心正格 穴位(少衝⋅大敦, 少海⋅陰谷)에 대한 迎隨 및 捻轉 補瀉 鍼刺가 국소 뇌허혈 유발 흰쥐의
항뇌세포고사와 신경보호 효과에 미치는 영향
변정윤1⋅윤대환1⋅나창수1
1동신대학교 한의과대학 경혈학교실
Anti-apoptotic and neuroprotective effects of acupuncture techniques of tonification or sedation at HT9⋅LR1, HT3⋅KI10 on focal brain ischemic
injury induced by intraluminal filament insertion in rats
Jeong-Yun Byun1, Dae-Hwan Youn1, Chang-Su Na1
1Dept. of Meridian & Acupoint, College of Oriental Medicine, Dongshin University
Abstract
Objectives : Acupoints of LR1(Dadun)·HT9(Shaochong), KI10(Yingu)·HT3(Shaohai) are used as controlling the diseases from heart problems. Especially, when they are used, tonification or sedation techniques method is taken as a controlling the medication for an early stroke in the Korean medicine. So the aim of this study is to investigate the anti-apoptotic and neuroprotective effects of Acupuncture techniques of tonification or sedation at LR1·HT9, KI10·HT3 on the focal ischemia induced by intraluminal filament insertion in rats.
Materials and Methods : The focal ischemia was induced by intraluminal filament insertion into middle cerebral artery. The animals were divided into five groups (n=7 in each group) : Control group, no therapy group after ischemia induced; AT-1; acupuncture therapy group at LR1·HT9, KI10·HT3 after ischemia-induced. AT-2; acupuncture therapy at right LR1, HT9(forward direction), KI10·HT3(opposite direction) inserting to the direction of route of the each meridian. AT3; acupuncture therapy at right LR1, HT9(twirling forward with the thumb of right hand 9 times), KI10·HT3(twirling forward with the forefinger of right hand 6 times) AT-4; acupuncture therapy at right LR1, HT9(forward direction, twirling forward with the thumb of right hand 9 times), KI10·HT3(opposite direction, twirling forward with the forefinger of right hand 6 times) inserting to the direction of route of the each meridian. The anti-apoptotic and neuroprotective effects of Acupuncture techniques of tonification or sedation at LR1, HT9, KI10·HT3 were observed by Bax, Bcl-2, mGluR5, Cytochrome c, Cresyl violet and ChAT-stain.
Results : The intensity of Bax and Bax/Bcl-2 ratio were increased in ACU-2 and ACU-4 group but decreased in ACU-3 group. The intensity of mGluR5 was increased in ACU-1, ACU-2, ACU-3 and ACU-4 group. The intensity of cytochrome c was decreased in ACU-3 and ACU-4 group. The density of neurons stained by Cresyl violet and ChAT were increased in ACU-1, ACU-3 and ACU-4 group.
Conclusions : Our study suggests that acupuncture therapy of tonification at LR1, HT9 by twirling forward with the thumb of right hand 9times, sedation at KI10·HT3 by twirling forward with the forefinger of right hand 6 times after perpendicularly inserting needle shows anti-apoptotic and neuroprotective effects on cholinergic neuron in focal cerebral ischemia of the stroke in rats.
Key words : Ischemia, Acupuncture techniques, LR1(Dadun), HT9(Shaochong), KI10(Yingu), HT3(Shaohai)
Ⅰ. 緖 論
鍼刺 치료의 근본은 『靈樞․根結』1)에
“用鍼之要, 在于知陰與陽, 調陰與陽, 精氣乃
⋅교신저자 : 나창수, 전남 나주시 대호동 252, 동신대학교 한의과대 학 경혈학교실, Tel. 061-330-3522, Fax.
061-330-2900, E-mail: [email protected]
․이 논문은 보건복지부 2007년 한방치료기술개사업의 연구비 지원 에 의하여 수행되었음(과제번호 B070046)
․투고 : 2008/03/07 심사 : 2008/03/19 채택 : 2008/03/24
光”, 『難經․七十二難』2)에 “調和之方, 必 在陰陽”이라 하였듯이 치료혈위의 取穴과 鍼刺時 手技法에 의해 이루어지는 陰陽調和 에 있으며, 『素問․瘧論』1)에 “有餘者瀉之, 不足者補之”라 하였듯이 實證에는 瀉法을, 虛證에는 補法을 사용하여 調和陰陽 작용을 발휘케 한다고 하였다3).
舍岩鍼法은 五兪穴의 작용과 그 원리를 도입한 補瀉鍼法으로 五兪穴의 五行配屬에 따라 本經補瀉法과 他經補瀉法을 결합하고
“虛則補其母”, “實則瀉其子”, “虛則抑其官”,
“實則補其官”하는 鍼法이며, 臟腑의 盛衰에 따라 虛할 경우 正格을, 實할 경우 勝格을 사용하게 된다4).
心은 생리기능상 血脈과 神志를 주관하고 있으며, 心의 기능이 失常되면 혈맥 운행과 情志 활동에 영향을 미치는 병변이 발생하 게 되며, 辨證에 있어서 心火亢盛, 心血瘀阻, 痰迷心竅, 痰火擾心 등의 實證性 病證과 心 血虛, 心陰虛, 心氣虛, 心陽虛, 心陽暴脫 등 의 虛證性 病證으로 분류할 수 있으며, 舍岩 鍼法의 운용에서는 心實證에 心勝格, 心虛證 에 心正格을 사용한다5).
근래 舍岩鍼法에 관한 연구로는 이 등6), 사공 등7), 김 등8), 정 등9), 김 등10)은 舍岩 鍼法 형성 시기 및 의의에 대하여 문헌적 고찰을, 이 등11)은 腰脚痛 환자에 대하여 體 鍼療法과 舍岩鍼法을 幷用하여 치료한 경우 가 더욱 효과적임을, 박 등12)은 膀胱正格 시 술이 뇌졸중 환자의 혈압을 하강시킴을, 안 등13)은 心勝格 시술이 화병 환자의 주요 증 상을 개선시킴을, 임 등14)은 心正格 시술이 자율신경계 항진을 완화시킴을 각각 보고하
였으나, 舍岩鍼法 중 心正格을 활용하여 補 瀉手技法에 따른 국소 뇌허혈의 개선에 관 한 연구 보고는 아직 접하지 못하였다.
이에 저자는 心正格 穴位 大敦(LR1)․少 衝(HT9) 補, 陰谷(KI10)․少海(HT3) 瀉에 대한 補瀉手技法이 腦虛血에 미치는 영향을 究明하고자 intraluminal filament 삽입술에 의하여 유발된 국소 뇌허혈 흰쥐에게 心正 格 穴位 상응 부위에 捻轉 및 迎隨 補瀉手 技法을 시술한 후, hippocampus 부위의 항 뇌세포 고사와 관련된 인자인 Bax, Bckl-2, mGluR5 및 Cytochrome c를 관찰하였고, 조 직학적으로 신경보호 효과를 관찰하여 다음 과 같은 지견을 얻었기에 보고하는 바이다.
Ⅱ. 材料 및 方法
1. 동물
실험동물은 삼육동물센터로부터 구입한 260∼300g, 8주령의 수컷 Sprague-Dawley계 흰쥐로, 일주일간 실험실 환경(온도 22±3℃, 습도 50±10%)에 적응시킨 후 사용하였다.
각 cage당 3∼4마리씩 넣었으며, 물과 사료 (pellet, Samyang, Korea)를 자유로이 섭취 하도록 하였다.
2. 실험군 분리
실험군들은 좌측중대뇌동맥을 폐색시켜 뇌허혈 誘發 후 3일째부터 鍼刺를 시행하 지 않는 대조군(Control, n=7), 大敦·少衝, 陰谷·少海에 鍼刺時 直刺한 大敦·少衝, 陰谷
⋅少海 直刺群(ACU-1, n=7), 大敦·少衝에
經絡의 흐름에 循하는 體幹 및 肢節 방향으 로, 陰谷·少海에 經絡의 흐름에 逆하는 肢節 및 體幹 방향으로 鍼刺한 大敦·少衝, 陰谷·
少海 迎隨補瀉群(ACU-2, n=7), 大敦·少衝, 陰谷·少海에 直刺한 후, 大敦·少衝은 拇指向 前(시계방향)으로 9회 및 陰谷·少海은 食指 向前(반시계방향)으로 6회 捻轉 手技한 大 敦⋅少衝, 陰谷⋅少海 捻轉直刺群(ACU-3,
n=7), 大敦⋅少衝에 經絡의 흐름에 循하는 體幹 및 肢節 방향으로 鍼刺한 후 拇指向前 (시계방향)으로 9회 염전수기와 陰谷⋅少海 에 經絡의 흐름에 逆하는 肢節 및 體幹 방 향으로 鍼刺한 후 食指向前(반시계방향)으 로 6회 捻轉 手技한 大敦·少衝, 陰谷·少海 捻轉迎隨補瀉群(ACU-4, n=7) 등으로 분리 하였다(Table 1).
Table 1. Distribution of Groups
내용군분류 뇌허혈 유발 유발 후 처치 내용
대조군 (Control)
좌측중대뇌동맥을 폐색시
켜 뇌허혈을 유발시킴 유발후 3일째부터 14일간 鍼刺를 시행하지 않음 直刺群
(ACU-1)
좌측중대뇌동맥을 폐색시 켜 뇌허혈을 유발시킴
유발후 3일째부터 14일간 2일에 1회씩 大敦·少衝, 陰谷·少 海에 直刺로 鍼刺함.
迎隨補瀉群 (ACU-2)
좌측중대뇌동맥을 폐색시 켜 뇌허혈을 유발시킴
유발후 3일째부터 14일간 2일에 1회씩 大敦·少衝에 經絡의 흐름에 循하는 體幹 및 肢節 방향으로, 陰谷·少海에 經絡 의 흐름에 逆하는 肢節 및 體幹 방향으로 鍼刺함.
直刺․捻轉補瀉群 (ACU-3)
좌측중대뇌동맥을 폐색시 켜 뇌허혈을 유발시킴
유발후 3일째부터 14일간 2일에 1회씩 大敦·少衝, 陰谷·少 海에 直刺한 후, 大敦·少衝은 拇指向前(시계방향)으로 9회, 陰谷·少海은 食指向前(반시계방향)으로 6회 捻轉 手技함.
迎隨․捻轉補瀉群 (ACU-4)
좌측중대뇌동맥을 폐색시 켜 뇌허혈을 유발시킴
유발후 3일째부터 14일간 2일에 1회씩 大敦·少衝에 經絡의 흐름에 循하는 體幹 및 肢節 방향으로 鍼刺한 후 拇指向 前(시계방향)으로 9회 염전수기하며, 陰谷·少海에 經絡의 흐름에 逆하는 肢節 및 體幹 방향으로 鍼刺한 후 食指向 前(반시계방향)으로 6회 捻轉 手技함.
3. 取穴 및 鍼刺
大敦(LR1 : Dadun)은 lower limb의 1st distal phalanx의 nail의 lateral side에 취하 였고, 少衝(HT9 : Shaochong)는 upper limb의 5st distal phalange의 nail root의 medial side의 옆에 취하였고, 陰谷(KI10 : Yingu)은 膝窩橫紋 가상선상 내측으로 tibia 의 medial condyle 후방에 취하였고, 少海
(HT3 : Shaohai)는 肘窩橫紋 가상선상 내 측으로 humerus의 medial epicondyle의 내측 에 취하였으며, 이는 모두 인체에 상응하는 부위로 취하였다. 각각 1회씩 흰쥐의 우측의 穴位에 자침하였으며, 鍼은 毫鍼(No.3-0.5, 행림, 한국)을 이용하였다. 정상군과 대조군 을 제외한 각 군들은 ischemia 誘發 3일 후 부터 각 군들은 1회/2일(오전 10시) 치료를 시작하여, 14일간 총 7회에 걸쳐 30초 동안
留鍼 및 시계방향 및 반시계방향으로 9회 및 6회의 捻轉手技를 시행하였으며, 15일째 에 흰쥐를 희생시켜 腦를 신속히 적출하거 나 관류 고정하였다. 鍼刺 深度는 피하를 통 과하여 捻轉 및 迎隨 手技法 시행이 가능할 수 있는 정도의 깊이로 하였다. 鍼刺 手技法 은 전 실험기간 동안 숙련된 전문가 1인이 계속하여 시술하였다.
4. Occlusion에 의한 허혈성 국소 뇌손 상 유발
局所 腦虛血은 Longa 등15)의 방법에 따라 좌측중대뇌동맥을 폐색시켜 만들었다. 흰쥐 를 80% O2와 20% CO2가 혼합된 가스에 5% isoflurane (Choongwae, Korea)을 이용 하여 흡입마취 유도를 한 후 2% isoflurane 으로 계속 유지시켰다. 흰쥐의 직장에 체온 측정 probe를 삽입하고 가온 등과 가온 메 트리스를 이용하여 마취유지 기간동안 체온 을 38℃로 유지하였다. 좌측 중대뇌동맥을 폐색하기 위하여 경부 정중선을 따라 피부 를 절개하고 흉골혀근과 흉골저작근 사이에 좌측 총경동맥을 노출한 후 좌측 내경동맥 의 원위부를 최대한 확보한 후 미세혈관 Clip(WPI, USA)을 이용하여 결찰하였고, 좌측 내경동맥과 intraluminal filament 사이 의 출혈을 방지하기 위하여 6-0 silk suture 실을 이용하여 좌측 총경동맥 근위부 및 좌 측 외경동맥 분지부를 결찰하였다. 좌측 총 경동맥의 좌측 외경동맥과 좌측내경동맥 분 지부에서 1cm 정도 되는 좌측 내경동맥의 원위부에 미세혈관 가위(W.P.I., USA)를 사 용하여 구멍을 내었다. 미세혈관 클립을 제
거한 후 좌측 내경동맥내로 20mm의 치과 인상 제(Durelon, Germany)가 발라진 intraluminal filament(직경 0.28mm rounded tip)를 좌측 내경동맥상의 구멍에 intraluminal filament 가 faint resistance의 느낌이 느껴질 때 까 지(약 17mm) 부드럽게 삽입하여 그 끝이 좌측 중대뇌동맥까지 도달하도록 하였으며, 이로써 좌측 중대뇌동맥부위에 국소 허혈을 유발하였다. 출혈을 방지하기 위하여 좌측 내 경동맥상의 intraluminal filament 삽입부위를 가볍게 묶은 후 절개된 피부를 봉합하였다.
국소뇌허혈 유발에 대한 검증은 실험 수행 이 완료된 후 흰쥐를 희생시켜 삽입된 intraluminal filament가 중대뇌동맥과 전대 뇌동맥의 기시부 사이에 위치된 것이 확인 된 개체만을 실험 대상으로 삼아 관찰을 진 행하였다.
5. Total RNA 분리 및 Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) 1) Total RNA 분리
Total RNA의 분리는 좌측 hippocampus 부위의 조직(3g)을 500μl TRIZOL reagent (Gibco-BRL, USA)로 균질화하고 균질액에 대해 1 ml의 chloroform(Sigma, USA)을 가 하여 15초 동안 흔들어 잘 혼합한 후, 실온 상태에서 15분 방치하고 난 다음 세포 유잔 물을 제거하기 위하여 4℃, 14,000 rpm에서 15분 동안 원심분리하였다. 원심분리로 얻어 진 상층액과 1ml의 isopropanol(sigma, USA) 을 첨가하여 실온상태에서 5분 동안 방치한 후 RNA pellet을 얻기 위하여 4℃, 14,000
rpm에서 8분간 원심분리하고, 원심분리로 생긴 pellet에 냉장 보관된 70% ethanol과 함께 DEPC를 넣고 4℃, 7,500 rpm에서 5분 간 원심분리 후 pellet만 남기고 모두 제거 하고, 남은 ethanol은 실온에서 10분간 방치 시켜 건조시킨 다음 DEPC-treated water에 녹 여 spectrophotometer(Eppendorf, Germany)에 서 OD260 값을 읽어 RNA의 순도 및 농도 를 정량하였다. 이들 뇌조직의 total RNA는 사용시까지 -70℃에서 보관하였다.
2) RT-PCR
분리된 total RNA 2μg과 2.5μl Oligo (dT), DEPC-treated water를 RT Premix (Bioneer, Korea)에 넣어 Mastercycler gradient(Eppendorf, Germany)를 이용하여 50 μl cDNA를 합성하여 PCR 증폭을 위한 template로 사용하였다. Reverse transcription temperature cycle은 42°C에서 1시간 동안 cDNA synthesis, 94℃에서 5분 동안 denature 그리고 4°C에서 5분 동안 cooling 시키는 단계를 거쳤다.
이때 housekeeping 유전자인 glyceraldehyde- 3-phosphate dehydrogenase(GAPDH)(sense primer: 5'-TGCATCCTGCACCACCA ACT-3', antisense primer: 5'-CGCCTGCTTCACCACCTTC-3') 를 internal control로 사용하였다. 흰쥐의 특 이 primer는 PCR-premix kit (Bioneer, Korea)를 사용하였다. Bax Polymerase chain reaction은 cDNA 2㎕, Bax sense primer 1μl, Bax antisense primer 1μl, DEPC-treated water를 PCR Premix(Bioneer, Korea)에 넣었다. PCR temperature cycle은
cDNA의 증폭을 위하여 95°C에서 300초 동 안 pre-denaturation, 94°C에서 40초 동안 melting, 54°C에서 40초 동안 annealing, 72°C에서 90초 동안 extension하는 과정을 30회 반복 수행하고 마지막 cycle에서 72°C 에서 600초 동안 extension 단계를 거쳐 Bax 유전자증폭을 Primer (sense primer: 5'-GT TTCAAGGATCGAGCAG-3', antisense primer:
5'-CATCTTCTTCCAGATGGTGA-3')를 이용하 여 Mastercycler gradient(Eppendorf, Germany) 에서 시행하였다.
Bcl-2 Polymerase chain reaction은 cDNA 2μl, Bcl-2 sense primer 1μl, Bcl-2 antisense primer 1μl, DEPC-treated water를 PCR Premix(Bioneer, Korea)에 넣었다. PCR temperature cycle은 cDNA의 증폭을 위하여 95°C에서 300초 동안 pre-denaturation, 94°C에 서 40초 동안 melting, 55°C에서 40초 동안 annealing, 72°C에서 90초 동안 extension하는 과정 을 30회 반복 수행하고 마지막 cycle에서 72°C 에서 600초 동안 extension 단계를 거쳐 Bcl-2 유전자증폭을 Primer(sense primer: 5'-ACTT TGCACAGATGTCCAGT-3', antisense primer:
5'-CGGTTCAGGTACTCAGTCAT-3')를 이용 하여 Mastercycler gradient(Eppendorf, Germany) 에서 시행하였다.
mGluR5 Polymerase chain reaction은 cDNA 2μl, mGluR5 sense primer 1μl, mGluR5 antisense primer 1μl, DEPC-treated water를 PCR Premix(Bioneer, Korea)에 넣었 다. PCR temperature cycle은 cDNA의 증폭을 위하여 95°C에서 300초 동안 pre-denaturation, 94°C에서 40초 동안 melting, 55°C에서 40초
동안 annealing, 72°C에서 90초 동안 extension하는 과정을 30회 반복 수행하고 마지막 cycle에서 72°C에서 600초 동안 extension 단계를 거쳐 mGluR5 유전자증폭을 Primer (sense primer: 5'-TCCAATCTGCTCCTCCTACC-3', antisense primer: 5'-CAACGATGAAGAACTCTGCG-3') 를 이용하여 Mastercycler gradient(Eppendorf, Germany)에서 시행하였다. 이렇게 증폭된 DNA를 ethidium bromide(EtBr, 10mg/ml) 를 포함한 1.5% agarose gel 상에서 0.5x TBE buffer (80mM Tris-HCL, 80mM boric acid, 2mM EDTA, pH8.3)로 50V에서 전기 영동시킨 후 transmitter scanning videodensitometer(Bioneer, Korea)에 넣고 감광시켰다. Intensity는 image master VDS (1D ver.2.1, Pharmacia biotech, USA)로 정 량하였다.
6. Western blotting
1) Protein preparation
적출된 뇌의 좌측 hippocampus를 신속히 액체 질소에 급속 냉동시키고 분석할 때까 지 -70℃에서 보관하여, Cytochrome C 단백 발현을 Western blot방식을 이용하여 관찰 하였다. 흰쥐의 hippocampus에 NP40 lysis buffer(pH8.0 50mM Tris HCl 150mM NaCl, 5mM EDTA, 0.2mM PMSF (Phenylmethyl-sulfonylfluoride), 1% NP-40, 1mM Benzamidine, 1μg/ml Trypsin inhibitor) 와 1x Protease Cocktail inhibitor(Roche) 혼합액 500μl를 넣어 homogenization 하였 다. 이 sample을 20분간 ice상태에 놓아둔
후 12,000rpm에서 20분간(4℃ 상태) 원심 분리한 후 상층액을 분리하였다. 이 sample 은 bicinchonic acid assay kit(Bio Rad, CA)를 사용해 정량하였다. 96 well plate에 BCA 용액(A:B＝20:1) 100 μl을 넣고 protein 5μl를 넣은 후 37℃에서 20분간 방 치시킨 후, 570nm에서 ELISA reader (Biorad, USA)를 사용하여 측정하였다.
2) Electrophoresis
12% polyacrylamide resolving gel은 30분 간 굳히고, 4% polyacrylamide staking gel은 resolving gel 위에 붓고 comb을 꽂아 30분 간 굳혔다. 각 sample은 4x SDS sample buffer(pH6.8 100mM Tris, 4% SDS, 20%
glycerol, 0.2% bromophenol blue, 200mM DTT, 10% 2-mercaptoethanol) 5μl에 정량 된 단백질 sample을 넣어 100℃에서 5분간 끓였다. Gel은 Gel running tank에 장착하고 pH8.3의 running buffer(0.025 M Tris, 0.192 M glycine, 10% SDS)를 붓는다. 80V(200 mA)로 전기 영동하였다.
3) Electrotransfer
전기영동이 끝난 gel은 transfer buffer(25 mM Tris, 192mM glycine, 20% methanol) 에 filter paper, gel, nitrocellulose membrane 순서로 얹고 20mA에서 20시간 transfer하였 다. Membrane은 5% nonfat milk와 TBST(0.1% Tween20 in pH7.4 Tris-based saline buffer)에 1 시간 동안 blocking하고 TBST로 3회 washing하였다. Cytochrome C
antibody(BD, USA)를 TBST(1:2000 dilution) 에 희석시켜 4℃에서 overnight하였다.
TBST로 4회 washing 후 horseradish peroxidase-labeled anti-mouse IgG(Cell signalling, USA)를 TBST(1:2000 dilution) 에 희석시켜 1시간 배양하고 TBST로 4회 washing하였다. Membrane은 TBST를 제거 한 후 enhanced chemiluminescence plus (Amersham, UK)를 넣은 후 3분 동안 반응 시켰다. 발현된 Cytochrome C의 band는 ECL film(Amersham, UK)을 develper (vivid, 1:5)와 Fixer(vivid, 1:5)에서 현상하 였다. 발현된 Cytochrome C의 intensity는 image master VDS(1D ver.2.1, Pharmacia biotech, USA)로 정량하였다.
7. Immunohistochemistry
1) Cresyl violet 염색
모든 실험이 끝난 직후 흰쥐를 sodium pentobarbital (100mg/kg, i.p. Hanlim, Korea)로 마취시킨 후, 0.9% saline 200ml에 이어 phosphate buffer로 준비한 4%
formalin 용액(fixative) 800ml로 심장을 통 해 관류하였다. 처음 고정액 200ml는 2분간 빠른 유속으로, 그리고 나머지 800ml는 25분 간에 걸쳐 천천히 관류하였다. 고정이 끝난 쥐는 뇌를 꺼내 같은 고정액으로 2시간 경 과 후 고정시키고, 20% sucrose가 함유된 phosphate buffered saline(PBS)에 넣어 4
℃에서 하루 동안 보관하였다. 다음날 뇌를 급속 냉동한 후 뇌 조직을 hippocampus 부 위를 30μm의 두께로 잘랐다. PBS로 조직을
몇 차례 씻고 xylene(5min), 100%
alcohol(2min), 95% alcohol(1min), 70%
alcohol(1min), D.W.(2min)순으로 옮겨 담 아 탈지, 탈수를 시킨 다음 cresyl violet buffer(5min)로 염색을 하였다. 염색이 끝난 조직은 광학현미경(Olympus, Japan)을 사 용하여 40배로 확대하여 관찰하였고, 신경세 포의 밀도를 Scion image program(Scion Corp. MD, USA)을 이용하여 측정하였다.
2) Choline acetyltransferase(ChAT)
뇌 조직을 PBS에 3회 정도 세척한 후 ChAT 유전자 발현 연구에 가장 널리 사용 되고 있는 primary sheep ChAT anti-body(1:1,500, polyclonal, Cambridge Research Bio chemicals, USA)를 사용하였 다. 1차 항체는 PBS에 0.3% Triton X-100 을 첨가한 PBST에서 2% 토끼 혈청과 0.1% sodium acid(Sigma, USA)로 2000배 희석하여 준비하였다. 뇌 조직은 1차 항혈청 에 4℃에서 72시간 동안 지속적으로 흔들어 주면서 배양하였다. 그 후 3번 이상 조직을 PBST로 씻은 다음 2시간 동안 실온에서 2% 토끼 혈청을 함유하는 PBST에서 200배 희석한 biotinylated anti-sheep serum (Vector Laboratories, USA)에 반응시켰다.
PBST로 3번 씻은 다음, 뇌 조직은 실온에 서 2시간 동안 Vectastain Elite ABC reagent(Vector Laboratories, USA)에 위치 시켰다. PBS로 몇 번 헹군 다음 조직을 nickel chloride로 강화시키고 착색제로서 diaminobenzidine (DAB)을 사용하여 발현 시켰다. 대조군 조직에는 1차 항체를 생략하
거나 nonimmuno sheep serum으로 대체하였 는데, 이 경우 특정 표지가 나타나지 않았 다.
모든 처리를 거친 뇌 조직을 gelatine- coated slide에 고정하고 공기를 제거하면서 커버글라 스를 덮은 후 광학현미경으로 40배로 확대하여 hippocampus에서 ChAT- immunoreactive 신경 세포의 밀도를 Scion image program(Scion, USA)을 이용하여 측정하였다.
8. 통계처리
모든 측정값은 Excel statistic program (Microsoft, USA)을 이용하여 평균치와 표 준오차(mean±standard error)로 표시하였고, 각 실험군 간의 통계학적 분석은 비모수적 방법으로 Mann-Whitney U test를 시행하였 다. 각 실험군은 대조군에 비하여 α=0.05 수준(P<0.05)과 α=0.01 수준(P<0.01)에서 유의성을 검정하였다.
Ⅲ. 實驗 成績
1. Bax 발현
국소 뇌허혈을 유발시킨 흰쥐의 心正格 혈위에 補瀉法에 따라 침자를 시행한 후 hippocampal CA1 부위의 Bax 발현정도를 관찰한 결과, Control군은 392.2±8.81(×1000 OD), ACU-1군은 383.0±10.31(×1000 OD), ACU-2군은 746.5±37.29(×1000 OD), ACU-3 군은 282.5±32.56(×1000 OD), ACU-4군은 1064.9±55.95(×1000 OD)로, Control군에 비 해 ACU-2군(P<0.01), ACU-4군(P<0.01)은
유의하게 증가하였으나, ACU-3군(P<0.05)은 유의하게 감소하였다(Fig. 1).
Control ACU-1 ACU_2 ACU-3 ACU-4
Bax 21
kDa
0 200 400 600 800 1000 1200
Control ACU-1 ACU-2 ACU-3 ACU-4
**
* Intensity of Bax mRNA level (*1000/OD)
**
Fig. 1. Effect of acupuncture by needle manipulation at the LR1·HT9, KI10·HT3 on the intensity of Bax mRNA in the hippocampal CA1.
Results are shown as mean±S.E.. Control; no therapy group after ischemia-induced. ACU-1; acupuncture therapy group at LR1·HT9, KI10·HT3 after ischemia-induced. ACU-2;acupuncture therapy at right LR1·HT9(forward direction), KI10·HT3(opposite direction) inserting to the direction of route of the each meridian. ACU-3;
acupuncture therapy at right LR1·HT9(twirling forward with the thumb of right hand 9 times), KI10·HT3(twirling forward with the forefinger of right hand 6 times) ACU-4;acupuncture therapy at right LR1·HT9(forward direction, twirling forward with the thumb of right hand 9 times), KI10·HT3(opposite direction, twirling forward with the forefinger of right hand 6 times) inserting to the direction of route of the each meridian. *, P<0.05, **, P<0.01 as compared with the control group.
2. Bcl-2 발현
국소 뇌허혈을 유발시킨 흰쥐의 心正格 혈위에 補瀉法에 따라 침자를 시행한 후 hippocampal CA1 부위의 Bcl-2 발현정도 를 관찰한 결과, Control군은 478.2±6.44 (×1000 OD), ACU-1군은 468.1±11.87(×1000 OD), ACU-2군은 515.1±14.18(×1000 OD), ACU-3군은 529.0±28.49(×1000 OD), ACU-4
군은 477.5±5.87(×1000 OD)로, Control군에 비해 모든 침자군들에서 유의한 변화를 보 이지 않았다(Fig. 2).
Control ACU-1 ACU_2 ACU-3 ACU-4
Bcl-2 28
kDa
Fig. 2. Effect of acupuncture by needle manipulation at the LR1·HT9, KI10·HT3 on the intensity of Bcl-2 mRNA in the hippocampal CA1.
Results are shown as mean±S.E.. Control; no therapy group after ischemia-induced. ACU-1; acupuncture therapy group at LR1·HT9, KI10·HT3 after ischemia-induced. ACU-2;acupuncture therapy at right LR1·HT9(forward direction), KI10·HT3(opposite direction) inserting to the direction of route of the each meridian. ACU-3;
acupuncture therapy at right LR1·HT9(twirling forward with the thumb of right hand 9 times), KI10·HT3(twirling forward with the forefinger of right hand 6 times) ACU-4;acupuncture therapy at right LR1·HT9(forward direction, twirling forward with the thumb of right hand 9 times), KI10·HT3(opposite direction, twirling forward with the forefinger of right hand 6 times) inserting to the direction of route of the each meridian.
0 100 200 300 400 500 600 700
Control ACU-1 ACU-2 ACU-3 ACU-4
Intensity of Bcl-2 mRNA level (*1000/OD)
3. Bax/Bcl-2 ratio
국소 뇌허혈을 유발시킨 흰쥐의 心正格 혈위에 補瀉法에 따라 침자를 시행한 후, hippocampal CA1 부위의 Bax/Bcl-2 ratio를 관찰한 결과, Control군은 0.8±0.01, ACU-1 군은 0.8±0.04, ACU-2군은 1.5±0.10, ACU-3군 은 0.5±0.08, ACU-4군은 2.2±0.09로, Control
군에 비해 ACU-2군(P<0.01), ACU-4군 (P<0.01)은 유의하게 증가하였으나, ACU-3 군(P<0.05)은 유의하게 감소하였다(Fig. 3).
Fig. 3. Effect of acupuncture by needle manipulation at the LR1·HT9, KI10·HT3 on Bax/Bcl-2 ratio in the hippocampal CA1.
Results are shown as mean±S.E..Control; no therapy group after ischemia-induced. ACU-1;
acupuncture therapy group at LR1·HT9, KI10·HT3 after ischemia-induced. ACU-2; acupuncture therapy at right LR1·HT9(forward direction), KI10·HT3(opposite direction) inserting to the direction of route of the each meridian.
ACU-3; acupuncture therapy at right LR1·HT9(twirling forward with the thumb of right hand 9 times), KI10·HT3(twirling forward with the forefinger of right hand 6 times) ACU-4;acupuncture therapy at right LR1·HT9(forward direction, twirling forward with the thumb of right hand 9 times), KI10·HT3(opposite direction, twirling forward with the forefinger of right hand 6 times) inserting to the direction of route of the each meridian. *, P<0.05,
**, P<0.01 as compared with the control group.
0. 0 0. 5 1. 0 1. 5 2. 0 2. 5
Control ACU-1 ACU-2 ACU-3 ACU-4
Bax/Bcl-2 ratio **
**
*
4. mGluR5 발현
국소 뇌허혈을 유발시킨 흰쥐의 心正格 혈위에 補瀉法에 따라 침자를 시행한 후 hippocampal CA1 부위의 mGluR5 발현정도를 관찰한 결과, Control군은 1214.5±61.15(×1000 OD), ACU-1군은 1521.2±76.43(×1000 OD), ACU-2군은 1562.8±43.19(×1000 OD), ACU-3 군은 1497.1±22.70(×1000 OD), ACU-4군은 1598.0±53.78(×1000 OD)로, Control군에 비 해 ACU-1군(P<0.05), ACU-2군(P<0.01),
ACU-3군(P<0.05), ACU-4군(P<0.01) 모두 유의하게 증가하였다(Fig. 4).
Control ACU-1 ACU_2 ACU-3 ACU-4
mGluR5 335bp
GAPDH 349bp
0.0 400.0 800.0 1200.0 1600.0 2000.0
Control ACU-1 ACU-2 ACU-3 ACU-4
** **
*
Intensity of mGluR5 mRNA level (*1000 OD)
*
Fig. 4. Effect of acupuncture by needle manipulation at the LR1·HT9, KI10·HT3 on the intensity of mGluR5 mRNA in the hippocampal CA1.
Results are shown as mean±S.E.. Control; no therapy group after ischemia-induced. ACU-1; acupuncture therapy group at LR1·HT9, KI10·HT3 after ischemia-induced. ACU-2;acupuncture therapy at right LR1·HT9(forward direction), KI10·HT3(opposite direction) inserting to the direction of route of the each meridian. ACU-3;
acupuncture therapy at right LR1·HT9(twirling forward with the thumb of right hand 9 times), KI10·HT3(twirling forward with the forefinger of right hand 6 times) ACU-4;acupuncture therapy at right LR1·HT9(forward direction, twirling forward with the thumb of right hand 9 times), KI10·HT3(opposite direction, twirling forward with the forefinger of right hand 6 times) inserting to the direction of route of the each meridian. *, P<0.05, **, P<0.01 as compared with the control group.
5. Cytochrome c 발현
국소 뇌허혈을 유발시킨 흰쥐의 心正格 혈위에 補瀉法에 따라 침자를 시행한 후 hippocampal CA1 부위의 cytochrome c 발현 정도를 관찰한 결과, Control군은 180.1±6.03 (×1000 OD), ACU-1군은 186.9±4.59(×1000 OD), ACU-2군은 187.0±6.20(×1000 OD),
ACU-3군은 157.5±3.52(×1000 OD), ACU-4 군은 146.9±5.98(×1000 OD)로, Control군에 비해 ACU-3군, ACU-4군이 유의하게 감소 하였다(P<0.05)(Fig. 5).
Control ACU-1 ACU_2 ACU-3 ACU-4 Cytochrome
c
14 kDa
0 50 100 150 200 250
Co ntro l ACU-1 ACU-2 ACU-3 ACU-4
Intensity of Cytochrome c level (×1000 OD) *
*
Fig. 5. Effect of acupuncture by needle manipulation at the LR1·HT9, KI10·HT3 on the intensity of Cytochrome c in the hippocampal CA1.
Results are shown as mean±S.E.. Control; no therapy group after ischemia-induced. ACU-1; acupuncture therapy group at LR1·HT9, KI10·HT3 after ischemia-induced. ACU-2;acupuncture therapy at right LR1·HT9(forward direction), KI10·HT3(opposite direction) inserting to the direction of route of the each meridian. ACU-3;
acupuncture therapy at right LR1·HT9(twirling forward with the thumb of right hand 9 times), KI10·HT3(twirling forward with the forefinger of right hand 6 times) ACU-4;acupuncture therapy at right LR1·HT9(forward direction, twirling forward with the thumb of right hand 9 times), KI10·HT3(opposite direction, twirling forward with the forefinger of right hand 6 times) inserting to the direction of route of the each meridian. *, P<0.05, as compared with the control group.
6. Cresyl violet을 이용한 신경세포 손상 방어효과
국소 뇌허혈을 유발시킨 흰쥐의 心正格 혈위에 補瀉法에 따라 침자를 시행한 후 hippocampal CA1 부위를 cresyl violet 염색 법으로 염색하여 신경세포 손상방어 효과를
관찰한 결과, Control군은 20.5±2.90(density), ACU-1군은 33.0±1.73(density), ACU-2군은 30.8±3.71(density), ACU-3군은 25.1±0.85(density), ACU-4군은 28.5±0.96(density)로, Control군 에 비해 ACU-1군, ACU-3군, ACU-4군들에 서 유의하게 증가된 밀도를 보였다 (P<0.05)(Fig. 6, 7).
0 10 20 30 40 50
Co ntro l ACU-1 ACU-2 ACU-3 ACU-4
Density
*
*
*
Fig. 6. Effect of acupuncture by needle manipulation at the LR1·HT9, KI10·HT3 on the density of cresyl violet-stained neural cell sections in the hippocampal CA1.
Results are shown as mean±S.E.. Control; no therapy group after ischemia-induced. ACU-1;acupuncture therapy group at LR1·HT9, KI10·HT3 after ischemia-induced. ACU-2; acupuncture therapy at right LR1·HT9(forward direction), KI10·HT3(opposite direction) inserting to the direction of route of the each meridian. ACU-3; acupuncture therapy at right LR1·HT9(twirling forward with the thumb of right hand 9 times), KI10·HT3(twirling forward with the forefinger of right hand 6 times) ACU-4;acupuncture therapy at right LR1·HT9(forward direction, twirling forward with the thumb of right hand 9 times), KI10·HT3(opposite direction, twirling forward with the forefinger of right hand 6 times) inserting to the direction of route of the each meridian. *, P<0.05, as compared with the control group
A B
C D
E
Fig. 7 Representive microphotographs of coronal sections in the hippocampal CA1.
A;Control group, B;ACU-1 group, C;ACU-2 group, D;ACU-3 group, E;ACU-4 group. Cresyl violet-stain. ×40.7. Choline acetyltransferase(ChAT)발현
국소 뇌허혈을 유발시킨 흰쥐의 心正格 혈위에 補瀉法에 따라 침자를 시행한 후 hippocampal CA1 부위를 ChAT 발현정도를 관찰한 결과, Control군은 20.3±1.25(density), ACU-1군은 30.8±4.11(density), ACU-2군은 23.8±1.65(density), ACU-3군은 32.8±1.49(density), ACU-4군은 29.3±2.53(density)로, Control군 에 비해 ACU-1군(P<0.05), ACU-3군 (P<0.01), ACU-4군(P<0.05)들에서 유의하게 증가된 밀도를 보였다(Fig. 8, 9).
0 10 20 30 40
Control ACU-1 ACU-2 ACU-3 ACU-4
*
Density
**
*
Fig. 8. Effect of acupuncture by needle manipulation at the LR1·HT9, KI10·HT3 on the density of Choline acetyltransferase (ChAT)-stained sections in the hippocampal CA1.
Results are shown as mean±S.E..Control; no therapy group after ischemia-induced.
ACU-1; acupuncture therapy group at LR1·HT9, KI10·HT3 after ischemia-induced. ACU-2; acupuncture therapy at right LR1·HT9(forward direction), KI10·HT3(opposite direction) inserting to the direction of route of the each meridian. ACU-3; acupuncture therapy at right LR1·HT9(twirling forward with the thumb of right hand 9 times), KI10·HT3(twirling forward with the forefinger of right hand 6 times) ACU-4;acupuncture therapy at right LR1·HT9(forward direction, twirling forward with the thumb of right hand 9 times), KI10·HT3(opposite direction, twirling forward with the forefinger of right hand 6 times) inserting to the direction of route of the each meridian. *, P<0.05,
**, P<0.01, as compared with the control group
A B
C D
E
Fig. 9. Representive microphotographs of coronal
sections in the hippocampal CA1.
A;Control group, B;ACU-1 group, C;ACU-2 group, D;ACU-3 group, E;ACU-4 group. ChAT-stain. ×40.Ⅳ. 考 察
舍岩鍼法은 五兪穴의 작용과 그 원리를 도입한 鍼法으로 五兪穴의 五行配屬에 따라 本經補瀉法과 他經補瀉法의 원리를 결합하 고 “虛則補其母”, “實則瀉其子”, “虛則抑其 官”, “實則補其官”의 원리를 적용한 鍼法으 로『靈樞․經脈』1)의 “盛則瀉之, 虛則補之, 不盛不虛, 以經取之”에 기원하며, “虛則補其 母”, “實則瀉其子”하면서 五行의 相生 및 相 克의 관계에 따라 本經과 他經을 補瀉하는 것은『難經』2)의 六十九難과 七十五難에 근 원을 두고 있다4).
舍岩鍼法 응용함에 있어 臟腑의 虛實을 調節하기 위해서는 穴位 刺戟方法인 補瀉法 의 개념이 중요시 되고 있는데2), 補瀉法이 란 鍼刺施術 중에 정교하고 세밀한 조작 방 법으로 鍼刺法의 중요한 위치를 차지하고 있으며, 일정한 手技法을 운용하여 능히 체 내의 각 기능을 회복시키고 왕성하게 만드 는 방법을 補法이라 하며, 일정한 手技法을 운용하여 능히 病邪를 제거하여 정상적인 생리 상태로 회복시키는 방법을 瀉法이라 한다. 鍼刺로 병을 다스리는 목적은 곧 太過 와 不及의 불균형적인 현상을 調整하는 것 이라고 할 수 있는데, 病機가 있는 臟腑經絡 을 파악하여 虛實을 변별한 후 적당한 補瀉 手法을 운용하여 疏通經絡, 宣導氣血, 調整 虛實하여 “有餘則瀉之, 不足則補之”의 목적 에 도달하는 것이다. 舍岩鍼法을 시술하기
위한 補瀉手技法에는 鍼向, 手技法, 刺入順 序 및 方法 등에 따라 여러 가지 종류가 있 지만 흔히 迎隨補瀉, 捻轉補瀉, 九六補瀉가 임상에서 응용되고 있다4).
中風은 卒然昏倒, 不省人事, 口眼喎斜, 半 身不隨, 言語障碍 등의 증상이 발현되는 疾 患으로 中風의 病理는 虛(氣虛, 陰虛), 火 (肝火, 心火), 豊(肝風, 外風), 痰(風痰, 濕 痰) 氣(氣逆), 血(瘀血) 등 6가지로 구분되 며16), 中風에 대한 다양한 鍼 應用法 중에는 四肢肘膝以下에 있는 井滎輸經合의 다섯 特 定穴인 五輸穴을 應用하여 難經의 “瀉南補 北”과 “虛則補其母 實則瀉其子”설의 기본원 리에 따라 臟腑 虛實을 調整하는 五行鍼法 이 임상에서는 多用된다17,18). 五行鍼法에서 는 그 辨證에 따라 補瀉 穴位를 선정하여 치료를 시행하고 있는데, 虛血性으로 발생되 는 虛證性 中風의 주된 원인으로 腎虛와 함 께 心虛로도 辨證할 수 있는데, 心虛일 경우 心正格의 穴位들이 應用되어진다4,19).
心正格은 大敦 少衝을 補하고, 陰谷 少海 를 瀉한다. 즉 母經의 母穴인 肝經의 大敦과 本經의 母穴인 少衝을 補하고, 克經의 克穴 인 腎經의 陰谷과 本經의 克穴인 心經의 少 海를 瀉한다. 心正格은 心虛證 치료에 활용 되며, 대표적인 치료 병증은 中暑, 火呃, 盜 汗, 夢遊, 鬱腹痛, 血疝, 脈痿, 産後諸病 등이 다. 실제 임상에서 心正格을 활용하는 방면 으로는 心痛, 舌痛, 舌根麻痺, 手掌汗出過多.
七情鬱結로 인한 陽痿, 月經不順 등이며, 특 히 心虛로 인한 精神病과 言語不正에 특별 한 효능을 보이는 것으로 알려져 있다4).
한편 心正格에 사용되는 大敦, 少衝, 陰谷,
少海는 大敦(LR1)은 足 拇趾 爪甲根角에서 足小趾側으로 1分에 위치한 井木 穴位로 調 肝理氣, 鎭痙寧神의 效를 발휘하여 厥陰 風 木의 病症 및 經脈이 所過하는 부위인 陰器, 小腹, 疝氣 疾病을 治療하며, 五行鍼法 활용 에서 肝經의 木穴로 心(火)正格의 補穴[補 其母], 腎(水)勝格의 瀉穴[瀉其子], 脾(土) 正格의 瀉穴[抑其官], 脾(土)勝格의 補穴[補 其官]로 활용된다. 陰谷(KI10)은 膝膕橫紋 內端 부위에서 半腱樣筋腱 後緣에 위치한 合水穴로 益腎興陽, 調理前陰의 效를 발휘하 여 陽痿, 疝痛, 및 婦人月事不調諸疾을 主治 하며, 五行鍼法 활용에서 腎經의 水穴로 肝 (木)正格의 補穴[補其母], 肺(金)勝格의 瀉 穴[瀉其子], 心(火)正格의 瀉穴[抑其官], 心 包(火)正格의 瀉穴[抑其官], 心(火)勝格의 補穴[補其官], 心包(火)勝格의 補穴[補其官]
로 활용된다. 少海(HT3)는 屈肘時 肘窩橫 紋 尺側의 內端에 위치한 合水穴로 益水瀉 火, 淸熱凉血의 效를 발휘하여 手臂麻木, 心 痛, 失眠, 腋下瘰癧, 癲狂 등의 疾病에 活用 되며, 五行鍼法 활용에서 心經의 水穴로 心 (火)正格의 瀉穴[抑其官], 心(火)勝格의 補 穴[補其官]로 활용된다. 少衝(HT9)은 手第5 末節骨의 爪甲根角에서 環指側으로 1分處에 위치한 井木穴로 淸熱熄風, 寧神醒腦의 效를 발휘하여 心悸, 心痛, 悲驚狂癲, 熱病 및 昏 厥 등을 治療하는 작용이 있으며, 五行鍼法 활용에서 心經의 木穴로 心(火)正格의 補穴 [補其母]로 活用된다4,20).
捻轉補瀉法은 鍼을 놓는 기본 동작의 하 나로서 독립된 補瀉法으로 발전된 것은 대 개 金․元 시기로부터 시작되었는데, 金의
竇漢卿은 『標幽賦』에 “迎奪右而瀉凉, 隨濟 左而取暖”라고 하여 鍼體를 捻轉할 때 左 右를 구분하여야 한다고 提示하여 補瀉寒凉 의 다름을 구별하였으며, 『鍼灸指南․氣血 問答』에 “以大指次指相合, 大指往上進, 謂 之左; 大指往下退, 謂之右”라고 하여 鍼을 左右로 돌리는 것은 拇指의 동작 방향이 표 준이 된다고 하였다. 捻轉補瀉法은 男女의 不同, 左右의 不同 등이 있어 복잡한 편이 며, 『舍岩鍼書』에 기록된 것을 약술하면 左轉은 鍼體를 捻轉할 때 大指를 앞으로 힘 있게 前進하고 뒤로 가볍게 당기는 것으로 補法에 해당하고 반드시 大指를 앞으로 前 進하는 것부터 시작하며, 右轉은 鍼體를 捻 轉할 때 食指를 앞으로 힘있게 前進하고 뒤 로 가볍게 후퇴하는 것으로 瀉法에 해당하 고 반드시 食指를 前進하는 것부터 시작하 는 것이라고 하였다3,4).
迎隨補瀉法의 迎은 즉 逆이고 隨는 즉 順 이며, 迎隨라는 이름은 『靈樞․九鍼十二 原』에 “其來不可逢, 其往不可追...往者爲逆, 來者爲順, 明知逆順, 正行無問, 迎而奪之, 惡 得無虛, 追而隨之, 惡得無實”라 하였고, 『靈 樞․終始』에 “瀉者迎之, 補者隨之, 知迎知 隨, 氣可令和”라고 하여 經脈循行 방향을 거 슬러 刺鍼하는 것은 瀉이고, 經脈循行 방향 에 따라서 刺鍼하는 것이 補라고 하였다3,4).
이에 본 연구에서는 心正格인 大敦(LR 1)․少衝(HT9) 補, 陰谷(KI10)․少海 (HT3) 瀉에 대한 補瀉手技法이 腦虛血에
미치는 영향을 究明하고자 하여
intraluminal filament 삽입술에 의하여 유발 된 focal ischemia 흰쥐에게 心正格 穴位에
直刺(ACU-1), 迎隨(ACU-2), 捻轉(ACU-3) 및 迎隨+捻轉(ACU-4) 補瀉手技法을 시술 한 후, hippocampus CA1부위에서 세포고사 기전에 작용하는 인자들 중 Bax, Bcl-2, mGluR5, Cytochrome c와 cresyl violet 신경 세포손상, ChAT 조직상 변화를 관찰하였다.
국소 뇌허혈 모델은 흰쥐에 일시적으로 뇌에 공급되는 혈관들을 차단한 후 재관류 하게 되면 주로 hippocampus부분의 신경세 포가 손상을 입게 되는데, 5-7일이 경과되면 apoptosis와 비슷한 세포 손상을 일으키게
된다21,22). Bax는 세포자멸사를 촉진하는 인
자이고 Bcl-2는 세포자멸사를 억제하는 인 자로서23), Bcl-2의 세포자멸사 억제 효과는 Bax의 영향을 받는다고 알려져 있다24). 본 연구에서 Bax의 발현 및 Bax/Bcl-2 ratio 를 관찰해 본 결과 Control군에 비해 ACU-2군, ACU-4군은 유의하게 증가하였으 나, ACU-3군은 유의하게 감소하였다. 이를 통해 Bax 발현에 유의한 감소를 나타낸 ACU-3군이 뇌세포사멸을 완화하는 작용에 유의성이 있는 것으로 사료되며, 유의하게 증가한 ACU-2군, ACU-4군은 다른 인자들 과의 비교 검토가 필요하다고 생각된다.
Bcl-2의 발현을 관찰한 결과 Control군에 비 해 모든 침자군에서 유의성를 보이지 않았 으나 Bax/Bcl-2 ratio 변화에서는 Bax의 변 화와 같은 결과를 보여 ACU-3군이 세포사 멸인자를 감소시킴을 관찰할 수 있었다(Fig.
1-3).
뇌허혈로 인한 신경세포의 손상에 흥분성 신경전달물질이 허혈기간 동안에 증가하며, 특히 glutamate의 역할은 흥분성 신경독성
발현에 중요한 역할을 하고 있는데25) mGluR5(Metabotropic glutamate receptors) 는 뇌에 있어서 주요한 신경독성 물질이며 허혈이나 저혈당 및 산소결핍 후에 손상을 일으키게 하는 glutamate의 수용체 아형 단 위로, glutamate의 조정반응을 매개한다26). mGluR5는 신경세포 흥분효과와 억제효과 등의 이중성이 연구 보고되고 있는데, 현재 glutamatergic terminal에서의 시냅스 전 억 제작용을 함으로써 신경보호 작용이 있다고 보고되고 있다27). 본 연구에서 hippocampal CA1 부위의 mGluR5 발현 변화를 관찰한 결과 Control군에 비해 모든 침자군들에서 유의하게 증가하였다. 즉 심정격의 자침은 mGluR5의 활성을 통하여 뇌신경독성작용을 완화하는 작용을 발휘하는 것으로 사료되며, 이의 발현은 혈위에 대한 자극 방법보다는 心正格 혈위 자체의 작용이 주요한 것으로 사료된다(Fig. 4).
Cytochrome c는 세포자멸사를 유발하는 인자로 Bax와 Bcl-2와 밀접한 관계를 맺고 있으며 이 등28) 의 실험에서 cytochrome c 의 세포내 미세주입으로 세포자멸사가 매우 빠르게 진행됨이 관찰되어져 세포자멸사를 관찰하는데 주요한 지표가 된다. 본 연구에 서는 Control군에 비해 ACU-3군, ACU-4군 이 유의하게 감소하였다. 이를 통해 보면 迎 隨補瀉法보다 捻轉補瀉 시행이 효과적으로 抗細胞自滅死 작용이 발휘된 것으로 볼 수 있는데, 이러한 결과는 앞의 mGluR5의 발 현 증가와 일관된 결과라고 볼 수 있다(Fig.
5).
Hippocampal CA1 부위의 신경세포 손상
에 대한 방어 효과를 관찰하기 위하여 cresyl violet 염색을 시행한 결과, Control군 에 비해 ACU-1군, ACU-3군, ACU-4군들에 서 유의하게 증가된 밀도를 보였다. 이에 ACU-3군은 앞에서 관찰된 항세포자멸사 작 용과 일치된 결과를 보였으며, ACU-1, ACU-4군은 신경세포 손상에 대한 방어 효 과가 발휘된다고 추정할 수 있었다(Fig.
6-7).
Cholinergic system은 신경전달물질인 acetylcholine(Ach), Ach의 합성효소인 ChAT, Ach을 분해하는 분해효소인 AchE 및 Ach 전달물질의 수용체가 포함된다. 그 중 cholinergic synapse에 존재하는 AchE는 신경전달 물질인 Ach를 choline과 acetic acid로 가수분해 시키는데29),이 효소는 post- sysnaptic membrane의 수용체에 결합하는 Ach를 가수분해시켜 수용체의 정상적인 기 능을 유지시키며, Ach의 생합성에 필요한 choline을 공급함으로써, 신경계가 원활하게 작용하는데 매우 중요한 역할을 하게 된다.
Hippocampus와 신피질로 투사하는 기저전 뇌 콜린계 신경단위의 상실 즉, medial septum, diagonal band, nucleus basalis of Meynert 에 있는 choline계 신경단위의 상실로 인해 투사 부위인 대뇌피질 및 hippocampus 부위 에서 pre-synaptic choline계 지표가 극도로 감소하게 되며30), basal forebrain cholinergic system내의 ChAT활성도 감소는 Ach 감소 를 초래한다31,32).
Hippocampal CA1 부위의 ChAT 발현정 도를 관찰한 결과, Control군에 비해 ACU-1 군, ACU-3군, ACU-4군들에서 유의하게 증
가된 밀도를 보였다(Fig. 8-9). 이는 뇌허혈 에 대한 조절 작용 중 ChAT 발현이 영수보 사의 단독시행 보다는 직자 및 염전보사와 함께 시행 하는 것이 더욱 효과적임을 관찰 할 수 있었으며 이러한 cresyl violet 염색을 통한 신경세포 손상방어 효과와 일치되게 관찰할 수 있었다.
이상에서 본 바와 같이 실험적으로 유발 된 국소 뇌허혈에 대하여 心虛에 활용되는 心正格 穴位인 大敦(LR1)·少衝(HT9) 補, 陰谷(KI10)·少海(HT3) 瀉를 施術함에 있어 서 直刺, 迎隨 및 捻轉補瀉手技法을 시행한 결과 迎隨補瀉法보다는 捻轉補瀉의 시행이 본 연구의 focal ischemia모델의 hippocampus CA1부위 세포손상이 방어됨을 관찰할 수 있었으며, 특히 直刺한 후 捻轉補 瀉 手技法의 시행은 항세포사멸사와 함께 신경세포방어효과가 발휘함을 관찰 할 수 있었다. 또한 迎隨補瀉法, 迎隨․捻轉補瀉法 이 시행된 경우 Bax의 발현, Bax/Bcl-2 ratio 및 mGluR5의 발현을 증가를 보임에도 불구하고 일정한 신경세포 손상방어의 효과 를 보인 점 등에 대하여서는 향후 심도있는 후속 연구가 필요하리라고 사료된다.
Ⅴ. 結 論
心正格 穴位 大敦(LR1)․少衝(HT9) 補, 陰谷(KI10)․少海(HT3) 瀉에 대한 補瀉手 技法이 腦虛血에 미치는 영향을 究明하고자 intraluminal filament 삽입술에 의하여 유발 된 국소 뇌허혈 흰쥐에게 心正格 穴位 상응 부위에 捻轉 및 迎隨 補瀉手技法을 시술한
후, hippocampus 부위의 항뇌세포 고사 및 신경보호 효과를 관찰한 바 다음과 같은 結 論을 얻었다.
1. Bax 발현에서 Control군에 비해 ACU-3 군은 유의하게 감소하였다.
2. Bax/Bcl-2 ratio 변화에서 Control군에 비 해 ACU-3군은 유의하게 감소하였다.
3. mGluR5 발현에서 Control군에 비해 모든 침자군들에서 유의하게 증가하였다.
4. Cytochrome c 발현에서 Control군에 비 해 ACU-3군, ACU-4군이 유의하게 감소 하였다.
5. Cresyl violet 염색법에 의한 신경세포 손 상방어 효과에서 Control군에 비해 ACU-1군, ACU-3군, ACU-4군들에서 유 의하게 증가된 밀도를 보였다.
6. ChAT 발현에서 Control군에 비해 ACU-1 군, ACU-3군, ACU-4군들에서 유의하게 증가된 밀도를 보였다.
이상으로 보아 舍岩鍼法 穴位에 補瀉를 施術함에 있어서 迎隨補瀉를 시행하고 여기 에 捻轉補瀉를 시행하여야 보다 효과적으로 治療作用이 발휘된다고 사료된다.
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