Development of an Official Method for Measurement of Fluazinam Residues for Quarantine of Imported and Exported Horticultural Products

(1)

수출입 원예작물의 검역을 위한

살균제 Fluazinam의 공정 잔류분석법 개발

김경하¹ㆍ안경근¹ㆍ김기쁨¹ㆍ황영선¹ㆍ장문익²ㆍ강인규³ㆍ이영득⁴ㆍ정명근^1*

강원대학교 생약자원개발학과

¹

, 식품의약품안전평가원 잔류물질과

²

, 경북대학교 원예과학과

³

, 대구대학교 생명환경학부

⁴

Development of an Official Method for Measurement of Fluazinam Residues for Quarantine of Imported and Exported Horticultural Products

Gyeong-Ha Kim¹, Kyung-Geun Ahn¹, Gi-Ppeum Kim¹, Young-Sun Hwang¹, Moon-Ik Chang², In-Kyu Kang³, Young Deuk Lee⁴, and Myoung-Gun Choung^1*

1

Department of Herbal Medicine Resource, Kangwon National University, Samcheok 25949, Korea

2

Pesticide and Veterinary Drug Residues Division, National Institute of Food and Drug Safety Evaluation, Ministry of Food and Drug Safety, Osong 28159, Korea

3

Department of Horticultural Science, Kyungpook National University, Daegu 41566, Korea

4

Division of Life and Environmental Science, Daegu University, Gyeongsan 38453, Korea

*Corresponding author, E-mail: [email protected]

Abstract

This experiment was conducted to establish an official determination method to measure fluazinam residue in horticultural crops for import and export using GC-ECD/MS. Fluazinam residue was extracted with acetone from fresh samples of four representative horticultural products, the vegetable crops green pepper and kimchi cabbage, and the fruit crops mandarin and apple. The acetone extract was diluted with saline water and n -hexane partitioning was used to recover fluazinam from the aqueous phase. Florisil column chromatography was additionally employed for final purification of the extract. Fluazinam was separated and quantitated by GC with ECD using a DB-17 capillary column. The horticultural crops were fortified with three different concentrations of fluazinam. Mean recoveries ranged from 82.5% to 99.9% in the four crops. The coefficients of variation were less than 10.0%. The quantitative limit of fluazinam detection was 0.004 mgㆍkg

^-1

in the four crop samples. GC/MS with selected-ion monitoring was also used to confirm the suspected residue. This analytical method was reproducible and sensitive enough to measure the residue of fluazinam in horticultural commodities for import and export.

Additional key words: florisil, fungicide, horticultural crop, pesticide residue Received: August 25, 2015

Revised: October 13, 2015 Accepted: January 25, 2016

Copyrightⓒ 2016 Korean Society for Horticultural Science.

본 연구는 2015년도 식품의약품안전처의 연구개발비 (13162식품안010)로 수행되었으며, 이에 감사 드립 니다.

Korean J. Hortic. Sci. Technol. 34(1):183-194, 2016 http://dx.doi.org/10.12972/kjhst.20160008 pISSN : 1226-8763

eISSN : 2465-8588

(2)

서 언

최근 농약은 현대농업에 있어 품질유지 및 향상을 위한 필수농업자재로써 농산물의 생산성 제고 및 품질향상에 크게 기여하 여 오늘날 풍요로운 먹거리의 공급이 가능하도록 하였을 뿐만 아니라 농산물의 생력화를 통해 노동력과 농업 생산비 절감에 중요한 역할을 함으로써 농업인의 삶 향상에 큰 공헌을 하였다( Jang et al ., 2010 ). 농약은 농산물의 재배를 위한 필수자재이기 때문에 국가에서 사용을 허가하고 있으나, 농약의 오남용을 방지하여 국민건강에 피해를 주지 않도록 각 농약별 사용량, 사용 횟수, 수확기에 따른 살포 횟수 및 시기 등에 관한 농약안전사용기준과 농약의 최대잔류허용기준을 설정하여 사용방법과 사용 량을 엄격히 규제하고 있다( Kim et al ., 2007 ).

Fluazinam [ 3 - chloro - N -( 3 - chloro - 2 , 6 - dinitro - 4 - trifluoromethylphenyl )- 5 - trifluoro - methyl - 2 - pyridinamine ]은 dinitroaniline 계 살균제로써 1990 년에 일본 이시하라 산업에 의해 개발 및 상용화가 시작된 이후, 세계적으로 58 개의 다양한 국가에서 유통 및 판매된 농약이다( Krieger , 2001 ).

Fluazinam 은 진균류의 미토콘드리아 내막에서 ATP synthetase 와 결합하여 ATP 합성을 저해하는 작용을 함으로써 진균류 에 대한 방제효과가 있으며( Guo et al ., 1991 ), 작물체의 생장 중 포자에 의한 감염을 억제하는 데 사용되는 살균제로( Ulrich et al ., 2012 ), 전 세계적으로 감자의 괴경 감염 예방에 효과적으로 작용하여 감자의 역병을 억제하는 데 주로 사용되고 있다( Ulrich et al ., 2012 ).

국내에서는 배, 복숭아, 사과, 감, 감귤, 자두 및 포도 등의 과수류와 고추, 배추, 양파, 인삼 및 감자 등 다양한 원예작물의 재배 시에 발생하는 탄저병, 뿌리혹병, 뿌리마름병, 더뎅이병, 잿빛무늬병, 점무늬병, 갈색무늬병, 역병 등을 방제하는 데 사용되고 있으며, 2015 년 3 월 현재 입제와 분제, 수화제, 액상수화제 등이 시판되고 있다( Korea Crop Protection Association , 2015 ).

Fluazinam 의 물리화학적 특성을 살펴보면( Fig . 1 ), n - octanol / water 분배계수( Log P

ow

)가 4 . 0 인 비극성의 중성화합물로써 녹는점은 119 ° C 이고, 분자량은 465 . 09 ( C

13

H

4

C

l2

F

6

N

4

O

4

)인 노란색 분말 형태의 화합물이다( United States Environmental Protection Agency . 2001 ). 다양한 유기용매에 잘 녹으며( acetone 645g , dichloromethane 485g , ethyl acetate 624g , methanol 162g , n - hexane 6 . 7g ㆍ L

^-1

), 물에 대한 용해도는 극히 낮아 0 . 071mg ㆍ L

^-1

에 불과하다( United States Environmental Protection Agency , 2001 ).

Dinitroaniline 계 살균제인 fluazinam 은 국내 농약잔류허용기준( Maximum Residue Limits ; MRL )이 0 . 05 - 10mg ㆍ kg

^-1

범위 로 설정되어 있다( Ministry of Food and Drug Safety , 2014 ). 현재 국내 식품의약품안전처에서 발간한 식품공전에 수록된 잔류 농약분석법 4 . 1 . 2 . 2 ( Ministry of Food and Drug Safety , 2012 )에 SPE ( Solid phase extraction ) 정제 후 GC - ECD ( Gas chromatography - electron capture detector )로 분석하는 방법이 수재되어 있으나, 다성분 분석 및 SPE 정제로 인해 재현성 및 정제도가 불량하고, 또한 기존에 GC - ECD 나 LC / MS 를 이용하여 분석한 바 있으나( Hu et al ., 1997 ; Kim et al ., 2010 ), 대상농 약을 검출하기 위한 검출기의 최적화가 이루어지지 않았다고 판단되며, 실제 원예작물을 대상으로 fluazinam 의 분석조건 확 립 및 회수율 등이 검토된 결과는 전무한 실정이다.

Fig. 1. Chemical structure of fluazinam.

F

₃

C

O

2

N

Cl

O

₂

N

CF

₃

NH

N

(3)

최근 우리나라는 다양한 국가와 FTA 협상타결로 국경 없는 경쟁 체제에 돌입하였으며, 이와 같은 국제 여건에 능동적으로 대응하고 우리 농산물의 수출 촉진 및 안전성이 확보된 외국 농산물의 수입을 위해서는 잔류농약의 안전성 평가가 핵심적 요 구사항이 되었다.

그러나 각 나라마다 재배환경의 차이로 동일 작물이라 할지라도 발생되는 병해충과 방제에 사용되는 농약의 종류가 상이하 고, 또한 국민의 식습관도 다르기 때문에 잔류허용 기준과 규제 성분에서도 큰 차이가 있으며, 각 나라마다 자국 농업보호와 안 정성 확보를 위하여 수입 농산물에 대한 검역을 강화하고 이를 기술장벽으로 활용, 농산물 수입을 제한하는 수단으로 활용하 고 있으므로 농약사용이 극히 제한될 수 밖에 없고, 아울러 정밀한 공정 잔류농약 분석법의 개발을 통해 수출입 농산물의 안전 성을 확보하여야 할 것이다.

따라서, 본 연구는 현행 국내 식품공전 상에 수록된 광범위 살균제 fluazinam 의 분석법을 개선하여 정확성 및 정밀성이 확보 된 효율적인 분석방법을 개발함으로써 국내 및 수출입 원예작물의 일상적 잔류농약 검사에 활용 가능한 공정 분석법을 확립하 고자 하였다.

재료 및 방법 시험 재료

국내 식품 농약잔류허용기준( Ministry of Food and Drug Safety , 2014 ) 중 fluazinam 의 사용이 등록되어 있는 원예작물 중 에서 Codex Alimentarius Commission ( Codex )의 잔류분석법 대상 대표 농산물군( Codex , 2003 ), 국내 소비량 및 해외수출을 진행하고 있는 원예작물을 고려하여 채소류에서는 ‘청양고추’( Capsicum annuum L . cv . Chungyang , 수확일 : 7 월 30 일)와 결 구배추인 ‘ CR -불암플러스’( Brassica rapa ssp . Pekinesis cv . CR - Bulamplus , 수확일 : 10 월 25 일)를, 과일류에서는 사과 ‘후 지’( Malus domestica Borkh cv . Fuji , 수확일 : 10 월 25 일)와 감귤 ‘흥진조생’( Citrus unshiu Marcow cv . Okitsuwase , 수확일 : 12 월 18 일)을 시료로 선정하였다. ‘청양고추’와 ‘ CR -불암플러스’ 배추는 대구광역시 북구에 소재한 경북대학교 유리온실에서 포트에 종자를 파종하여 관행재배법에 준하여 재배하였고, ‘후지’ 사과도 경북대학교 사과시험포장에서 관행재배법에 따라 재 배한 과실의 사용하였다. 그리고 ‘흥진조생’ 감귤은 제주특별자치도 서귀포시 남원읍에 소재한 감귤연구소 포장 하우스에 재 식된 나무에서 관행재배법에 준하여 재배한 과실을 사용하였으며, 본 시험에 사용된 작물들은 무농약으로 재배하였다. 이들 시 료 분석을 위하여 ‘청양고추’, ‘후지’ 사과 및 ‘흥진조생’ 감귤은 과경을 제외한 과피와 과육 전체를, ‘ CR -불암플러스’ 배추는 뿌 리와 가장 외엽을 제거한 전체를 시료로 사용하였다. 시료 분석은 국내 식품공전 상 검체의 처리방법( Ministry of Food and Drug Safety , 2014 )에 따라 세절 및 전처리하여 사용하였다. 4 종의 원예작물 시료는 잔류농약 검사를 실시하여 무농약 시료임 을 확인하고 대조구로 사용하였다.

시약 및 기구

본 연구에 사용한 fluazinam 은 순도 98 . 5 % 이상의 분석용 표준품을 Sigma - aldrich ( St . Louis , MO , USA )로부터 구입하여

n - hexane 에 녹여 1 , 000mg ㆍ L

^-1

의 농도로 조제하고 - 20 ° C 의 냉동고에서 보관하면서 필요 시 마다 n - hexane 으로 희석하여 사

용하였고, 분석 정량한계( LOQ ), 정량한계의 10 , 50 , 및 100 배에 해당하는 농도로 희석한 후 4 종의 대표시료에 처리하여 분석

시료로 사용하였다. Florisil ( 60 - 100mesh )은 J . T . Baker ( Phillipsburg , NJ , USA )로 부터 구입하여 130 ° C 에서 하룻밤 이상 가

열, 활성화하여 사용하였다. n - Hexane , dichloromethane , acetone 및 ethyl acetate 는 잔류분석용을, deionized water 는 HPLC

용을 J . T . Baker 에서 구입하여 사용하였다. 기타 유기용매 및 무기시약은 시약특급 또는 잔류분석용을 사용하였다. 농축기는

NE - 1000SW ( Eyela Co ., Tokyo , Japan )를 사용하였고, 시료의 마쇄 및 균질화는 고속 균질기인 Ultra - Turrax T - 25 ( IKA Co .,

Wilmington , NC , USA )를 이용하였다.

(4)

GC-ECD/MS 기기분석 조건

Fluazinam 은 분자구조 내에 chlorine 2 개, fluorine 6 개 및 nitro 기 4 개를 함유하고 있어 GC - ECD 혹은 NPD 분석이 모두 가 능하다. 이들 검출기 중 분자구조 내에 함유된 다량의 할로겐 화합물에 의해 고감도 분석이 가능한 ECD 를 fluazinam 의 분석 검출기로 선정하였다. ECD 를 장착한 Agilent ( Wilmington , DE , USA ) 6890 GC 에서 분리용 column 은 내경이 0 . 53mm 인 capillary column 을 사용하여 180 ° C 의 등온조건에서 분석하였다. 재확인을 위한 GC / MS 분석에는 Agilent 7890 / 7000 GC / MSD Triple Quad 를 사용하였으며, 각각의 자세한 분석조건을 표시하였다( Table 1 and 2 ).

표준검량선 및 분석정량한계(Limit of quantitation, LOQ)

Fluazinam 의 stock solution 을 희석하여 0 . 001 - 1 . 0mg ㆍ L

^-1

의 농도가 되도록 농도별 표준용액을 조제하고, 각 1μL 를 GC - ECD 에 주입하여 분석된 peak 의 면적을 기준으로 표준검량선을 작성하였다. 또한, 분석기기의 재현성( reproducibility )을 검증 하기 위해 0 . 50mg ㆍ L

^-1

의 fluazinam 표준용액을 GC - ECD 에 15 번 연속 주입, 크로마토그램 상의 retention time ( Rt .) 및 peak area 의 변이를 비교 평가하였다. 분석법의 정량한계는 무농약 농산물 시료에서 간섭물질이 존재하지 않음을 확인한 후, 분석기 기의 정량한계와 시료량 그리고 분석과정 중의 농축배율을 계산하여 아래의 계산식에 의해 산출하였으며 동일 수준으로 fluazinam 을 처리한 회수율 시험으로 재확인하였다( Ahn et al ., 2015 ).

LOQ ( mg ㆍ kg

^-1

) = [기기 정량한계( ng )/주입량( μL )]×[시료용액( mL )/시료량( g )]

Table 1. GC-ECD operating parameters for the analysis of fluazinam.

Instrument Agilent 6890 GC

Detector

⁶³

Ni - electron capture detector(ECD)

Column DB-17 capillary column (0.53 mm i.d. x 30 m, 0.50 μm film thickness)

Temp. Column oven : 180°C

Detector : 300°C Injector : 190°C

Gas flow rate Carrier : N

²

10 mL·min

^-1

Makeup : N

²

60 mL·min

^-1

Detector purge : N

²

6 mL·min

^-1

Sample size 1 μL, Direct injection

Table 2. GC/MS operating parameters for the confirmation of fluazinam.

Instrument Agilent 7890/7000 GC/MSD Triple Quad

Column HP-5 MS capillary column (0.25 mm i.d. x 30 m, 0.25 μm film thickness)

Temp.

Column oven : programming

Rate 1 : from 210°C (2 min) to 250°C (2 min) at 10°C/min Rate 2 : from 250°C to 300°C (10 min) at 5°C/min

Detector : 250°C Injector : 300°C

Gas flow rate Carrier : He 1.0 mL·min

^-1

Sample size 1 μL, Splitless

Ionization Electron ionization (EI), 70 eV

Mass range (m/z) 50-500

(5)

시료의 추출 및 분배

세절 또는 분쇄한 시료 25g 에 acetone 100mL 를 가하고 균질기상에서 2 분간 고속마쇄( 12 , 000rpm ) 추출하였다. 추출물을 여 과지( Toyo No . 6 , Japan )가 장착된 Büchner funnel 상에서 흡인 여과하고 잔류물의 시료 및 호모게나이저 컵을 여분의 acetone 50mL 로 씻어 앞서의 여과액과 합하였다. 합친 추출액을 1L 용량의 분액여두에 옮기고 포화식염수 50mL 와 증류수 450mL 를 첨가한 뒤 n - hexane 100mL 로 분배 추출하였다. 분배 후 n - hexane 추출액만을 취해 sodium sulfate 15g 에 통과시켜 탈수한 뒤 40 ° C 에서 감압 농축, 건고하였으며, 잔류물은 n - hexane / dichloromethane 혼합용액( 95 / 5 , v / v ) 10mL 에 재용해하였다.

Florisil 흡착 크로마토그래피

내경 1 . 5cm , 길이 40cm 의 유리칼럼에 활성화시킨 florisil 10g 을 건식 충전한 후, 3g 의 무수 sodium sulfate 를 그 위에 첨가하 였다. 칼럼에 n - hexane / dichloromethane 혼합용액( 95 / 5 , v / v ) 50mL 를 가하여 상단에 소량의 n - hexane / dichloromethane 혼 합용액( 95 / 5 , v / v )이 남을 정도로 유출시켜 버린 후 n - hexane / dichloromethane 혼합용액( 95 / 5 , v / v ) 10mL 에 녹인 시료 용액 을 가하여 약 3mL / min 의 유속으로 유출시켰다. 충전제 표면이 노출되기 직전 n - hexane / dichloromethane 혼합용액( 85 / 15 , v / v ) 100mL 를 용출시 켜 버린 후 재차 n - hexane / ethyl acetate 혼합용액( 65 / 35 , v / v ) 150 mL 를 용출시켜 받았다. Fluazinam 이 용출된 분획은 40 ° C 에서 감압 농축, 건고하고 잔류물을 n - hexane 10mL 에 재용해하여 GC - ECD 로 분석하였다.

대표 원예작물에 대한 fluazinam의 회수율 시험

본 연구에서 확립한 살균제 fluazinam 잔류분석법의 효율 및 신뢰성을 검증하기 위해 실제 대표 원예작물의 시료에 대한 회 수율 시험을 수행하였다. 즉, 마쇄한 각 대표 무농약 시료 25g 에 LOQ , LOQ 의 10 , 50 , 및 100 배에 해당하는 fluazinam 표준용 액을 각각 3 반복으로 처리한 다음 상기 분석과정을 수행하여 회수율과 분석오차를 측정하였다.

결과 및 고찰

GC-ECD 분석조건의 확립

GC - ECD 를 이용하여 fluazinam 분석의 최적 column 을 선정하기 위하여 column 의 극성별로 분리양상을 조사하였다.

Phenylsiloxane / methylsiloxane 함량별로 극성을 달리하여 분리능을 조사한 결과, methylsiloxane 함유량이 100 %인 DB - 1 비극성 capillary column 보다 phenylsiloxane 이 50 % 함유된 비교적 극성인 DB - 17 capillary column 에서 fluazinam 의 감도 및 분리능이 우수하였고, DB - 1 칼럼에 비해 머무름 시간이 다소 지연되는 특성이 있으므로 시료로부터 함께 추출되는 비극성 불순물에 의한 간섭이 상대적으로 적을 것으로 판단되어 fluazinam 을 분석하기 위한 최적 칼럼은 DB - 17 으로 선정하였다( Fig . 2 ). Fluazinam 의 머무름 시간은 180 ° C 등온조건에서 약 6 . 2 분이었으며, 분리능과 감도를 증대시키기 위하여 온도구배법을 사 용할 수도 있으나, 이 경우 재현성이 등온조건에 비하여 열등한 단점이 있으므로, 본 분석법의 개발 목적이 시료 주입 후 단시 간 내에 분석 작업이 수행될 수 있는 일상적 공정 잔류분석에 적용 가능한 분석법의 확립이므로 분석결과의 재현성 및 안정성 측면에서 보다 유리한 등온조건을 선정하였다.

분석기기의 정량한계는 크로마토그램에서 peak 로써 나타난 대상 성분의 분석 결과를 신뢰성 있게 수치화할 수 있는 한계농

도로써, 크로마토그램 상에서 검출된 peak 의 S / N ( signal / noise )의 비가 최소 10 이상을 나타내는 성분의 농도를 의미한다( Fong

et al ., 1999 ; Miller , 2005 ). Table 1 의 GC - ECD 조건에서 fluazinam 표준용액을 분석하여 S / N 비를 계산한 결과 기기상의 정량

한계 ( S / N ≥ 10 )는 0 . 01ng 수준이었다. 한편, 기기분석의 안정성 평가를 위해 0 . 5mg ㆍ L

^-1

농도의 표준품을 15 번 반복 주입 분석

하여 피크의 유지시간 및 peak 면적의 변이계수( CV , %)를 조사하여 재현성 평가를 실시한 결과 두 크로마토그래피 척도 모두

(6)

에서 최대 1 . 85 % 미만의 오차를 나타내어 기기 분석 시 안정적이고 재현성 있는 분석을 수행할 수 있음을 확인하였다 ( Table 3 ).

Fluazinam 의 농도별 표준용액( 0 . 001 - 1mg ㆍ L

^-1

) 1μL 를 GC - ECD 에 주입, 분석하여 얻은 검량선의 방정식은 y = 42 , 209 . 3460x + 491 . 0042 ( R

²

= 0 . 999 **)로 우수한 직선 패턴을 나타내었다( Fig . 3 ). 즉, fluazinam 은 기기 정량한계의 1 / 10 수 준인 0 . 001ng 에서부터 그 1 , 000 배인 1ng 까지의 표준검량선에 대한 회귀계수가 R

²

= 0 . 999 ** 이상으로 정량의 직선성이 검정 되었으므로 매우 광범위한 농도 범위의 시료 중 잔류량을 비례적으로 산출하는 것이 가능하였다.

Table 3. Reproducibility of peak area and retention time of fluazinam using GC-ECD.

Parameter Retention time (min) Peak Area (5 Hz)

Maximum 6.278 24619.5

Minimum 6.271 25593.5

Mean 6.274 24712.3

SD 0.00 457.10

CV(%) 0.04 1.85

Fig. 2. GC-ECD chromatograms of fluazinam using typical capillary columns (1 µL of 0.1 mgㆍL^-1

in n-hexane): DB-17 capillary column (A) and DB-1 capillary column (B).

A

B ^DB-1

DB-17

2.5 2.5 0

0 5

5

7.5

10

12.5 12.5 15

15

17.5 17.5 20

20 min

min 0

0 25

25 50

50 100

100 75

75 125

125 150

150 175

175 200

200 5 Hz

5 Hz

Fig. 3. Calibration curve of fluazinam in GC-ECD.

Content (mg·Kg

^-1

)

Peak area

y = 42,209.3460 x + 491.0042 R

²

= 0.999**

45000.0 40000.0 35000.0 30000.0 25000.0 20000.0 15000.0 10000.0 5000.0

0.0 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2

(7)

시료 추출 및 분배과정의 확립

대표적 원예작물 시료로부터 fluazinam 성분을 추출하기 위한 용매로는 acetone 을 사용하였다. Acetone 은 US FDA 법이나 AOAC 법에서 대상 성분과 유사한 물리화학적 특성을 나타내는 농약 잔류분을 추출하는데 보편적으로 사용되는 표준적 용매 로써 이미 많은 연구자들에 의하여 농약 추출에 그 효율과 재현성이 인정된 바 있다( Lee et al ., 2010 ; Lee et al ., 2011 ). 시료 추 출액으로부터 대상 농약 성분과 함께 추출되는 방해물질을 1 차적으로 제거하기 위한 조정제법으로는 액-액 분배법을 사용하 였다. 즉, 수용성 유기용매 추출액을 다량의 포화식염수/증류수로 희석한 후 직접 비극성 용매로 분배 추출하는 방법을 사용하 였는데, 이는 US FDA 법이나 AOAC 법에서 중간-비극성 농약 성분에 대하여 보편적으로 사용되며( AOAC , 2000 ; Lee et al ., 2008 ), 번거로운 추출액의 농축과정을 생략할 수 있는 장점이 있다. 분배용매로 n - hexane , n - hexane / dichloromethane 혼합 액, dichloromethane 등 4 종을 공시, 대상 성분의 분배효율을 조사하였다 ( Table 4 ). 대상 성분의 액-액 분배조건에 따른 분배효 율을 조사한 결과 n - hexane 용액 100mL 로 분획하였을 때 fluazinam 의 회수율은 94 . 6 % 수준이었으며, n - hexane / dichloromethane 혼합액( 80 / 20 , v / v ) 100mL 로 분획하였을 때 회수율은 92 . 9 % 수준, n - hexane / dichloromethane 혼합액 ( 20 / 80 , v / v ) 100mL 로 분획하였을 때는 89 . 0 %, dichloromethane 50mL 로 2 회 반복한 분획은 88 . 6 %를 나타내어 회수율 및 작 업의 편이성 등을 고려할 때 가장 우수한 분배용매Ⅰ의 액-액 분배조건을 fluazinam 의 분배용매로 선정하였다.

Florisil 흡착 크로마토그래피 정제조건의 최적화

대표 원예작물에 함유된 fluazinam 의 분석 시 상기 액-액 분배과정을 통해 상당량의 불순물 및 비극성 간섭물질들이 제거되 었을 것으로 판단되나, 시료에 따라 원 시료로부터 유래되는 다양한 기타 불순물이 존재하므로, 기기분석에 앞서 추가적인 정 제과정이 필요할 것으로 판단되어 흡착크로마토그래피에 의한 정제법을 검토하였다. 흡착크로마토그래피는 잔류농약 분석 시 가장 많이 이용하는 방법이며, 흡착제로는 silica gel , florisil 및 alumina 등이 많이 사용되고 있는데, 이 중 florisil 은 색소와 유지의 제거가 뛰어나 미국의 FDA ( 1999 )나 AOAC ( 2000 ) 등에서 보편적으로 사용하는 방법이다. 본 연구에서도 fluazinam 의 극성을 고려하여 florisil 을 흡착제로 선정 하였으며, 용매의 극성 조절을 위해 n - hexane / dichloromethane 및 n - hexane / ethyl acetate 의 혼합 용매체계를 사용하여 최적화하고자 하였다( Table 5 ).

Florisil 흡착크로마토그래피용 용매의 다양한 극성 조절을 이용하여 fluazinam 의 회수율을 조사한 결과, n - hexane / dichloromethane 혼합액( 85 / 15 , v / v ) 100mL 로 pre - washing 한 후, n - hexane / ethyl acetate 혼합액( 65 / 35 , v / v ) 150mL 로 용출 할 경우 fluazinam 성분의 회수율이 102 . 5 %였으며, ethyl acetate 의 비율을 높여 용출용매의 강도를 높여도 회수율의 개선 정 도가 미미하였다. 따라서 florisil 흡착크로마토그래피법을 이용하여 간섭물질의 제거를 위한 추가적인 정제법은 검토된 용매 체계 중 가장 우수한 회수율 나타낸 상기의 방법을 적용하였다.

Table 4. Efficiency of liquid-liquid partition of crude extract by different solvents for fluazinam.

Compound Recovery ratio (%)

^z

PartitionI

^y

PartitionII PartitionIII PartitionIV

Fluazinam 94.6 92.9 89.0 88.6

z

Mean values of triplicate samples.

y

Partition mixture : 150 mL acetone + 50 mL saturated NaCl + 450 mL distilled water.

I, 100 mL n-hexane, II, 100 mL n-hexane/dichloromethane(80/20, v/v), III, 100 mL n-hexane/dichloromethane (20/80, v/v), IV, 50 mL dichloromethane (× 2 times).

(8)

대표 원예작물에 대한 fluazinam의 분석 정량한계 및 회수율

본 연구에서 확립한 시료 추출 및 정제, 그리고 기기분석 과정을 각 대표적 무농약 원예작물 시료에 적용한 결과는 Fig . 4 와 같다. 무농약 작물의 최종 시료용액에서 대상농약과 동일한 머무름 시간에 간섭물질이 존재하지 않음을 확인하였고, 분석기기 의 정량한계( LOQ )와 시료량, 그리고 분석과정 중의 농축배율을 계산하여 분석법의 정량한계를 산출하였다. 본 연구에서 무농

Table 5. Elution profile of fluazinam on Florisil column.

Elution solvent (v/v) Recovery ratio (%)

^z

0-50 mL 51-100 mL 101-150 mL Total

85 : 15

^y

( n-hexane : CH

2

Cl

²

) 0.0 0.0 0.0 0.0

70 : 30

^x

( n-hexane : CH

3

COOC

²

H

⁵

) 6.1 50.6 39.1 95.9

65 : 35

^x

( n-hexane : CH

3

COOC

²

H

⁵

) 35.3 55.9 11.3 102.5

60 : 40

^x

( n-hexane : CH

3

COOC

²

H

⁵

) 50.1 52.1 0.6 102.8

z

10 g of activated Florisil (60-100 mesh) was dry packed.

y

n-hexane/dichloromethane (v/v).

x

Pre-washed with 100 mL of

²⁾

solvent system, and then eluted n-hexane/ethyl acetate (v/v).

Control

Fortification

A

0 0 0 25 50 75 100 125 150 175 5Hz

0 25 50 75 100 125 150 175 5Hz

2 2 4

4 6

6 8

8 10

10 12

12 14

14 16

16 18

18 min

min

Control

Fortification

B

0 0 0 25 50 75 100 125 150 175 5Hz

0 25 50 75 100 125 150 175 5Hz

2 2 4

4 6

6 8

8 10

10 12

12 14

14 16

16 18

18 min

min

Fig. 4. GC-ECD chromatograms of typical horticultural commodity extracts for the analysis of fluazinam, fortified at ten-fold of

LOQ level: Apple (A), green pepper (B), Kimchi cabbage (C) and mandarin (D).

Control

Fortification

C

0 0 0 25 50 75 100 125 150 175 5Hz

0 25 50 75 100 125 150 175 5Hz

2 2 4

4 6

6 8

8 10

10 12

12 14

14 16

16 18

18 min

min

Control

Fortification

D

0 0 0 25 50 75 100 125 150 175 5Hz

0 25 50 75 100 125 150 175 5Hz

2 2 4

4 6

6 8

8 10

10 12

12 14

14 16

16 18

18 min

min

(9)

약 시료에서 간섭물질이 존재하지 않음을 확인한 후 산출된 fluazinam 의 정량한계는 0 . 004mg ㆍ kg

^-1

이었으며, 국제기준인 Codex ( 2003 ) 및 식품공전 잔류농약분석법 실무 해설서( Lee , 2012 )에서 권장하는 잔류농약분석법 기준인 0 . 05mg ㆍ kg

^-1

이하 또는 허용기준의 1 / 2 이하의 정량한계 기준에 적합하였다. 각각의 무농약 시료에 fluazinam 표준용액을 LOQ , LOQ 의 10 배, 50 배 및 100 배의 농도가 되도록 첨가하고, 상기 확립된 분석방법에 의하여 대표 원예작물에 4 수준 3 반복으로 분석하여 회수 율을 조사한 결과, LOQ 수준에서는 85 . 4 - 99 . 9 %, LOQ 10 배 수준에서는 82 . 5 - 98 . 8 %, LOQ 50 배 수준 및 LOQ 100 배 수준에 서는 각각 87 . 4 - 90 . 5 %, 87 . 0 - 93 . 8 %의 양호한 회수율을 나타내었으며, 재현성도 양호하여 분석오차는 최대 6 . 6 %로 조사되었 다. 따라서, 처리수준 및 시료 종류에 관계없이 잔류분석기준인 회수율 70 - 120 % 범위와 분석오차 10 % 이내를 만족하였다 ( Table 6 ). 이상의 결과에서 볼 때, 본 연구에서 확립된 살균제 fluazinam 의 분석법은 국내ㆍ외 원예작물의 잔류농약 분석 및 검 사에 충분히 적용 가능함을 확인하였다.

GC/MS를 이용한 잔류분의 재확인

개발된 분석법의 신뢰성을 확보하기 위해 GC / MS 에 의한 재확인 과정을 추가하였다. Table 2 의 GC - MS 분석조건에서 표

Table 6. Recovery ratio of fluazinam in different crop samples.

Crop Fortification (mg·kg

^-1

) Recovery ratio (%)

^z

CV (%) LOQ (mg·kg

^-1

)

‘Fuji’

Apple

0.004 99.9 ± 5.7 5.7

0.004 0.04 98.8 ± 4.0 4.1

0.2 87.4 ± 1.7 1.9

0.4 93.8 ± 1.4 1.4

‘Chungyang’

Green pepper

0.004 85.4 ± 3.3 3.9

0.004 0.04 82.5 ± 1.1 1.4

0.2 88.3 ± 1.6 1.8

0.4 87.0 ± 2.6 3.0

‘CR-Bulamplus’

Kimchi cabbage

0.004 94.1 ± 6.2 6.6

0.004 0.04 94.3 ± 4.7 5.0

0.2 88.0 ± 0.8 0.9

0.4 93.0 ± 1.0 1.1

‘Okitsuwase’

Mandarin

0.004 96.0 ± 1.6 1.6

0.004 0.04 88.0 ± 2.5 2.9

0.2 90.5 ± 3.3 3.7

0.4 91.7 ± 3.1 3.4

z

Mean values of triplicate samples with standard deviations.

Fig. 5. Total-ion chromatogram (TIC) of fluazinam in GC/MS.

Fluazinam +El TIC Scan Fluazinam SCAN. D

0 5.5 6 6.5 7 7.5 8 8.5 9 9.5 10 10.5 11 11.5 12 12.5 13 13.5 14 14.5 15 15.5 16 16.5 17 17.5 18 18.5 19 19.5 20 20.5 21 21.5 0.2

Counts vs. Acquisition Time (min) 0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

1.6

1.8

2

2.2

2.4

2.6 x10

⁷

(10)

준용액을 분석하여 TIC ( total - ion chromatogram ) 및 MS spectrum 을 얻었으며, m / z 206 . 9 와 386 . 8 을 selected - ion monitoring ( SIM )용 ion 으로 설정하였다( Fig . 5 and 6 ). Fig . 7 은 본 실험에 사용된 대표적 원예작물 시료 중 고추를 대상으로 살 균제 fluazinam 의 잔류분을 재확인한 selected - ion monitoring ( SIM ) chromatogram 이며, 본 실험에서 사용된 모든 무농약 시 료에서는 대상 농약성분의 peak 가 전혀 관찰되지 않았고, 인위 첨가된 시료에서는 동일한 머무름 시간대에 정확하게 fluazinam

Fig. 6. EI mass spectrum of fluazinam.

+El Scan F(7.254 min) Fluazinam STD SCAN D

57.0

71.0

99.0

113.1 194.4 206.9

386.8 C

13

H

4

Cl

2

F

6

N

4

O

4

= 463.95 F

3

C

N NH

Cl O

2

N O

2

N

CF

3

Cl

221.1 280.7

266.6 300.8 324.8

416.9 371.0 146.9

0.3 Counts (%) vs. Mass-to-Charge (m/z) 1.1

1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 - 0.1 x10

⁷

20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480 500 520 540

Control

- 0.1 x10 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 1.6 1.7 1.8 0 1

²

0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0.4 0.45 0.5 0.55 0.6 0.65 0.7 0.75 0.8 0.85 0.9 0.95 x10

¹

Counis A

Fig. 7. SIM chromatogram of green pepper extract for the confirmation of fluazinam, fortified at ten-fold of LOQ level: SIM

chromatogram of Control (A) and fortification (B).

0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0.4 0.45 0.5 0.55 0.6 0.65 0.7 0.75 0.8 0.85 0.9 0.95 x10

¹

- 0.05 0.05 0.1 0.0 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0.4 0.45 0.5 0.55 0.6 0.65 0.7 0.75 0.8 0.85 0.9 0.95 x10 1

⁵

Fortification Counis B

1 5.5 6 6.5 7 7.5 8 8.5 9 9.5 10 10.5 11 11.5 12 12.5 13 13.5 14 14.5 15 15.5 16 16.5 17 17.5 18 18.5 19 19.5 Acquisition Time (min) 5.5 6 6.5 7 7.5 8 8.5 9 9.5 10 10.5 11 11.5 12 12.5 13 13.5 14 14.5 15 15.5 16 16.5 17 17.5 18 18.5 19 19.5

Acquisition Time (min)

(11)

의 잔류분만을 확인할 수 있었다. 따라서 본 연구에서 사용한 GC / MS 의 SIM 조건을 이용할 경우에도 GC - ECD 를 이용한 정 량법과 더불어 살균제 fluazinam 잔류분의 추가적 정성분석법으로 사용할 수 있을 것으로 판단된다.

초 록

본 연구는 국내 및 수출입 원예작물의 일상적 잔류농약 검사에 활용 가능한 dinitroaniline 계 광범위 살균제 fluazinam 의 GC - ECD / MS 잔류 분석법을 확립하고자 하였다. 원예작물 중 채소류에서는 청양고추와 결구배추를, 과일류에서는 감귤과 사 과를 대표 시료로 선정하였고, 아세톤으로 추출된 fluazinam 은 식염수로 희석하고, 수용액층을 n - hexane 액-액 분배법으로 회수하였으며, 회수된 추출액으로부터 fluazinam 의 최종적 정제를 위하여 florisil 칼럼 크로마토그래피법으로 추가 정제하여 GC - ECD / MS 분석용 시료로 사용하였다. Fluazinam 의 정량적 분석을 위하여 DB - 17 capillary column 을 적용한 GC - ECD 분석 조건을 확립하였으며, 각 작물별 4 수준의 농도로 fluazinam 을 인위 첨가하여 회수율을 분석하였다. 각 대표 원예작물에 대해 정량한계, 정량한계의 10 , 50 , 및 100 배 수준에서 회수율을 검토한 결과 모든 처리농도에서 82 . 5 - 99 . 9 % 수준을 나타내었 으며, 정량한계( LOQ )는 0 . 004mg ㆍ kg

^-1

이었다. 반복 간 변이계수( CV )는 최대 6 . 6 %를 나타내어 국제적 잔류분석 기준인 회수 율 70 - 120 % 및 분석오차 10 % 이내를 충족시키는 만족한 결과를 도출하였다. 또한 GC / MS SIM 을 이용하여 실제 각 작물 시 료에 적용하여 재확인 하였다. 이상의 결과로 신규 fluazinam 의 GC - ECD / MS 분석법은 검출한계, 회수율 및 분석오차 면에서 국제적 분석기준을 만족하는 신뢰성이 확보된 정량 분석법으로서 국내 및 수출입 검역을 위한 원예작물의 공정 잔류분석법으 로 사용 가능할 것이다.

추가 주요어 :

florisil , 살균제, 원예작물, 잔류농약

Literature Cited

Ahn, K.G., G.H. Kim, G.P. Kim, Y.S. Hwang, S.B. Hong, Y.D. Lee, and M.G. Choung. 2015. Determination of quintozene residues in agricultural commodities using GC-ECD/MS. Korean J. Pestic. Sci. 19:195-203.

AOAC. 2000. Pesticide and industrial chemical residues, In official method of analysis. 17th ed. Arlington, VA, USA. p. 88.

Codex Alimentarius Commission. 2003. Guidelines on good laboratory practice in residue analysis. CAC/GL 40-1993. Rev.1-2003.

Rome. Italy.

Fong, W.G., H.A. Moye, J.N. Seiber, and J.P. Toth. 1999. Pesticide residues in food: methods, techniques, and regulations. John Wiley and Sons, NY, USA.

Guo, Z., H. Miyoshi, T. Komyoji, T. Haga, and T. Fujita. 1991. Uncoupling activity of a newly developed fungicide, fluazinam[3-chloro- N-(3-chloro-2,6-dinitro-4-trifluoromethylphenyl)-5-trifluoromethyl-2-pyridinamine]. Biochim. Biophys. Acta, Bioenerg. 1056:89- 92.

Hu, W, S.J. Lee, and J.E. Kim. 1997. Adsorption-desorption, leaching, and degradation pattern of fungicide fluazinam in the soil environment. J. Korean Soc. Agric. Chem. Biotechnol. 40:128-133.

Jang, M.R., H.K. Moon, T.R. Kim, D.H. Yuk, J.H. Kim, and S.G. Park. 2010. Dietary risk assessment for pesticide residues of vegetable Seoul Korea. Korean J. Nutr. 43:404-412.

Kim, M.O., H.S. Hwang, M.S. Lim, J.E. Hong, S.S. Kim, J.A. Do, D.M. Choi, and D.H. Cho. 2010. Monitoring of residual pesticides in agricultural products by LC/MS/MS. Korean J. Food Sci. Technol. 42:664-675.

Kim, H.Y., S.H. Yoon, H.J. Park, H.J. Lee, I.S. Gwak, H.S. Moon, M.H Song, Y.M. Jang, M.S. Lee, J.S. Park, and K.H. Lee. 2007.

Monitoring of residual pesticides in commercial agricultural products in Korea. Korean J. Food Sci. Technol. 39:237-245.

Korea Crop Protection Association. 2015. Using guideline of crop protection agents. Korea. p. 378.

Lee, J.H., H.W. Park, Y.S. Keum, C.H. Kwon, Y.D. Lee, and J.H. Kim. 2008. Dissipation pattern of boscalid in cucumber under greenhouse condition. Korean J. Pestic. Sci. 12:67-73.

Lee, S.J., Y.H. Kim, L.S. Song, and M.G. Choung. 2011. Determination of ametryn residue in agricultural commodities using HPLC- UVD/MS. Korean J. Pestic. Sci. 15:125-133.

Lee, S.J., Y.S. Hwang, Y.H. Kim, M.Y. Nam, S.B. Hong, W.K. Yun, C.H. Kwon, J.A. Do, M.H. Im, Y.D. Lee, and M.G. Choung. 2010.

Determination of fomesafen residue in agricultural commodities using HPLC-UVD/MS. Korean J. Pestic. Sci. 14:95-103.

Lee, Y.D. 2012. Pesticide Analytical Residues Manual in Food Code. MFDS.

(12)