J Korean Ophthalmol Soc 2009;50(2):285-289 DOI : 10.3341/jkos.2009.50.2.285
사람 외안근에서의 Myosin Heavy Chain 아형의 분포
박경아⋅오세열
성균관대학교 의과대학 삼성서울병원 안과학교실
목적: 사람 외안근에서 myosin heavy chain (MyHC) 아형의 분율을 알아보고, 외안근을 중심부와 말단부로 나누어 MyHCeom을 포함 한 MyHC 아형의 분율을 비교하고자 한다.
대상과 방법: 세 뇌사 환자의 기증안(6안)을 대상으로 모든 외안근을 적출한 후, 각각의 외안근을 중심부와 말단부로 나누어 MyHC 아형의 분율에 대해 전기영동 및 densitometer를 통하여 정량 분석을 시행하였다.
결과: 전기영동 결과 MyHCI, MyHCeom, MyHCIIa, MyHCIIx 아형이 관찰되었다. MyHCeom의 분율은 말단부보다 중심부에서 높았으 며, MyHCIIa의 경우 반대로 말단부에서 중심부보다 높았다. MyHCI, MyHCeom, MyHCIIa는 네 개의 직근 및 하사근에서 모두 비슷한 분율을 나타내었으며, MyHCIIx의 경우 하직근에서 높은 분율을 보였다.
결론: 외안근에서 특징적으로 발견되는 MyHCeom의 분율은 외안근의 말단부보다 중심부에서 높게 측정되었다. 이와 같은 분포가 외 안근의 기능에 미치는 영향에 대한 향후 연구가 필요할 것으로 생각된다.
<대한안과학회지 2009;50(2):285-289>
￭ 접 수 일: 2008년 9월 29일 ￭ 심사통과일: 2008년 11월 25일
￭ 통 신 저 자: 오 세 열
서울시 강남구 일원동 50 성균관대학교 삼성서울병원 안과 Tel: 02-3410-3568, Fax: 02-3410-0074 E-mail: [email protected]
* 본 논문의 요지는 2007년 대한안과학회 제98회 추계학술대회에서 구연으로 발표되었음.
외안근은 빠른 신속 운동(fast saccade), 느린 추종 운동 (slow pursuit), 이향 운동 및 주시 등의 매우 세밀하고 복 합적인 운동 기능을 가지고 있다. 이와 같은 다양한 기능을 수행하기 위해 외안근은 다른 골격근 섬유들과 구별되는 여러가지 적응 기전을 가지고 있다. 외안근 근섬유들의 특 이한 생리는 부분적으로 외안근의 마이오신 아형의 배열과 선별적인 마이오신 아형의 발현 패턴에 기인한다.1-3외안 근에는 골격근과 심장 근육에 있는 myosin heavy chain (MyHC) 아형 이외에도 Wieczorek et al4에 의해 처음 발 견된 특수한 MyHC 아형이 발현된다. ‘외안근 마이오신’으 로도 알려진 MyHCeom 아형은 초고속(superfast) 후두 근 육에서도 발현되는 MyHC 아형으로써, 마이오신 IIL로 명명 되었다.5MyHCeom 아형의 계통발생적 연구는 골격근과 심 장근의 마이오신 분기 후 MyHCeom이 fast/developmental cluster로부터 발생되었음을 보였다.6 이러한 연구결과는 MyHCeom이 매우 빠르게 수축하는 두 근육에서만 특이 적으로 발현된다는 사실과 함께 고려해 볼 때, MyHCeom 아형이 매우 특화된 기능과 관련되어 있음을 시사한다.
MyHCeom은 전체 외안근의 빠른 속도의 신속 수축에 관여할
것으로 생각되고 있다. Li et al7은 cross-bridge cycling 속도를 반영하는 fmin (frequency at which the dynamic stiffness of a muscle fiber is at a minimum)을 측정함으 로써개별적인 외안근 섬유의 수축 속성을 비교하였다. 연 구 결과 몇몇 외안근 섬유는 MyHCIIb, IIx 및 IIa의 고속 의 아형만을 발현하는 사지 근육의 근섬유보다도 높은 fmin을 보였다. 이들의 연구는 MyHCeom이 보다 빠른 수축에 기여했을 가능성을 시사한다. Briggs and Schachat8은 토끼의 외안근에서 MyHCeom의 분포 및 분율을 조사하였 으며, MyHCeom이 토끼 외안근의 전체 마이오신 중에서는 20~30%만을 차지하지만, 중심부의 신경 분포 부위에 밀 집됨을 증명하였다. 이들 결과는 MyHCeom이 전체 마이오 신에서 차지하는 분율은 적지만 한 부위에 집중됨으로써 외안근의 빠른 수축 운동에 중요한 역할을 할 수 있음을 시 사한다. 현재까지 사람을 대상으로 MyHCeom의 부위별 분 율을 분석한 연구는 없어, 저자들은 사람 외안근에서도 토 끼에서와 마찬가지로 중심부와 말단부에서 MyHCeom의 분율이 변화하는지 알아보고자 하였으며, 다른 MyHC 아형 의 분율도 함께 조사하고 비교하였다.
대상과 방법
2006년 1월부터 2007년 4월까지 삼성서울병원에서 사 후 안구 기증 의사를 밝힌 뇌사 환자를 대상으로 진료기록 검토 및 안과적 검사를 통해 적합한 대상자를 선정하였다.
기존에 안과 수술 병력이 없으며, 안구 외상의 과거력이 없
고 안구가 잘 보존되어 있는 환자를 대상으로 하였다. 연구 목적의 외안근 적출에 대해 가족들에게 설명 후 동의서에 서명을 받았으며, 본 연구에 대한 계획서 및 동의서는 본원 임상시험 심사위원회에서 승인을 받았다.
외안근적출술
세 뇌사 환자의 기증안(6안)을 대상으로 뇌사 상태에서 내직근, 외직근, 상직근, 하직근, 상사근, 하사근의 여섯 개 의 외안근을 적출하였다. 결막 절개 후 적출할 근육을 찾은 후 주위 결합 조직을 박리하고, 후 테논낭을 박리하여 외안 근을 노출하였다. 외안근 부착부 및 기시부에서 건을 절단 하여 근육의 전체 길이가 포함되도록 적출하였다. 부착부에 서 기시부까지 잘린 외안근을 건 부위를 제외하고 각각 동 일 길이가 되도록 4등분하여 가운데 두 부분은 중심부, 부 착부와 기시부의 두 부분은 말단부로 분류하여 보관하였다 (Fig. 2A).
전기영동 및 MyHC 아형 분율 측정
먼저 적출한 외안근을 -70℃의 액체 질소에 넣어 얼린 후 막자사발에 넣어 간 다음 마이오신 용출 완충액(pH 6.5)[300 mM KCl, 100 mM KH2PO4, 50 mM K2HPO4, and 1 mM EDTA (pH 8.0)]을 더하여 와동하였다. 이를 조 직마쇄기에 옮겨 얼음에 방치하여 5분간 분쇄하였다. 분쇄 한 외안근을 깨끗한 1.5 ml 시험관에 옮겨 13,000 rpm에서 5분간 두 번 원심분리하고, 상층액 만을 취하여 새 1.5 ml 시험관에 옮기고 SDS 시료 완충액을 넣어 100℃에서 5분 간 끓여 -20℃에 보관하였다. 이렇게 얻은 단백질을 Bradford 분석으로 정량하여 동량의 단백질을 sodium dodecyl sulfate/polyacrylamide gel 전기영동(SDS/PAGE) 을 하였다.
전기영동 겔은 Hofer SE400 Vertical Electrophoresis Unit에 맞게 준비하였고, 전기영동용 완충액은 각각 상층과 하층의 완충액으로 구분하여 사용하였다. 상층액의 조성은 0.1 M Tris, 150 mM Glycine, 0.1% SDS, 그리고 0.8% β -mercaptoethanol이며 하층액의 조성은 0.05M Tris, 75 mM Glycine, 그리고 0.05% SDS였다. 분리겔은 30%
glycerol, 8% acrylamide-bis (50:1), 0.2M Tris-Cl (pH 8.8), 0.1M glycine, 0.4% SDS, 0.06% ammonium persulfate, 0.05% N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine이 되도록 준비하였다. 분리겔을 거품이 들어가지 않도록 조심하여 붓 고 바로 증류수를 부어 30분 정도 굳힌 후, 분리겔이 굳으 면 증류수를 완전히 제거하고 comb을 꽂은 후 치쌓임겔
(stacking gel)을 부었다. 치쌓임겔은 5% glycerol, 4%
acrylamide-N,N'-methylene-bis-acrylamide (bis) (50:1), 70 mM Tris-Cl (pH 6.8), 4 mM EDTA, 0.4% sodium dodecyl sulfate (SDS), 0.06% ammonium persulfate, 0.1%
N,N,N',N'-tetra-methylethylenediamine이 되도록 준비 하였다. 치쌓임겔이 굳으면 comb을 빼고 상층 완충액으로 웰을 세척하였다. 먼저 웰을 상층 완충액으로 채운 뒤 시료 를 분주하고, 나머지 상층 및 하층 완충액을 구분하여 채우 고 4℃에서 7 mA (ampere 고정)로 약 20시간 이상 전기영 동하였다.
전기영동이 끝난 후 silver 염색을 하여 단백질을 확인하 였다. 50%의 methanol, 10%의 acetic acid, 40%의 증류 수로 만든 고정 용액으로 2시간 이상 고정하고, 10%의 ethanol, 5%의 acetic acid, 85%의 증류수로 만든 고정 용 액으로 15분씩 4번 고정을 반복하였다. Sodium thiosulfate 0.248 g에 증류수로 최종 1L가 되도록 만든 재수화 용액으 로 30분간 재수화 과정을 거친 뒤 15분씩 3번 증류수로 세 척한 후, silver nitrate 0.204 g과 formalin 75 ul를 더하고 증류수로 100 ml가 되도록 만든 silver 용액으로 30분간 염 색과정을 거친 뒤 증류수로 10초, 2분간 짧게 세척하였다.
100 ml에 sodium carbonate 2.97 g, formalin 50 ul에 재수 화 완충액 2 ml를 더하고 증류수로 최종 100 ml가 되도록 만든 발색 용액으로 발색 과정을 거친 뒤 3% acetic acid 용액으로 고정하였다. 이렇게 염색한 겔은 hp psc 2310 scanner를 사용하여 scan한 뒤 Quantity One (Bio-Rad, USA) program을 이용하여 densitometer를 통해 각 MyHC 분율을 측정하였다.
결 과
실험에 사용된 외안근은 각각 46세 남자, 40세 남자, 53 세 여자 뇌사 환자로부터 기증받았으며, 사인은 모두 뇌출 혈이었다. 외안근 적출은 모두 뇌사 상태에서 이루어졌다.
적출된 외안근 전체를 대상으로 한 전기영동 결과, 기존 에 알려진 MyHC 아형의 전기영동 패턴과 마찬가지로, MyHCI (the fastest migrating band), MyHCeom, MyHCIIa, 그리고 MyHCIIx (the slowest migrating band) 네 개의 band가 관찰되었다(Fig. 1).9전체적인 분율은 MyHCIIa가 가장 컸고, 그 다음으로 MyHCeom, MyHCI, MyHCIIx의 순서였다. MyHCeom의 경우 전체 MyHC 아형 중 약 25%
의 비율을 차지하였다. 가장 느린 MyHCemb의 경우 MyHCIIx의 band와 같은 속도로 움직이므로, 전기영동을 통한 분석에서 서로 분리하여 분석하는 것이 불가능하여 이 두 MyHC 아형을 함께 분석하였다.
Figure 1. SDS-PAGE of the human superior, medial, lateral and inferior rectus muscles and inferior oblique muscle (MyHCI, MyHCeom, MyHCIIa, and MyHCIIx).
Figure 2.Longitudinal variation in myosin heavy chain (MyHC) expression detected by high resolution SDS-PAGE. (A) Superior rectus muscle was cut into two parts as shown. (B) Myofibrils prepared from each region identified in A were analyzed by SDS-PAGE and stained with silver. The bands were identified by comparison with the migration positions in muscles of known myosin composition,5 and as described in Materials and methods. (C) Relative amounts of each MyHC were determined by scanning with visible light and densitometer.
Figure 3. Relative proportions of myosin heavy chain (MyHC) isoforms of extraocular muscles.
마이오신 아형의 종적 분포를 분석하기 위해 외안근의 중심부와양쪽 말단부에서MyHC 아형의 상대적 분율을 비 교분석하였으며, 분석 결과 MyHCeom의 분율은 외안근의 말단부보다 중심부에서 높았으며, MyHCIIa의 경우 반대로 외안근의 말단부에서 중심부보다 높았다. MyHCeom은 외 안근 중심부에서 전체 마이오신 아형의 27%를 차지하였으 며, 근위부와 원위부, 양 말단부에서는 약 24%의 분율을 보였다(Fig. 2). 외안근의 말단부에서는 MyHCIIa와 MyHCI 이 주요 마이오신 아형으로서(Fig. 1), 이는 이전의 면역조 직화학염색 연구들의 결과와 일치하였다.1,2,10 외안근 말단 부에서 MyHCemb와 MyHCIIx 아형은 전체 마이오신 아형 의 21%를 차지하였다.
외안근 종류별로 MyHC 아형의 분율을 비교하였을 때, MyHCI, MyHCeom, MyHCIIa는 네 개의 직근 및 하사근에 서 모두 비슷한 분율을 나타내었으며, MyHCIIx의 경우 하 직근에서 높은 분율을 보였다(Fig. 3).
고 찰
외안근에서의 MyHC 발현을 분석한 이전 연구 결과에 따 르면 고속, 배아형(fast, embryonic) MyHC와 저속(slow) MyHC의 발현이 서로 다르게 나타나는 것으로 알려져 있는
데,1,2,10-13고속-반응형 (fast-reactive) 아형의 경우 근육의
중심부에서 주로 발현되는 반면 발달형(developmental) 아 형의 경우 근육의 말초 부분으로 갈수록 더 높은 발현 양상 을 보이는 것으로 나타났다. Briggs and Schachat8은 토끼 의 외안근을 이용해 MyHCeom의 분포를 연구하였으며, 토 끼 외안근의 중심부에 비교적 많은 양의 MyHCeom이 분포 한다고 보고하였다. 또한 저자들은 endplate band region에 서 발생하는 흥분 신호가 대부분의 외안근 근섬유들을 움직 여 초고속 수축(superfast contraction)을 유발하는 기전을 MyHCeom 분포의 차이를 이용하여 설명할 수 있다고 주장
하였다.8즉, 이들은 endplate band region이 있는 중심부에 MyHCeom이 밀집됨으로써 전기적 흥분 신호를 받아 외안 근의 빠른 수축을 담당할 수 있을 것으로 설명하고 있다.8 MyHCeom 아형이 외안근의 매우 특화된 기능과 관련되 어 있을 가능성이 제기되었지만, 현재까지 사람을 대상으로 MyHCeom의 부위별 분율을 분석한 연구는 없는 상태이다.
본 연구에서는 사람의 외안근에서 근육의 각 부분에 따라 다르게 나타나는 MyHC 아형의 분포를 정량적으로 분석하 였다. 본 연구의 결과는 사람 외안근의 기능을 이해하는 데 있어서 중요한 정보를 제공해 줄 것으로 생각되며, 또한 MyHCeom이 외안근의 기능에 미치는 영향을 밝혀내는 데 있어서 유용한 정보를 제공해 줄 수 있을 것으로 기대된다.
본 연구는 외안근 섬유에서 나타나는 고속(fast) MyHC 들의 복잡한 발현 양상을 보여주고 있다. MyHCIIa의 경 우 근육의 말초에서 MyHCeom에 비해 높은 발현 양상을 나타내었으나 근육의 중심부에서는 MyHCeom의 발현이 MyHCIIa와 유사하게 측정되었으며, 이는 MyHCIIa와 MyHCeom의 발현을 조절하는 기전이 서로 다르다는 점을 시사하는 결과로 생각된다. 또한 특히 이번 연구에서는 신속 수축에 주로 작용하는 초고속(superfast) MyHC인 MyHCeom의 분포를 중점적으로 분석하였는데, 그 결과 MyHCeom이 주로 외안근의 중심부에서 발현함을 확인할 수 있었다. 아직 MyHC isoform의 발현을 조절하는 기전은 정확히 알려져 있지 않으나 MyHCeom이 주로 외안근의 중 심부에서 발현한다는 이번 연구의 결과는 MyHCeom의 발 현이 중심부에 밀집됨으로써 안구 운동을 조절하는 데 있 어서 중요한 인자로 작용할 수 있음을 시사한다. 또한 중심 부에 endplate가 존재한다는 점에 착안하여 신경 지배가 MyHCeom의 발현에 영향을 미칠 수 있음을 주장한 기존의
연구8,14,15를 뒷받침할 수 있는 결과로 생각된다.
Briggs and Schachat8은 토끼 실험에서 MyHCeom이 endplate band가 있는 외안근의 중심부에 풍부하며, 전체 마이오신의 50%를 차지하고, 외안근의 말단부에서는 거의 발견되지 않음을 보고하였다. 본 연구에서는 MyHCeom이 사람 외안근의 중심부에 다수 분포함을 알 수 있었으나 중 심부에서 발현된 MyHCeom의 분율은 토끼의 외안근을 이 용한 연구8와 비교하였을 때 비교적 낮은 수치였다. 이러한 결과는 서로 다른 연구 대상에 의한 차이로 생각되나 근육 에 대한 longitudinal section을 시행하는 방법의 차이에 의 한 영향 또한 고려해야 할 것이다. 저자는 근육을 중심부와 말초부의 두 개의 부분으로 나누어 분석을 시행하였다. 그 러나 토끼의 외안근을 이용한 이전 연구8에서는 근육을 여 섯 개의 부분으로 나누어 각 부분마다 분석을 시행하였으 며, 따라서 본 연구에서 시행한 방법에 비해 좀 더 중심부
와 말초부의 차이를 뚜렷하게 관찰할 수 있었을 것으로 생 각된다.
본 연구의 제한점은 다음과 같다. 우리 연구에서는 외안 근을 중심과 말초 두 부분으로만 구분하여 분석을 시행하 였으며, 따라서 근육의 각 부분에 따른 좀 더 세밀한 결과 를 얻는 데에는 한계가 있는 것으로 생각된다. 또한 본 연 구에서는 MyHC에 대한 면역조직화학적인 분석을 시행하 지 않음으로써 아형 분석 결과를 재차 검증하지 못하였다.
향후 면역조직화학적인 분석을 추가적으로 시행하고 이를 전기영동 결과와 비교하여 분석하는 기술적 보완과 실제 외안근의 움직임에 대한 기능적 또는 영상의학적 분석법이 추가된 발전된 연구가 필요할 것으로 사료된다.
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=ABSTRACT=
Distribution of Myosin Heavy Chain Isoform in Human Extraocular Muscles
Kyung-Ah Park, MD, Sei Yeul Oh, MD
Department of Ophthalmology, Samsung Medical Center, Sungkyunkwan University School of Medicine, Seoul, Korea
Purpose: To provide quantitative data on the distribution of MyHCeom and compare the proportion of myosin heavy chain (MyHC) isoforms between the central and peripheral regions of human extraocular muscles (EOMs).
Methods: Medial rectus, lateral rectus, superior rectus, inferior rectus, superior oblique, and inferior oblique muscle samples were taken from three men with brain death. To examine the longitudinal distribution of myosin isoforms, the muscles were divided into central and peripheral portions of equal length. Electrophoresis and densitometry were used to quantify the distribution of MyHC isoforms.
Results: Electrophoresis of whole‐muscle extracts of sampled EOMs revealed four MyHC bands that were identified as MyHCI, MyHCeom, MyHCIIa, and MyHCIIx. The proportion of MyHCeom was higher in the central region, whereas the proportion of MyHCIIa was higher in the peripheral region. The relative proportions of MyHCI, MyHCeom, and MyHCIIa were not significantly different among the EOMs. There was a tendency for higher levels of MyHCIIx in the inferior rectus muscle.
Conclusions: The proportion of MyHCeom was higher in the central region of human EOMs. Further studies are needed to investigate the consequences of this distributional difference on the function of EOMs.
J Korean Ophthalmol Soc 2009;50(2):285-289
Key Words: Electrophoresis, Human extraocualr muscle, Myosin heavy chain isoform
Address reprint requests to Sei Yeul Oh, MD
Department of Ophthalmology, Samsung Medical Center, Sungkyunkwan University School of Medicine
#50 Ilwon‐dong, Gangnam‐gu, Seoul 135-710, Korea.
Tel: 82‐2‐3410‐3568, Fax: 82‐2‐3410‐0074, E-mail: [email protected] 12) Rubinstein NA, Hoh JF. The distribution of myosin heavy
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