The Carcinogenic Region of Benzo[a]pyrene Metabolites and Its Molecular Complex with Guanine and Adenine

Journal of the Korean Chemical Society 1996, Vol. 40, No. 4

Printed in the Republic of Korea

Benzo[a]pyrene 대사체의 발암활성 영역 및 DNA 염기와의 분자착물의 배향

金鐘汶•孫制銖•都聖鏤，•金碩圭•朴柄珏*

영남대학교 이과대학 화학과 t대구보건전문대학 임상병리과

(1995. 11. 14 접수)

The Carcinogenic Region of Benzo [a]pyrene Metabolites and Its Molecular Complex with Guanine and Adenine

Jong-moon Kim, Gwan-su Son, Seong-tak Doh\

Seog-kyu Kim, and Byung-kak Park*

Department of Chemistry, Yeungnam University, Gyongsan 712-749, Korea

^Department of Clinical Pathology, Taegu Junior Health College (Received November 14, 1995)

요 약. Bmzo[a]pyrene(BP)과 그들의 대사체들의 발암성을 PM3의 방법으로 조사하였다. BP 분자내의 transbutadiene(TB)frame<- 형성하는 4, 5, 5a 그리고 6번 위치가 발암활성영역임을 LUMO 전자밀도로 예측하고Ultimate carcinogen^ BP너riol의 발암활성영역이 10, 10a, 12c 그리고 12b 위치로 변화함을알았다.

TB 영역에 해당하는 Guanine의 HOMO와 BP-triol의 LUMO 사이의 전하이동량이 가장 큼을 알았다.

ABSTRACT. Carcinogenicities of Benzo[a]pyrene(BP) and its metabolites were investigated by PM3.

The 4, 5, 5a, and 6 positions forming transbutadiene(TB) frame in BP have been proved to be carcinogenic region by LUMO. We have found that the carcinogenic region of BP-triol, ultimate cacinogen, is shifted from 4, 5, 5a, and 6 positions of precarcinogen to 10, 10a, 12c, and 12b ones. The appreximate charge transfer quantities turned out to have the largest value between HOMO of Guanine and LUMO of BP-tri이 corresponding to TB region on each other.

서 론

Benzo[a]pyrene(BP)는 강력한 발암물질로 알려 져 있으며, cytochrome P-450 enzyme의 작용에 의해 microsome 위에서 중간체인 7,8-oxide를 거쳐 ZraMS-7,8-dihydro-7,8-dihydroxybezo[a]pyrene-^- 로 활성화된다卩~3 이 dihydro-diol은 다시 cytoch­

rome P-450 enzyme과 complex를 형성한 후 BP의 최종 대사물질인 BenzoEalpyrene Diol Epoxide (BPDE)로산화된다.BP의 최종 발암물질인 BPDE는 4가지의 광학적 입체이성질체를 가질 수 있으며 BP의 Metabolite 단계와 4가지의 광학적 입체이성 질체를 F讶.1 에 나타내었다.

野处-diastereomer의 경우 hydroxy]기들이 axial orientational 반면에 czmz'diastereomer는 equato­

rial conformation-^ 가진다고 알려져 있다:' 각각의 diastereomer는 enantiomer^ 쌍으로 존재하기 때 문에 4가지의 입체이성질체가 존재할 수 있으며 이들 중 특히 aw^-BPDE enantiomers가 월등히 큰 돌 연변이성과 발암성을 가지며,° 또한 이들 두 가지의 aw^'-BPDE enantiomers 중에서도 동물세포에서는 (+)pmz、BPDE가 보다 강력한 발암성과 돌연변이 성이 있음으로 나타났다.J® 현재까지 이들 화합물 들과 생체내 주요성분인 DNA와의 공유결합이 돌 연변이와 발암유발의 기본적이면서도 중요한 현상

230 金鐘汶-孫觀銖•都聖鐸-金碩圭-朴柄珏

(•)■hp，S5hydrodW (t}-t>p-7,8-dihydrodiol

Fig. 1. Absolute stereochemistry of benzo[a] pyrene metabolites responsible for some of the carcinogeni­

city of the parent compound. Major metabolic path­

ways are drawn with heavy arrows.

으로 받아들여지고 있다,& 이들4가지 enantiomers의 DNA base와의 반응성을 조사한 결과 (+)-役汹- BPDE의 경우 Guanine과, (―)p湖"BPDE의 경우 Adenine과의 Adduct 형성이 유리함이 보고되었다?

Brookes 등&은특히 이들BPDE-DNA base Adducts 중 Guanine의 N?와의 Adduct가 발암유발의 가장 기본적이면서도 중요한 요인이라고 보고했다. 1970 년대 이후 발암 메카니즘의 일부로서 실험적 사실을 근거로하여 발암물질은 Cytochrome P-450 또는

amino 산화효소에 의해 산소가 첨가되어 활성화됨을

알게 되었다"”】 그리고 이들의 활성체가 핵산 또는 단백질 등의 생체 고분자와 결합한다는 사실로 이 것이 발암의 제1단계가 된다고 생각되어지고 있다.

따라서 발암제의 대사활성화의 연구는 발암메카니즘 연구의 주를 이루고, 특히 발암제로서 무엇보다도 많이 알려진 PAH류의 화합물에 대한 관심이 집중 되었다. 이중 benzo[a]pyrene의 대사과정에 대한 연구는 특히 많이 진행되어 발암에 있어 대사체인

diolepoxide의 중요성이 1974년 Sims에 의해 처음 으로보고되었다产 1980년 Park 등은 다환성 방향족 탄화수소, hetero ring을 가진 다환화합물 그리고, dimethyl aminoazobenzene 및 그 유도체들의 전자 상태를 구하여.13 분자내에서 K-영역의 양원자와 이 에 인접한 L-영역 원자의 친핵적 프론티어 전자밀 도의 합이 계열을 초월하여 그 임계치가 0.5 이상 이면 발암성을 가진다는 공통성과 통일성을 밝혔으 며, 그리고 생체성분의최고점유궤도함수(HOMO)에 접했을 경우 생체성분으로부터 발암물질쪽으로 이 동하는 Charge Transfer 양을 계산하여 발암물질과 DNA base간의 분자착물 형성에서 가능성 있는 배

치를 결정하였다F 이 후 Park 등은 발암물질의 활성 대사체의 전자상태를 계산한 결과 대사가 진행되어 질수록 trans~12A 영역의 LUM0 전자밀도가 증가 하며, 따라서 발암성 물질은 대사되어 질수록 친전 자성이 된다는 실험적 사실과 일치함을 보고하였고, 또한 이 위치의 이해가 발암메카니즘 해석에 중요할 것이라 하였다.15"

본 연구에서는 BP의 대사 활성화에 따라 생성되는 대사 중간생성물및 최종대사물질의 반응성 영역과 이들의 생체내에서의 target인 DNA 염기중 Gua­

nine^- Adenine과의 반응성 영역을 결정한 후 분 자착물 형성시 이들 사이의 전하이동량을 구하고 그 분자착물의 가능한 배향을 결정하였다.

이론 및 계산

본 연구에서는 Benzo[a]pyrene과 形小 1 의 Meta­

bolite 단계에서 나타나는 대사생성물질 및 최종대 사물질들의 계산을 HyperChem"을 이용하여 PM3 방법으로 80486-computer에서 single point 계산을 수행하였다. 그 중 Geometry Optimization은 MM + 방법을 이용하였고, 계산에 사용된 DNA-base들은 HyperChem내의 Database를 이용하였으며 Phos- phate를 포함한 Nucleotide를 대상으로 하였다.PM3 는 반경험적인 SCF MO 방법으로써 MINDO/3나 MNDO, 그리고 AM1 방법과 동일한 algorithm을 사용하지만 AM1 방법에서 사용하는 parameter를 reparameterization방법으로 AM1 과 함께 가장 정확한 계산방법중의 한 가지이다.1策9

Benzo[a]pyrene 대사체의 발암활성 영역 및 QNA 염기와의 분자착물의 배향 231

본 연구에 필요한 양자역학적인 양은 Frontier 전자밀도로써 친핵반응과 친전자반응에 대한 반응 지수는 각각 다음과 같다.对

玲=2(0伽°)2 (1) 玲=2(C質构)2 ⑵

여기서 (糜 및 C質戚는 최저비점유분자궤도함수 (Lowest Unoccupied Molecular Orbital, LUMO) 및 최 고점유분자궤도함수(Highest Occupied Molecular Orbital, HOMO)에서 z•번째 원자의 eigen vector0]

다. 본 연구에서는 전자밀도가 상대적으로 풍부한 ZraMS-butadiene 영역의 Frontier 전자밀도의 합을 (3)식과 같이 계산하였다.

F싼3尸心心心FW (3)

咒%,4의 물리적인 의미는 생체성분에서 전자를 받 아들일 수 있는 능력의 척도가 된다.

발암의 첫단계가 생체성분(A)와 발암물질(B) 사 이의 분자착물을 형성하는 것이라고 볼 때 분자착 물의 안정성이 발암 Mechanism에 중요한 인자가 될 것이다. 분자착물의 안정성은 생체성분 A와 발 암물질 B 사이의 전하이동량의 크기에 관계되므로 전하이동량을 발암활성의 지수로 볼 수 있을 것이다.

분자 A와 B 사이의 전하이동량은 2차 섭동론"에 의해 결정되며 식 (7)과 같이 나타내어진다.

occ unocc occ unocc

rfQapp = V：2 £ — Z CUYi+dC%+^{•••)乍2}

(EAj—EB^

A B B A

(4)

여기서 0 등은，번째 분자궤도함수에 있어서，번째 원자궤도함수의 계수이고, Ea, ^{등은 발암물질과 생}

체물질을 각각 분자 A, B로 잡았을 때 분자 4의 분자궤도함수의 에너지이다 罗와 '芸'는 각각 점유 궤도함수와 비점유궤도함수의 총합을 나타낸다.Y는 분자 4의 7번째 원자와 분자B의 s번째 원자에 있 어서 궤도함수들 사이에 o-a 형태로 중첩할 때의 공명적분의 크기를 나타낸다(F讶.2.).

거대분자들을 다루고개선된M0법 등에 적용하기 위해서 다음과 같이 근사시킨다.22

i) 분자착물을 이루는 초기의 A 분자와B 분자의 원자들 사이의 거리가 정상결합 거리보다 훨씬 멀

Molecule A

Molecule B

Fig、2. Schematic representation of sigma type over­

lap.

것이므로 그들 사이의 공명적분은 모두 거의 같게 근사시킨다. 즉, Y1P-P1，丫2。=伉，丫非二。3…으로 놓 고。1=02=。3=一= 0로 둔다.

ii) Frontier 이론에 서 분자들 사이 의 반응은 Fron-

<xr HOMO unor LUMO tier 궤도가 주역할을 함으로써 £= £ , £ = £ 으로 근사시킨다.

Fukui의 Frontier 궤도함수 이론的에서 반응에 주 역할을 하는 궤도함수는 HOMO와 LUMO이므로 Frontier 궤도함수만 고려하여 위의 근사를 적용하면 (4)식은 (5)식으로 표현할 수 있다.

HO LU HO LU

} k k )

C%? + C 性*+ •••)，伊

(&(H())—风(1,由) (5)

결과 및 토의

일반적으로 생체성분은 발암성분보다 전자가 풍 부한(electron-rich) 것으로 알려져 있다. 3(a) 에 BP enantiomer들의 LUMO 계수를 표시하였으며, 3(b)에는 DNA 염기중 Adenine과 Guanine의 HOMO 계수를 나타내었다. 또한 이들 BP enantio- mei•들의 공통적인 활성영역과 Guanine 및 Ade- nine의 활성영역을 F讶.4에 나타내었다. HOMO와

LUMO 전자밀도는 분자간에 전자를 주고 받을 수

있는 능력의 척도로 해석되며, 분자내에서 transbu­

tadiene 골격을 이루고 있는 4 B 두 영역이 가장 크다.

/谴.4에서 생체성분이나 BP enantiomer들 모두 A, B 두개의 활성영역이 존재하며 4 B 두 영역은

232 金鐘汶•孫觀銖・都聖鐸•金碩圭•朴柄珏

benzo[a]pyrene

Guanine Adenine

(b) HOMO Coefficienls of Guanine and Adenine

Fig. 3. Active regions of BP enantiomers and DNA bases and individual HOMO, LUMO coefficients, (a) LUMO coefficients of BP enantiomers, (b) HOMO coefficients of guanine and adenine.

(+)•明i-bp-tri아cation (-)-(:«/i-bp-triokcation (a) LUMO Coefficients of BP Enantiomers

모두 加ms-butadiene 골격을 이루고 있음을 볼 수 있다. 이것은 필자들의 발암성 영역이 분자내에 Zraws-butadiene 골격을 이루고 있다는 전보와 일

치 한다.'"°

BP의 대사과정에 따른 12개의 광학이성질체들의 친핵반응에 대한 프론티어 전자밀도(LUMO 전자밀 도)를 식 (3)에 따라 계산하여 Table 1에 총괄하였다.

Table 1에서 보면 Precarcinogen(Benzo[a]py- rene)이 활성화됨에 따라서 A-영역의 F伽값이 줄어 드는 경향을 나타내고 있는 반면 영역의 尸”값은 줄어들다가 최종대사물질(Ultimate Carcinogen)에 가까와짐에 따라서 다시 증가하는 경 향을 볼수 있다.

이 사실은Precarcinogen의 A-영역은Fzg. ]에서처럼 microsome 위에서 대사작용을 하기 위해 cytoch­

rome P-450과 분자착물을 형성하는데 필요한 영역 이라 생각되며,B-영역은 대사과정을모두거친 후의 Ultimate Carcinogen0] 생체성분과 분자착물을 이 루어 발암단계로 돌입하는과정에서의 중요영역이라 생각할 수 있다. 또4가지의 Ultimate Carcinogen중 (―)-sj〃z-bp-triol의 户伽값이 0.8502로써 가장 큰 값 을 나타내고 있으므로 이 이성질체가 생체성분과 분자착물을 이루는 것이 가장 유리할 것이라 생각 된다. 그러나 (+)-«?湖-bp-triol의 발암성이 가장 크다는 실험적 사실&과는 배치된다.

F伽값은 생체성분에서 전자를 받아들일 수 있는 능력의 척도를 판단하는 기준이며 이것은 분자종의 어떤 성질(electron density, dipole moment 등)에서 직접 반응성을 추론하려는 정적방법(static method) 이다. 그러나 반응성을 논의함에 있어서는 오히려 전이상태의 성질에서 추론하는 동적방법(dynamic

Benzo[a]pyrene 대사체의 발암활성 영역 및 DNA 염기와의 분자착물의 배향 ²³³

(b) Active Transbutadiene Frame of Adenine and Guanine Fig. 4. Active regions of BP and DNA bases, (a) Active /ra«5-butadiene frame of benzo[a]pyrene, (b) Active transbutadiene frame of adenine and guanine.

Table 1. Nucleophilic frontier electron density of A, B region and C-10 of BP enantiomers

Enantiomers A-

Region B- Region

c- 10 Benzo[a]pyrene 0.7243 0.5078 0.06292 ( + )-bp-7,8-oxide 0.5932 0.3889 0.04105 (—)-bp-7,8-oxide 0.5905 0.1121 0.04173 (—)-bp-7,8-dihydrodiol 0.5905 0.2000 0.02893 (+ )-bp~7,8 - dihydrodiol 0.5952 0.3888 0.02912 (+)-anf/-bpde 0.6597 0.3514 0.00374 (—)-sy«-bpde 0.6533 0.3578 0.00342 ( + )-s>«-bpde 0.6682 0.3568 0.01005 (一)s必bpde 0.6598 0.0708 0.00374 ( + )-an^-bp-triol 0.3746 0.7862 0.57474 (—)-syn-bp-triol 0.3599 0.8502 0.64752 ( + )-sy«-bp-triol 0.2848 0.8392 0.66245 (—)-flw^-bp-triol 0.3764 0.8298 0.01785

method)이 더 타당하다고 할 수 있다. 따라서 발암 물질과 생체성분과의 분자착물을 전이상태로 보고 그들 사이의 전하이동량으로 전이상태의 안정성을 가늠하는 방법으로 BP enantiomers와 DNA base

(b) Stacking Model of BPDE and Adenine.

Fig. 5. Stacking model of BPDE and DNA bases, (a) Stacking model of BPDE and guanine, (b) Stacking model of BPDE and adenine.

사이의 전하이동량을 구할 수 있다.

BPDE의 B-영역 G(), Goa, Ciob( Ci2c의 /^tzws~buta- diene 활성영역과 Adenine의 B-영역의 N6, C6, C5(

C4에 꼭 겹쳐지는(stacking) 분자착물을 만들고, 또 BPDE의 B-영역과 Guanine의 N2( C2, N3, C4와 꼭 겹 쳐 지는 분자착물을만들 수 있다世该.5), Fig. 5에서 나타나는 착물들의 전하이동량을 구하여 Table 2에 비교하여 나타내었다.

Table 2에서 A, B 두 영역에서의 전하이동량은 4개의 최종대사물질인 BP-triol이 되었을 때 월등 하게 큼을 알 수 있다. 이것은 일반적으로 발암물질이 대사되어 질수록 발암성이 커진다는 사실과 일치한 다. 또 한 가지 알 수 있는 사실은 정적방법에서는 (―)-野牲-bp-triol이 (+)^m刀tz'-bp-tri이보다 발암성 이 컸으나 전하이동으로 볼 때는 ( + )-(m万-bp- triol의 값이 0.08535이고 (一)-，成-bp~triol의 값이 0.05585로써 (+)wmi-bp-triol의 발암성이 크다는 실험적 사실과 일치한다.

또한 Table 2에서 최종 발암물질인 bp-triol을 살펴보면 (+)w海-bp-triol의 경우 Guanine과의 전하이동량은 0.08535이고Adenine과의 전하이동량

234 金鐘汶-孫觀銖•都聖鐸-金碩圭•朴柄珏

Table 2. Charge transfer quanities (unit: p/eV2) to BP enantiomers from guanine and adenine

Region Enantiomers

Guanine Adenine 4

region B- region

A- region

B- region Benzo[a]pyrene 0.00035 0.00054 0.00005 0.00068 (H-)-bp-oxide 0.00060 0.00033 0.00015 0.00034 (—)-bp-oxide 0.00075 0.00033 0.00016 0.00035 (一)-bp~dihydordiol 0.00072 0.00021 0.00015 0.00023 (+ )-bp-dihydrodiol 0.00070 0.00020 0.00014 0.00023 ( + )s海나)pde 0.00053 0.00005 0.00008 0.00003 (—)-s>«-bpde 0.00050 0.00006 0.00007 0.00002 ( + )-sj仇-bpde 0.00053 0.00006 0.00007 0.00002 ( —)S2” 나)pde 0.00053 0.00006 0.00008 0.00003 ( + )-flnZrbp-triol 0.04464 0.08535 0.00854 0.07068 (—)-5jn-bp-triol 0.01359 0.05585 0.00723 0.05892 ( + )-5j«-bp-triol 0.00620 0.03775 0.00471 0.04567 (—)-aw^'-bp-triol 0.01859 0.06443 0.00886 0.06583

은 0.07068로써 Guanine과의 분자착물 형성이 유 리하다고 생각되며, 이와는 반대로 (一)-仞滴-bp- triol의 경우 Guanine과는0.06443이고 Adenine과는 0.06583으로 Adenine과의 분자착물 형성이 유리하 다고 생각할 수 있다. 이 결과는 Meehan 등이 보 고한 사실과도 잘 일치한다.9 두개의 6ZM//-BPDE isomer들 중에서 ( + )sztz'-BPDE가 보다큰Muta- genicity와 Carcinogenicity# 나타냄은 이미 발표되 어져 있으며&7 생체내에서의 이들의 조성도 분석되 어져 있다.源25 Brookes와 Osborne은 이 enantio­

mer^ Guanine과의 분자착물인 N2-dG adduct가 ( + )BPDE의 돌연변이성과 발암성의 원인이라고 제 안했으며,7 본 연구의 결과는 이 제안과도 잘 일치 하고 있음을 알 수 있다.

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