase(SOD) 유사활성은 Marklund와 Marklund(29)의 방법에 따라 활성산소종을 과산화수소 (H2O2)로 전환시키는 반응을 촉매하는 pyrogallol의 생성량 을 측정하여 나타내었다. 각각의 시료를 농도별로 희석하여 10 μL씩 96-well plate에 취한 후, Tris-HCl buffer(50mM Tris aminomethane, 10 mM EDTA, pH 8.0) 150 μL와 7.2 mM pyrogallol 10 μL를 가하여 실온에서 10분간 반응 시키고 1 N HCl 50 μL를 가하여 반응을 정지시킨 후 ELISA reader를 사용하여 420 nm에서 흡광도를 측정하였다. SOD 유사활성은 시료 첨가구와 무첨가구 사이의 흡광도 차이를 백분율로 나타내었다.
SOD activity (%) ＝ 1－시료 첨가구의 흡광도 시료 무첨가구 흡광도 ×100
SOD 활성 측정
오디 발효액의 SOD 활성은 SOD assay kit(Dojindo
Molecular Technologies, Rockville, MD, USA)을 사용하 여 manufacturer’s instruction에 기술된 방법에 따라 수행 하였다. 농도별로 희석한 시료 20 μL를 96-well plate에 분주한 후 WST working solution 200 μL를 넣고 혼합한 다음 enzyme working solution 20 μL를 가하여 37°C에서 20분간 반응시킨 후 ELISA reader를 이용하여 450 nm에 서 흡광도를 측정하였다. 대조구는 효소 대신 20 μL의 dilu- tion buffer를 넣어 측정하였다. SOD 활성은 시료 첨가구와 무첨가구 사이의 흡광도 차이를 백분율(%)로 나타내었으며 SOD 활성 측정은 SOD 유사활성 측정식과 동일한 식을 사 용하였다.
ADH 활성 측정
Alcohol dehydrogenase(ADH) 효소 활성 측정은 Choi 등(30)과 Racker(31)의 방법을 변형하여 측정하였으며, 생 성된 NADH의 양을 340 nm에서 흡광도를 측정하였다. 시 험관에 알코올 0.1 mL, NAD 수용액(2 mg/mL) 0.5 mL 및 시료 0.1 mL를 첨가하고 10 mM glycine-NaOH buffer(pH 8.8)를 총 부피가 1.8 mL가 되도록 조절하여 25°C 항온수 조에서 10분간 반응시킨 후 ADH(10 unit/mL, Sigma-Al- drich Co.)를 가하여 340 nm에서 spectrophotometer (Amersham Pharmacia Biotech, Cambridge, UK)를 이용 하여 흡광도의 변화를 측정하였다. 대조구는 시료 대신 증류 수를 첨가하였으며, positive control은 약국에서 구입한 Hepos를 1/2로 희석하여 사용하였다. ADH의 활성은 다음 과 같은 식으로 상대적인 백분율로 계산하였다.
ADH activity (%) ＝ 실험구의 최대 흡광도 대조구의 최대 흡광도 ×100
ALDH 활성 측정
Acetaldehyde dehydrogenase(ALDH)의 효소 활성 측 정은 Koivula와 Koivusalo(32)의 방법을 약간 변형하여 측 정하였다. 반응용액은 증류수 2.1 mL, 1.0 M Tris-HCl buffer(pH 8.0) 0.3 mL, 20 mM NAD+ 0.1 mL, 0.1 M ace- taldehyde 0.1 mL, 3.0 M KCl 0.1 mL, 0.33 M 2-mer- captoethanol 0.1 mL 및 시료 0.1 mL를 혼합하여 25°C에 서 10분간 반응시킨 후 ALDH(1 unit/mL) 0.1 mL를 첨가하 여 25°C 항온수조에서 5분간 반응시킨 다음 340 nm에서 흡광도의 변화를 측정하였다. 대조구는 시료 대신 증류수를 첨가하여 상대활성(%)으로 나타내었고, positive control은 ADH 활성 측정에서와 같이 Hepos를 사용하였으며, ALDH 활성 측정은 ADH 활성 측정식과 동일한 식을 사용하였다.
아질산염 소거능 측정
오디 발효액의 아질산염 소거능은 Gray와 Dugan(33)의 방법을 변형하여 측정하였다. 아질산염 용액에 시료 용액을 가한 후 0.1 N HCl(pH 1.2) 및 0.2 M 구연산 완충용액을 사용하여 반응 용액의 pH를 각각 1.2, 3.0 및 6.0으로 조정
하여 사용하였다. 반응물 용액은 37°C에서 1시간 반응시킨 후 Griess 시약을 가하여 15분간 실온에 방치시킨 다음 520 nm에서 흡광도를 측정하여 잔존하는 아질산염을 구하였다.
아질산염 소거능은 다음의 식에 따라 계산하였다.
Nitrite scavenging activity (%) ＝
(
1－ A－CB)
×100A: 1 mM NaNO2 용액에 추출 시료를 첨가하여 1시간 반응시킨 후의 흡광도
B: NaNO2 용액의 흡광도 C: 시료의 흡광도
세포 배양
RAW 264.7 murine macrophage cell line은 한국세포 주은행(Seoul, Korea)에서 분양받아 실험에 사용하였다. 세 포 성장을 위한 기본 배지로는 10% FBS, penicillin 100 U/mL, streptomycin 100 μg/mL를 포함하는 DMEM 배지 를 사용하였으며, T-flask에 접종하여 CO2 incubator(5%
CO2, 95% air)에서 37°C 조건으로 배양하였다. 배양된 세 포는 일주일에 2~3회 refeeding 하고 6~7일마다 cell scraper를 이용하여 계대배양 하면서 실험에 사용하였다.
각 실험에서는 배양된 세포에 시료를 농도별로 첨가하여 2 시간 배양한 다음 스트레스를 유발하기 위하여 1 μg/mL의 lipopolysaccharide(LPS)를 첨가하여 20시간 배양하였다.
세포 생존율 측정
RAW 264.7 세포 생존율 측정을 위하여 MTT assay를 실시하였다. 세포가 confluence 상태가 되면 96-well plate 에 well당 2×104 cells/mL로 세포를 seeding 하여 2시간 배양하고, 시료를 농도별로 처리하여 20시간 incubation 한 후 배지를 버리고 100 mL(1 mg/mL)의 3-(4,5-dimethyl- 2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H tetrazolium bromide(MTT) solution을 각 well에 주입하여 37°C에서 4시간 재배양하 였다. Medium에서 MTT solution을 제거하고 100 μL di- methyl sulfoxide(DMSO)를 주입하여 30분 동안 incuba- tion 한 후 ELISA plate reader로 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.
Intracellular ROS level 측정
산화적 스트레스에 의해 과산화지질을 생성하여 세포 독 성으로 작용할 뿐만 아니라 세포 손상을 유발하는 ROS를 측정하기 위하여 2’,7’-dichlorofluorescein diacetate(DCF- DA, Sigma-Aldrich Co.) 형광염료를 이용하였다. DCF- DA는 세포에서 아세틸기를 제거하고 그것이 세포 내의 hy- drogen peroxide와 같은 라디칼에 정량적으로 반응하여 DCF 형광물질로 변화되는 것을 측정하는 원리이다. 세포가 confluence 상태가 되면 96-well plate에 well당 2×104 cells/mL로 seeding 하여 2시간 incubation 한 후 시료를
Table 1. Yield, pH, and sugar content of mulberry (Morus alba L.) fermented liquid
Sample Yield
(%) pH Sugar content (°Brix) Mulberry fermented
liquid 83.54 3.09±0.021) 54.16±0.05
1)Results are mean±SD of triplicate data.
pH of mulberry: 5.23±0.02.
Sugar content of mulberry (°Brix): 13.66±0.51.
Table 2. Free amino acid contents of mulberry (Morus alba L.) fermented liquid
Free amino acid Contents (mg/100 mL) Threonine
Valine Isoleucine Leucine Lysine Methionine Phenylalanine γ-Aminobutyric acid Histidine
Arginine Proline Aspartic acid Serine Glutamic acid Glycine Alanine Cystathionine Tyrosine Phosphoserine β-Alanine Ethanol amine NH3
Phosphoethanolamine Total free amino acid
0.04±0.001) 0.12±0.01 0.07±0.01 0.13±0.01 0.06±0.01 0.03±0.00 0.09±0.01 0.43±0.03 0.03±0.00 0.14±0.01 0.13±0.01 0.22±0.02 0.14±0.01 0.34±0.03 0.03±0.00 0.07±0.00 0.03±0.00 0.14±0.01 0.62±0.03 0.02±0.00 0.04±0.00 0.04±0.01 0.17±0.01
3.13
1)Results are mean±SD of triplicate data.
농도별로 처리하여 2시간 배양하였다. 이후 1 μg/mL의 LPS 를 첨가하여 20시간 배양하여 스트레스를 유발한 다음 배양 된 media를 제거하고, 세포는 PBS로 두 번 세척하였다. 세 포에 100 μM의 DCF-DA를 넣어 15분, 다시 60분 동안 실 온에서 incubation 한 다음 flow cytometer로 DCF-DA fluorescence 상승률을 측정하였다.
IL-1β농도 측정
실험 방법은 manufacturer’s instruction에 따라 수행하 였다. 세포가 confluence 상태가 되면 6-well plate에 well 당 1×106 cells/mL로 seeding 하여 2시간 배양한 다음 시료 를 농도별로 처리하여 20시간 incubation 하였다. 이후 배지 를 수거하여 ELISA kit으로 cytokine 함량을 측정하였다.
통계처리
실험 결과는 통계 SAS package(Statistical Analysis System, Version 9.1, SAS Institute Inc., Cary, NC, USA) 를 사용하여 각 시료의 평균과 표준편차를 계산하였고, 분산 분석(ANOVA)과 Duncan’s multiple range test를 실시하 여 P<0.05 수준에서 시료 간의 유의차를 검정하였다.
결과 및 고찰
오디 발효액의 수율과 pH 및 당도
오디 발효액의 수율과 pH 및 당도(°Brix)를 측정한 결과 는 Table 1에 나타내었다. 오디 500 g과 황설탕 320 g을 혼합하여 발효시켜 얻은 발효액은 685 g으로 수율은 83.54
%였다. 오디 발효액의 pH는 3.09로 나타났는데 본 연구에 사용된 오디의 pH는 5.23으로 발효에 의해 pH는 저하되었 다. Park 등(5)은 오디의 숙도에 따른 pH 측정 결과 숙도 80%, 90%, 100%에서의 pH는 각각 4.24, 4.42, 5.31로 숙 도가 높아짐에 따라 pH가 높아지는 것으로 보고하였고, Park 등(34)은 저장 온도 및 기간에 따른 오디의 pH 측정 결과 저장 초기 pH는 5.16이었으나 저장 20일 후 온도에 따라 5.30~5.38로 높아진다고 보고하여 본 연구에서 사용 된 오디의 pH와 유사한 수준이었다. Im 등(17)은 오미자의 첨가량에 따른 오디청의 품질특성 연구에서 오디의 pH는 5.47이었으나 오디청 제조 시 오미자의 첨가량 증가는 산의 양이 높아짐에 따라 pH는 저하한다고 보고하였고, Kim 등 (35)은 국내 시판 발효액 56종의 pH를 측정한 결과 2.84~
4.40으로 보고하였는데 이는 발효 혹은 원료에서 유래하는 산에 의한다고 하였다. 본 연구에 사용한 오디의 당도는 13.66°Brix로 나타났는데, 오디양의 0.8배에 해당하는 황 설탕을 첨가하여 제조한 오디 발효액의 당도는 54.16°Brix 로 증가하였다. Park 등(5)은 오디의 숙도에 따른 당도 측정 결과 숙도 80%, 90%, 100%에서의 당도는 각각 14.2, 14.5, 16.3°Brix로 숙도가 높아짐에 따라 당도가 높아지는 것으로 보고하였고, Park 등(34)은 저장 온도 및 기간에 따른 오디 의 당도 측정 결과 저장 초기 14.7°Brix에서 0°C, 저장 10일 후 14.73°Brix로 소폭 증가하는 것으로 보고하였으며, Im 등(17)은 오디의 당도를 20.2°Brix로 보고하여 본 연구에서 사용된 오디의 당도와는 차이가 있었다. 이는 품종 및 재배 환경과 수확연도의 차이에 따른 결과라 판단된다. Kim 등 (35)은 국내 시판 발효액 56종의 당도를 측정한 결과 9~
62.8°Brix로 큰 차이를 보였으나 평균 52.85°Brix로 제품 대부분 당도 수준이 높다고 보고하였다. Ahn 등(26)은 산야 초의 잎, 열매 등을 동량의 설탕과 혼합하여 일정기간 발효 시킨 것을 효소라는 명칭으로 사용되고 있으나 실제 효소 활성은 매우 낮은 것으로 보고하였는데, 이들 발효액을 기능 성 식재료로서의 활용 가능한 제품으로 생산하기 위해서는 설탕 첨가 농도 및 발효 기법에 관한 연구가 필요한 것으로 판단된다.
유리 아미노산 함량
오디 발효액의 유리 아미노산을 분석한 결과는 Table 2
a b
c
d a
0 20 40 60 80 100 120
Vit. C 0.1 1 2 5
Concentration (%) DPPH radical scavenging . activity (%) .
Fig. 1. DPPH free radical scavenging activity of mulberry (Mo- rus alba L.) fermented liquid. Results are mean±SD of triplicate data. Vitamin C (Vit. C, 0.01%) is used as positive control.
Different letters (a-d) above bars differ significantly (P<0.05).
Table 3. Total polyphenol content of mulberry (Morus alba L.) fermented liquid
Sample Total polyphenol (mg TAE/mL)1) Mulberry fermented liquid 2.67±0.012)
1)TAE standards for tannic acid equivalents.
2)Results are mean±SD of triplicate data.
에 나타내었다. 총 유리 아미노산 함량은 3.13 mg/100 mL 로 주요 아미노산은 phosphoserine(0.62 mg/100 mL)과 γ-aminobutyric acid(GABA, 0.43 mg/100 mL), glutamic acid(0.34 mg/100 mL) 및 aspartic acid(0.22 mg/100 mL) 로 나타났다. 아미노산은 관능적 특성 및 품질에 영향을 주 는 것으로 알려져 있는데(36) 원재료가 분해되어 생성되거 나 일부는 발효에 의하여 생합성되기도 하며, 원료 자체의 아미노산이 최종 제품에 반영될 수 있는 것으로 보고되어 있다(37). Lee(38)는 냉동 건조한 경기도 양평산 완숙 오디 의 주요 아미노산은 aspartic acid와 glutamic acid, argi- nine으로 오디가 성숙함에 따라 대부분의 아미노산 함량은 감소하며, GABA 함량은 42.1 mg/100 g으로 보고하였는데 GABA는 수축기 혈압 상승 억제 효과가 있는 것으로 알려져 있다.
총 폴리페놀 함량
식물계에 널리 존재하는 폴리페놀 화합물은 anthocya- nins과 flavonoids, tannins 및 catechins 등의 총칭으로 다 수의 수산기(-OH)를 가지고 있어 다른 화합물과 쉽게 결합 하는 특성 때문에 항염, 항암 및 항산화 효과가 뛰어난 것으 로 알려져 있다(3). 또한 폴리페놀 화합물은 지질 free radi- cal의 불활성화 및 지질과산화물이 free radical로 분해되는 것을 저해함으로써 항산화력을 나타내는 매우 효과적인 free radical scavengers로 알려져 있다(39). 오디는 anthocya- nin 색소뿐만 아니라 quercetin, rutin, caffeic acid 등의 많은 폴리페놀 화합물이 존재하는 것으로 알려져 있다(40).
따라서 본 연구에서는 오디 발효액의 총 페놀 함량을 tannic acid를 표준물질로 사용하여 측정하였으며, 그 결과(Table 3) 2.67 mg TAE/mL로 나타났다. Ahn 등(26)은 1~3개월 간 발효시킨 산야초 발효액의 폴리페놀 함량은 발효기간이 경과됨에 따라 증가하여 발효기간 3개월의 폴리페놀 함량은 달맞이꽃 6.40 mg TAE/mL, 옻 4.00 mg TAE/mL, 오행초 3.11 mg TAE/mL로 보고하였고, Kim 등(41)은 산야채 추 출물의 발효기간이 증가함에 따라 총 페놀 함량이 증가하여 발효 4개월에서 가장 높았다고 보고하였다. 한편 Lee 등(3) 은 건조 오디 열수 추출물의 총 폴리페놀 함량은 1,457.17~
2,336.33 mg%로 품종에 따라 차이가 있는 것으로 보고하 였고, Lee 등(1)은 건조 오디의 총 폴리페놀 함량은 노지 재배는 171.74~482.98 mg/100 g, 시설 재배는 126.21~
471.41 mg/100 g으로 품종 및 재배 환경에 따라 차이가 있는 것으로 보고하였는데, 이는 광량의 차이에 따른 폴리페
놀 화합물의 유도 정도에 차이가 있기 때문으로 판단하였다.
DPPH 라디칼 소거능
항산화 효능의 지표로 전자공여능이 사용되고 있으며, DPPH는 polyhydroxy 방향족 화합물과 방향족 아민류 및 아스코르빈산과 토코페롤 등에 의해 수소나 전자를 받아 비 가역적으로 안정한 분자를 형성, 환원됨에 따라 라디칼이 소거되어 진한 자색이 탈색되는 원리를 이용하여 항산화 효 과를 측정하게 된다(42). 오디 발효액의 DPPH 라디칼 소거 능을 측정한 결과(Fig. 1), 농도 의존적으로 증가하였으며 (P<0.05) 5% 농도에서의 DPPH 라디칼 소거능은 99.14%
로 0.01% 농도의 비타민 C(96.36%)보다 높게 나타났으나 유의적인 차이는 없었다. 오디의 DPPH 라디칼 소거능에 대 한 연구로 Cha 등(43)은 경북 상주산 오디를 물 및 20~
100%의 에탄올 추출하여 DPPH 라디칼 소거능을 측정한 결과 60% 에탄올 추출물에서 81%로 가장 높은 소거능이 있다고 보고하였고, Lee 등(3)은 4품종의 동결건조 오디를 60% 에탄올로 추출하여 DPPH 라디칼 소거능을 분석한 결 과 60.65~90.40%로 품종에 따라 유의적인 차이가 있다고 보고하였다. DPPH 라디칼 소거능의 연구 결과는 차이가 있 었는데, 이는 산지와 품종, 추출용매 및 추출시간에 따른 차 이라 생각된다. Youn 등(16)은 10~40일간 저장한 오디 당 침출액 0.1 mg/mL 농도에서의 DPPH 라디칼 소거능은 저 장 30일과 40일에서 각각 65%와 66%로 10일 및 20일 저장 시료에 비해 유의적으로 높게 나타났다고 보고하였고, Ahn 등(26)은 1~3개월간 발효시킨 산야초 발효액의 DPPH 라 디칼 소거능은 발효기간이 경과됨에 따라 증가하여 발효기 간 3개월에서 가장 높은 것으로 보고하였다. 한편, Joo 등 (44)의 연구에서 대봉 과즙보다 대봉 와인에서의 DPPH 라 디칼 소거능이 높은 것으로 보고하였고, Chae 등(42)은 오 디 착즙액과 토종 발효 미생물(Saccharomyces cerevisiae B-8)로 발효한 발효주의 DPPH 라디칼 소거를 위한 IC50은 각각 114. 60 μL/mL와 73.62 μL/mL로 발효주의 소거능이 1.5배 이상 증가하는 것으로 보고하였는데, 이는 발효를 통
b
c d
e a
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Vit. C 10 20 40 60
Concentration (%)
SOD-like activity (%) .
A
b c
d e
a
0 20 40 60 80 100 120
Vit. C 1 2 5 10
Concentration (%)
SOD activity (%) .
B
Fig. 2. Superoxide dismutase (SOD)-like activity (A) and SOD activity (B) of mulberry (Morus alba L.) fermented liquid. Results are mean±SD of triplicate data. Vitamin C (Vit. C, 0.05%) is used as positive control. Different letters (a-e) above bars differ significantly (P<0.05).
한 성분변성이나 발효 중 생성된 대사산물이 유효성분으로 작용하여 DPPH 라디칼 소거 활성이 증가한 것으로 판단하 였다(39). Kim 등(41)은 전자공여능이 폴리페놀 화합물에 대한 항산화 지표이며, 총 페놀 함량은 항산화 활성과 관련 이 있다고 보고하였다. 본 실험 결과에서 오디 발효액의 우 수한 DPPH 라디칼 소거 활성을 확인할 수 있었으며, 이는 오디에 다량 함유되어 있는 페놀성 화합물에 의한 결과라 생각된다.
SOD assay
SOD는 생체 내에서 superoxide anion radical을 과산화 수소로 환원시키는 반응을 촉매하는 천연 항산화 효소로 알 려져 있다(41). 체내 생성된 과산화수소는 DNA를 비롯한 세포의 구성성분들에 산화적 손상을 유발시킴으로써 질병 과 노화의 원인으로 작용하는 활성산소의 하나이다(45). 따 라서 식물체 중에서 인체 내에서의 산화 방지 및 노화 억제 와도 밀접한 관련이 있는 SOD와 유사한 활성을 나타내는 물질을 찾고자 하는 연구가 활발하게 진행되고 있다(42).
본 연구에서는 SOD 활성을 가진 천연물 소재를 탐색하고자 오디 발효액의 SOD 유사활성 및 SOD 활성을 분석하였는 데, 오디 발효액뿐만 아니라 식물 발효액에 대한 SOD 활성 을 측정한 연구는 미비한 실정이다. 오디 발효액의 SOD 유 사활성을 측정한 결과(Fig. 2A), 농도 의존적으로 증가하였 으며(P<0.05) 60% 농도에서 52.47%로 나타났다. Kim 등 (41)은 쑥, 민들레, 아카시아, 솔싹, 감잎 등 각각의 산야채 발효액의 SOD 유사활성을 측정한 결과 아카시아와 감잎 발 효액에서만 SOD 유사활성이 나타났으며 발효기간에 따라 서는 큰 차이가 없는 것으로 보고하였다. 오디 발효액의 SOD 활성을 측정한 결과(Fig. 2B) 또한 농도 의존적으로 증가하 였으며(P<0.05), 10% 농도에서 85.07%로 높게 나타났다 (P<0.05). Youn 등(16)은 과산화수소로 처리한 HepG2 세 포에서 오디 당침출액의 SOD 활성을 측정한 결과 오디 당침 출액은 SOD 활성을 증가시킴으로써 산화적 스트레스로 유 도된 세포 내 손상이 감소한다고 보고하였다. 본 연구 결과
오디 발효액은 높은 SOD 활성은 보였기에 천연 항산화제로 서의 이용 가치가 높다고 판단된다. 한편 Kim과 Kang(46) 은 전북 진안산으로 열풍 건조한 오디분말 물 및 메탄올 추 출물 5 mg/mL 농도에서 SOD 유사활성은 각각 9.8%와 3.0
%로 보고하였고, Ju 등(47)은 중국산 오디 물 및 50% 에탄 올 추출물의 SOD 유사활성은 27.10%와 25.93%로 보고하 여 대체로 낮은 활성을 보였는데, 오디 발효액은 발효를 통 해 성분변성 및 발효 중에 생성된 대사산물이 유효성분으로 작용하여 SOD 활성이 증가한 것으로 생각된다.
알코올 분해활성(ADH, ALDH)
오디 발효액의 숙취 해소 효과를 알아보기 위하여 체내 알코올 대사의 1차 효소인 ADH 활성 및 acetaldehyde를 분해하는 ALDH 활성에 대한 오디 발효액의 영향을 알코올 분해 및 숙취 해소에 효과가 있는 것으로 알려진 Hepos를 positive control로 하여 분석하였다. 숙취의 주 원인물질인 acetaldehyde는 체내 흡수된 알코올이 분해될 때 생성되는 대사산물로 ADH의 활성화는 혈중 알코올 농도를 빠르게 감소시킬 수는 있지만 간이나 혈액에 잔존하는 acetalde- hyde는 계속 축적되어 심한 숙취를 유발할 가능성이 있다 (48). 따라서 본 연구에서는 ADH 및 ALDH 두 가지 효소 모두에 미치는 오디 발효액의 영향을 분석한 결과(Fig. 3A, 3B), 두 가지 효소 모두 농도 의존적으로 활성이 증가하였다 (P<0.05). 10% 농도에서의 오디 발효액의 ADH 및 ALDH 활성은 각각 160.08%와 148.70%로 높게 나타났다. 최근 음주로 인한 숙취 해소를 위한 의약품이 개발되고 있으나 부작용 및 독성으로 인해 보다 안전한 천연물 유래 식품 개 발에 관심이 모아지고 있다(49). 이에 따라 수행된 천연물의 알코올 분해 효소 활성에 관한 연구는 헛개나무 추출물 (50,51), 약용식물 추출물과 적정 조성 추출물(49) 등이 있 으나 오디 발효액에 대한 알코올 분해 활성을 측정한 연구는 전무한 실정이다. 본 연구에 사용한 국내산 오디 발효액은 높은 DPPH 라디칼 소거능과 SOD 활성을 나타내기에 알코 올 섭취로 인해 증가한 활성산소를 감소시킬 뿐만 아니라
b
c d d
a
0 40 80 120 160 200
hepos 50 1 2 5 10
Concentration (%)
ADH activity (%) .
A
Hepos 50
b c
d d a
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180
hepos 50 1 2 5 10
Contentratiom (%)
ALDH activity (%) .
B
Hepos 50
Fig. 3. Effects of mulberry (Morus alba L.) fermented liquid on the alcohol dehydrogenase (ADH) (A) and aldehyde dehydrogenase (ALDH) (B) activities. Results are mean±SD of triplicate data. Hepos is used as positive control. Different letters (a-d) above bars differ significantly (P<0.05).
a
c
d b
c
d
0 20 40 60 80 100 120
pH 1.2 pH 3 pH 6
Nitrite scavenging activity (%) .
Vit. C 1 mg/mL
Mulberry fermentd liquid 20%
Fig. 4. Nitrite scavenging effects of mulberry (Morus alba L.) fermented liquid under different pH conditions (pH 1.2, 3.0, 6.0). Results are mean±SD of triplicate data. Vitamin C (Vit.
C, 0.1%) is used as positive control. Different letters (a-d) above bars differ significantly (P<0.05).
높은 ADH와 ALDH 활성을 가지므로 효과적으로 혈중 알코 올을 제거하는 것으로 생각된다. 따라서 오디 발효액은 알코 올의 독성으로부터 간 조직 보호와 숙취 해소를 위한 천연물 소재로서 충분한 가치가 있는 것으로 생각된다.
아질산염(NO) 소거능
N-Nitrosoamine을 생성하는 물질인 아질산염(NO)은 단 백질과 핵산, 세포 내 성분 등을 알킬화하여 매우 낮은 농도 의 노출에도 방광암과 위암, 후두암 등의 다양한 암을 유발 하거나 증가시킬 수 있는 발암인자로 중요시되고 있는데 (52), 질산염 그 자체로는 독성이 없으나 타액이나 위 내에 서의 환원 효소나 환원 세균 등의 작용에 의해 아질산염으로 환원되어 독성을 나타낸다. 질산염에 비해 아질산염은 반응 성이 크므로 산성 영역에서 쉽게 nitrous acid로 전환되어 니트로소화 물질로써 작용할 수 있다(53). 따라서 산성영역 에서 N-nitrosoamine의 생성을 억제하는 데 기여하는 천연 물을 찾는 연구가 활발하게 진행되어 왔다(54,55). 본 연구 에서는 20% 농도에서의 오디 발효액이 아질산염 소거능에 미치는 영향을 pH 1.2, 3.0, 6.0에서 분석한 결과(Fig. 4),
각각 78.72%와 62.71% 및 42.86%로 pH가 낮을수록 아질 산염 소거능이 증가하는 것으로 나타났다(P<0.05). Kim과 Kang(46)은 오디분말 물 및 메탄올 추출물의 아질산염 소거 능은 pH 1.2에서 각각 7.0%와 48.0%로 보고하였고, Ju 등 (47)은 뽕잎 및 오디 물 추출물의 아질산염 소거능은 pH가 증가함에 따라 감소하는 경향으로 pH 1.2에서 각각 41.87%
와 40.03%로 활성이 조금 낮다고 보고하여 본 연구에서의 오디 발효액보다 낮은 소거능을 보였다. 오디 발효액 역시 pH 1.2에서 가장 높은 아질산염 소거능을 보였는데, 이는 위 내의 pH 조건과 유사한 pH 1.2에서 가장 활성이 좋은 것을 확인할 수 있었다. 이와 같은 결과는 아질산염 소거능 은 pH에 매우 의존적이며, pH가 증가할수록 아질산염 소거 효과가 감소한다고 보고한 Kang(56)과 Han 등(52)의 결과 와 유사한 경향이었다. Park(57)은 아질산염 소거능은 총 페놀 함량이 높을수록, pH가 낮을수록 뛰어나고 pH 1.2 영 역에서의 아질산염 소거능은 페놀산류에 의한 영향이 크게 작용하며 유기산 중 특히 시트르산의 효과가 크다고 보고한 바 있다. Lee 등(1)은 전라북도 무안산 오디의 유기산은 citric acid와 acetic acid, D-malic acid 및 succinic acid의 4종으로 주요 유기산은 citric acid와 acetic acid라고 보고 하였다. 따라서 오디 발효액의 아질산염 소거능은 페놀성 화합물과 유기산의 상호작용에 의한 것으로 판단되며 본 연 구 결과 오디 발효액은 우수한 아질산염 저해제로 그 활용도 가 높을 것으로 생각한다.
세포 독성
대식세포는 염증 반응에서 다양한 자극에 의하여 활성화 되어 열, 부종 등의 염증반응 유도 및 염증성 cytokine을 분비하여 다른 염증 세포들이 염증 부위로 이동할 수 있게 하는 세포이다(23). 0.5~5% 농도의 오디 발효액을 대식세 포에 처리하여 생존율을 측정한 결과(Fig. 5), 94.64~92.01
%로 오디 발효액 무처리군과 유의적인 차이가 없는 것으로 나타났다. 따라서 이후 진행된 실험은 0.5, 1, 2, 5% 농도의 오디 발효액으로 진행하였다.
d e b c
a
f
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200
ROS generation (%) .
LPS (1 μg/mL) - + + + + + Sample (%) - - 0.5 1 2 5
Fig. 6. Effect of mulberry (Morus alba L.) fermented liquid on intracellular ROS level in LPS-treated RAW 264.7 cells. Cells (2×104 cells/well) in 96-well plates were first incubated with and without indicated concentrations of sample for 2 h, and then incubated with LPS (1 μg/mL) for 20 h. Untreated is neg- ative control without LPS treatment. Results are mean±SD of triplicate data. Different letters (a-f) above bars differ signifi- cantly (P<0.05).
c c a b
a
d
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 1.8
IL-1β contents (ng/mL) .
LPS (1 μg/mL) - + + + + + Sample (%) - - 0.5 1 2 5
Fig. 7. Effect of mulberry (Morus alba L.) fermented liquid on the production of IL-1β in RAW 264.7 cells. The cells were pre- treated with samples as indicated concentrations for 2 h, and then incubated with or without LPS (1 μg/mL) for 20 h. The level of cytokine was measured by ELISA kit. Results are mean
±SD of triplicate data. Different letters (a-d) above bars differ significantly (P<0.05).
NS
0 20 40 60 80 100 120
0 0.5 1 2 5
Concentration (%)
Cell viability (%) .
Fig. 5. Effect of mulberry (Morus alba L.) fermented liquid on cytotoxicity in RAW 264.7 cells. Cells (2×104 cells/well) in 96- well plates were first incubated with and without indicated con- centrations of sample for 20 h. Results are mean±SD of triplicate data. NS: not significant.
대식세포 내 ROS 생성에 대한 오디 발효액의 효과 ROS는 생체 세포를 공격하여 단백질과 핵산, 지질을 파 괴하고 여러 효소 기능을 저해하여 노화 촉진 및 암 등의 질병을 발생시키는 것으로 보고되고 있다(58). 오디 발효액 의 처리에 따른 대식세포 내 ROS를 측정하기 위하여 DCF- DA를 이용하여 flow cytometer로 분석하였다. LPS로 유도 된 RAW 264.7 대식세포의 ROS 생성 측정 결과(Fig. 6), 오디 발효액 농도 의존적으로 감소하였는데(P<0.05), 5% 농 도에서의 ROS 생성은 129.99%로 LPS 처리군(180.36%) 보다 27.93% 감소하였다(P<0.05). Youn 등(16)은 오디 당 침출액이 H2O2로 야기된 산화적 스트레스로 인한 HepG2 세포 내 지질과산화물을 감소시켜 간세포 손상을 억제하는 것으로 보고하였는데, 오디에는 항산화 활성이 높은 cyani- din-3-rutinoside와 cyanidin-3-glucose 등의 anthocya-
nin, polyphenol 및 resveratrol 등이 다량 함유되어 산화적 스트레스와 관련된 질환 예방에 도움이 되는 것으로 보고되 어 있다. 한편 Kim 등(36)은 미나리 발효액이 H2O2로 야기 된 산화적 스트레스로 인한 C6 세포 손상 억제 효과를 갖는 것으로 보고하였는데, 이는 플라보노이드 성분인 persicar- in에 의한 효과라고 보고하였다. 본 연구 결과에서 오디 발 효액은 세포 내 ROS 생성을 억제하여 산화적 스트레스에 효 능이 있는 천연 소재임을 확인할 수 있었다.
IL-1β생성 억제 효과
LPS는 monocyte 또는 RAW 264.7 대식세포에서 IL-1β 와 IL-6 및 TNF-α와 같은 pro-inflammatory cytokine을 증가시키는 것으로 알려져 있는데(59), 염증성 cytokine의 과도한 발현은 심한 조직손상, 패혈증 및 전신성 염증반응 증후군 등을 야기시킨다(60). IL-1β는 염증반응에서 생성 되는 촉진성 cytokine으로 저농도에서는 세포 성장 및 항상 성 유지에 필수적이지만 면역성 자극 및 염증반응으로 대량 생산될 경우 B cell 성숙 및 T cell을 활성화하여 증상을 악화시킨다(61). 따라서 염증성 cytokine의 조절이 가능한 물질은 염증반응으로 유도된 많은 질병 발생을 조절할 가능 성이 있음을 알 수 있다. 본 연구에서는 LPS로 처리한 RAW 264.7 세포에 오디 발효액을 농도별로 처리하여 pro-in- flammatory cytokine인 IL-1β의 분비량을 알아보았다. 그 결과(Fig. 7), IL-1β 분비량은 오디 발효액 처리 시 농도 의존적으로 감소하였는데(P<0.05), 5% 농도에서의 IL-1β 분비량은 1.11 ng/mL로 LPS 단독 처리구(1.55 ng/mL)에 비해 28.39%의 억제 효과를 보였다. 따라서 오디 발효액은 pro-inflammatory cytokine인 IL-1β 분비 억제를 통해 항 염증 효과를 나타냄을 확인할 수 있었다.
요 약
본 연구에서는 국내산 오디를 이용하여 전통적인 방법으로 오디 발효액을 제조하여 항산화 효과와 알코올 대사 효소 활성 및 항염증 효과를 알아보았다. 오디와 황설탕을 1:0.8 의 비율로 혼합하여 실온에서 100일간 발효시킨 다음 오디 는 건져내고 얻은 발효액을 4°C의 냉장고에서 90일간 숙성 시킨 오디 발효액의 수율은 83.54%였고, pH는 3.09, 당도 는 54.16°Brix로 나타났다. 오디 발효액의 총 유리 아미노 산 함량은 3.13 mg/100 mL로 주요 아미노산은 phospho- serine(0.62 mg/100 mL)과 γ-aminobutyric acid(0.43 mg/100 mL), glutamic acid(0.34 mg/100 mL) 및 aspartic acid(0.22 mg/100 mL)로 나타났다. 오디 발효액의 총 페놀 함량은 2.67 mg TAE/mL였고, 5% 농도에서의 DPPH 라디 칼 소거 활성은 99.14%로 나타났다. 60% 농도에서의 오디 발효액의 SOD 유사활성은 52.47%였으며, 10% 농도에서의 SOD 활성은 85.07%로 나타났다. 숙취 해소능을 알아보기 위해 alcohol dehydrogenase(ADH) 및 acetaldehyde de- hydrogenase(ALDH) 활성을 측정한 결과, 두 효소 모두 농도 의존적으로 증가하였으며, 10% 농도에서의 ADH 및 ALDH 활성은 각각 160.08%와 148.70%로 나타났다. 아질산염 소 거능 분석에서는 오디 발효액 20% 농도, pH 1.2에서 78.72%
로 나타났다. LPS로 유도된 RAW 264.7 대식세포의 ROS 생성은 오디 발효액 농도 의존적으로 감소하였는데, 5% 농 도에서의 ROS 생성은 129.99%로 LPS 처리군(180.36%) 보다 27.93% 감소하였다. 또한 LPS로 처리한 RAW 264.7 세포에서의 pro-inflammatory cytokine인 IL-1β의 분비 량을 측정한 결과 5% 농도에서 1.11 ng/mL로 LPS 단독 처리구(1.55 ng/mL)에 비해 28.39%의 억제 효과를 보였 다. 이상의 결과에서와 같이 오디 발효액은 항산화 효과와 항염증 효과 및 숙취해소 효과가 높은 것으로 나타났기에 기능성 식재료 및 음료 개발을 위한 소재로써 충분한 가치가 있는 것으로 판단된다.
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