약학희지 제42권 제 1 호 39~45(1998)
Yakhak Hoeji Vol. 42. No. 1
엘라닌생성억제제인 코 직산 모노스테아레이트의 가수분해오F 퍼부투과특성 및 in vivo 미백효과
하용호 ■ 유성운 • 김동섬* ■ 임세진** • 최영욱*
중앙대학교 약학대학. •식품의약품안전본부득성연구소 , •* 동덕여자대학교 약학대학 (Received November 6, 1997)
H y d r o l y s i s , S k i n P e r m e a t i o n a n d I n V i v o W h i t e n i n g E f f e c t o f K o j i c A c i d M o n o s t e a r a t e a s a n A n t i m e l a n o g e n i c A g e n t
Y o n g H o H a , S u n g U n Y u , D o n g S u p K im * , S e J i n L im * * a n d Y o u n g W o o k College o f Pharmacy, Chung-Ang University, Seoul 156-756, Korea
^Toxicology Center, Korea Food & D rug A dm inistration, Seoul 122-020, Korea
**College o f Pharmacy, Dongduck Women's University, Seoul 136-714, Korea
C h o i*
Abstract~Kojic acid, antimelanogenic agent, has been widely used in cosmetics to lighten the skin color. However, it has skin irritancy and instability against pH. temperature and light. To overcome these problems and optimize the molecular structure of kojic acid (KA). a prodrug, kojic acid monos
tearate (KMS). has b ^ n synthesized to modify the topical drug delivery in the point of sustained release of the parent drug via enzymatic hydrolysis during skin absorption. The prodrug was tested for enzymatic hydrolysis with cytosolic fraction of hairless mouse skin. From the in vitro skin per- meation study through hairless mouse skin, we found that KMS was retained in the skin and gen
erated KA continuously by the skin esterase cleavage. In addition, topical formulations of o/w type creams and polyolprepolymer-containing cream were further tested for whitening effects using in vivo yellow skin guinea pig model.
Keywords □ Kojic acid. Kojic acid monostearate, Prodmg, Hydrolysis. Skin permeation. Whitening ef
fect, Antimelanogenic agent. Polyolprepolymer.
코직산(kojic acid)은 1907년일본의 K. Saito에의 헤처옴으로보고되었으며,** 당류에 미생물외호기적 과정을통해서만둘어진 pyrone으로알칼러수용액과 고온에서는 산화에 의해 개열하여 formic acid, ox
alic acid, glycolic acid 등을생성한다. 코직산의작용 기전은 델라닌 생성경로에서 중요한 tyrosinase외 와 chelate를형성함으로서델라닌생합성경로를 차단하나거나 dopachrome tautomerase와 DHICA- oxidase에간섭하여델라닌중합체의형성을억제한다 고알려져있다.^'® 그러나코직산은공기중에서매우불
* 본 논문에 관한 문의는 이 저자에 게로 ( 전화) 02-820-5609 ( 팩스) 02-816-7338
안정하고산성에기인한피부자국의 단점을가지고 있 어이러한단점을극복하기위해코직산외여러가지지 방산유도체에 대한연구들이 진행되었다/^* 본실험 에서는포화지방산인 stearic add를코직산의 2번탄 소에위처한 1급알코올성 히드록시기에 ester ■결합을 시켜코직산모노스테아레이트를합성함으로써코직산 외단점인불안정성과피부자국을극복할수있는경퍼 적국소약물전달시스템으로서외 프로드럭을개발하고 자하였다. 따라서합성된프로드럭을기기분석을이용 하여 확인하였으며, 실험동물을 이용하여 피부균질액 으로부터 얻은 효소용액에서의 가수분해 및피부확산 특성을파악하였다. 별도로코직산및코직산모노스테 아레이트를 함유하는 시험제제를제조하여 기니픽 모
40 하용호■유성운■김동섭■임세진■최영욱
델에서외 미백효과를 평가하였으며, 이상의 실험으로 부터다소의지견을얻었기에보고하고자한다.
실 험 방 법
시 약 및 기 기
약물로서 kojic acid(KA로 약함)는 일본 Tokyo Kasei Kogyo사■로부터구입하였고, 합성원료로 stear- ic acid는머국 Aldrich사로부터구입하여사용하였고, 그외외시약은분석용특급시약을사용하였다.
합성한 kojic acid monostearate(KMS로약함)는미 국 Perkin-Elmer사의 1H- NMR Spectrometer(684) 와득일 Bruker사의 FT-IR Spectrometer(PLX400) 를사용하여 확인하였고, 효소가수분해 실험에쓰이는 skin외 cytosolic fraction을얻기위해미국 Sonics &
Materials사외 sonicator(Vibra Cell)와이태러 Kon- tron instruments사외 ultracentrifUge(Centrikon T-1170)를 사용하였다. HPLC는 미국 TSP사의 de- gasser(SCMlOOO), pump(P4000), autosampler (AS1000), detector (UVIOOO), integrator (PC 1000) 및 column oven (TC-50, Eppendorf, Germany)을 부착시켜 용하였다.
프 로 드 럭 의 합성
KA(2-hydroxymethyl-5-hydroxy-4-pyrone)-c 4-pyrone을모핵으로하며 2번탄소에 1차알코을인 hydroxymethyl기와 5번탄소에엔올인히드록시기등 모두2개외 히드록시기를갖는다. 이둘을모두아실화 하여 diester틀얻고자하는경우, KA를염화아실과피 리딘존재하에반응시키면된다. 그러나 KA내의 2개외 히드록시기중어느하나만을아실화시킬 때는위처선 텍적(regioselective)인 합성법이 요구된다. KMS의 합성은 500 m l등근바닥플라스크에 stearic acid 129.
54g(454mM)과 ZnCW무수물) 28.35 g(208 mM)을 넣고 16(TC에서균일하게될때까지약1시간동안교 반하였다. 계속하여 KA 27.74g(174mM)을가하여, 160°C에서 4시간교반하고, 다시 130°C로온도를낮추 면서 1시간교반하였다. 반응혼합물을초산에칠에녹 인후분별깔대기에서물과 brine으로진탕하여세척하 고. 황산마그네슘(무수물)으로건조한후여과하여그 여액을 감압 농죽하였다. 잔류물을 toluene-ethy-
lacetate를사용하여 실리카겔 컬럼크로마토그래피를
실시하고. 용매를제거한후건조시켜미색외결정을얻 었다. C24H38O5； m . p . 9 0 . 8 ° C： T L C ( E t h y l a c e t a t e ：
H e x a n e = l：l ) R f = 0 . 3 3；'H - N M R C D M S O - r f g ) 5：
0 . 8 4 ( t , 7 = 6.8H z , 3 H ) , 1 . 2 2 ( m , 2 8 H ) . 1 . 5 1 ( t ,
J =
7 . 4 , 2 H ) , 2 . 3 7 ( t , 7 = 7 . 4 , 2 H ) , 4 . 9 3 ( s . 2 H ) , 6 . 4 3 ( s ,
I H ) , 8 , 0 5 ( s , I H ) , 9 . 2 0 ( s , I H) ；I R ( I « r , c m ' ) 3 2 5 0 , 1 7 2 5 , 1 6 5 0 , 1 6 2 0 .
효 소 용 액 의 제 조
실험에서사용한 hairless mouse의피부는 3~4개 월생육시킨 Charles River 수컷생쥐로서피부에상 처나긁힌흔적이없는것으로선택하였으며 경추탈골 에의해고통없이죽인다옴복부를절개하여전체피 부틀벗겨내고여기에붙어있는지방등은 3TC로가온 한식염수용액에 담가조심스럽게 제거하고냉동보관 하였으며 필요시마다 헤동시켜 사용하였다；"-® 먼저 KH2PO4와 Na2HPC>4를 함유한 pH 7.4의 phos
phate buffered saline(이하 PBS) 용액을제조하였 고, 작은 절편으로만든피부에 413의 PBS를가하여 skin/PBS(w/w)의 비율이 0.3이 되게 한 후 son- icator로층분히분해시켰다. 이와같은방법으로얻은 피부균질액을1차로 250xg에서 10분간원심분리하여 등모및균질화되지않은세포등을제거하였다. 1차원 심분리후외상징액을취하여 2차로 4°C, 100,000Xg 에서 30분간원심분리하여 상징액을취하고 냉동보관 하였으며 필요시마다헤동시켜사용하였다. 모든 효소 용액은 4~7마러의 hairless mouse외피부를흔합하 여제조하였다.
해
위에서제조한효소용액에 KMS를용해시킨디메털 포룸아미드(DMF)용액 10%를가하여 KMS의최종농 도가 0.2 mM이되게 하였다. 혼합용액을 각각 20°C,
3TC. 50°C 온도의진탕수욕에서교반하면서 0.5. 1, 1.
5, 2, 3, 4, 6. 8, 10시간마다시료를채취하여동량외에 란올을 가하여 제단백하고원심분리하여 그상징액을 0.45 nm PTFE 멤브레인필터로여과하여그여액중의 KA를 HPLC로정량하였다. 이때 KA의 HPLC 분석은 Shiseido의 Ci8 Capcell Pak(4.6 x 250mm, 5tim)을 사용하여 검출파장 268nm에서측정하였고, 이동상은 3% acetonitrile과 97% PBS(pH 3.0)로하고유속은
1.0 m//min, 주입량은20 ^a로하였다.
Pharm. Soc. Korea
코 직산 모노스 테아 레이트외 가수분해와 퍼부투과특성 및 미백효과 41
씨부투과
실험에서사용한 hairless mouse skin은효소용액 외 제조시와 동일한 방법으로 처러하여 얻은 피부를 4시간동안 PBS에담근다움사용하였으며, 괴부투과 실험장처는 Valia-Chien skin permeation cell을제 작하여 사용하였다/"'*** Donor측 시료는 KA의경우 증류수, KMS의경우는물에난용성인점을감안하여 mineral oil과 테트라허드로퓨란(THF) 흔액_(4：1 v/
v) 을사용하였으며, receptor즉은 효소의불활성화를 고려하여가수분해시와동일한용액인 PBS와 DMF흔 액(9：1 v/v)을사용하였으며, 별도로 KA와투과성비 교시험에는 KMS외용해도를고려하여 이소프로펄알 코올(IPA) 80 m?와 THF 20 m/를 혼합한 용액에 span 20을 0.5 m/를 가한 혼합용액을 사용하였다. 37±rc 수욕상에서 spin bar를회전시키면서 6, 12, 24, 48, 72, 96시간마다 receptor쪽에서 micropipet을
이용하여 0.5 씩정확히채취하여 검액으로하였으
며매회채취후 receptor측에동일량의흔합용액을보 중하여주었다. 이때 donor즉과 receptor즉외용량은 각각 12 m/썩이었으며, 확산에유효한피부면적은약 2.54c»H었다. 모든검액은 0.45 nm PTFE 멤브레인 필터로여과하고그여액중외 KA 및 KMS외농도를 HPLC로정량하였다. 이때 KA의분석조건은가수분 해실험과동일하였으며, KMS의분석은 Ci8 Capcell Pak 칼럼을 사용하여 이동상은 95% acetonitrile과 5% PBS(pH 3.0)의흔액, 유속은 1.0m//min, 주업 량은 20IX；로하여검출파장 268 nm에서측정하였다.
시험제제의제조
미백실험에 사용할 외용제제는 KA는 수용성이고 KMS는지용성임을감안하여 2가지물질을공통적으 로제형화할수있는크림제를시험제제로제조하였다. 유상으로는광유, 스테아린산, 세토스테■아릴알코올등 을사용하고수상으로는증류수, 글러세린, 프로펄린글 리콜등을사용하였으며 , 일반적인유제외제법에따라
75°C의수욕에서유상과수상을각각외비커에용해시
킨후유상을수상에가하고 1000 rpm에서 5분간교반 한다음실온까지서서히냉각하여 0/W형외크림을만 들었다. 이때 KA는수상에녹여가하였고 KMS는유 상에녹여가하였으며 , 약물의함량은각각 0.1 w/w%
로하였다. 별도로피부각질 및상피층에 대한약물의 효과를 높이기 위해 고분자 첨가제로서 Polyolpre-
polymer(PP-15로약함)를 6 w/w% 함유시킨 KMS cream(PP)을같은방법으로제조하였으며 , 약물을함 유하지않은크럼제를대조용으로 용하였다.
미백효과
한 시료당 7마리의 기니픽의 등부위틀 제모한 후 FS20S E-30 램프률이용하여 UV-A(장파)와 UV-B (단파)를광조사면적 2x2 cml 광조사시간 10분동안 2 J/cm"로 3일동안 1일 1회썩조사하여 기니픽의등을 검게만들었다.*® 4일째부터각시험제제를매일 2회씩 도포하여 3주간외 피부색 변화률 비색계로 측정하여 lightness(L값)를식 (1)에의하여구하였으며. 미백효 과는 lightness change(AL)롤 식 (2)에 의해 구하여 평가하였다.
Lvalue=l(W7 (Y ：명도) (1)
AL= 도포후 t일후외 L값-도포개시의 L값 (2)
결과 및 고찰
수분해
KMS는프로드럭이기 때문에피부에 흡수될 때피 부내에 존재하는 효소에 의해 가수분해되어야 하며, 이프로드럭이 KA외에스테르화합물이란 점에서피 부 에스터라제에 의해 가수분해되면서 KA롤지속적 으로유리시키고. 생성된 KA가괴부내 델라닌세포에 작용하여 델라닌 생성을 억제시킴으로서 미백효과틀 가져올것으로기대할수있다. 따라서피부에스터라 제를함유하는세포질분획을제조하였고, 이효소용액 에 KMS를녹이고 경시적가수분해에 따른 KA의생 성량의 번화틀관찰하였다. 그러나 KMS는매우난용 성이어서 효소용액에 그대로 녹일 수없었으며, 효소 의활성에 영향을주지 않는범위 내에서혼합용매로 서 DMF를 10% 가하였다. 실제로 Fort와 Mitra"•는 난용성 약물의 가수분해실험을 위해 효소용액으로
DMF를 20% 함유하는용액을사용하였고이때에스
터라제활성이유지되었다고보고하였다. 특히효소분 자외 구조적 변화는효소의 활성에 직'접적인 영향을 미처는데, 낮은온도에서는이러한구조적 번화가가 역적이지만 50T：이상에서는 버가역적이다. 효소의 3차원적 구조를 형성하는 결합은 상대적으로 약해서 쉽게 파괴되어지며높은온도나 pH의번화에 따라서
Obtained by first-order plot. '
액중에서완전히용해되지않은상태로분산되었기때 문에 KMS외경시적농도저하를직접관찰할수는없 었다.
퍼 부 투 과
Keratinocyte와 함께 표피를 구성하는 melano
cyte 는표피기저층에 전체적으로고르게분포되어있
는것으로알려져 있으며/ KMS는피부효소에의해
가수분해됨이이미확인되었고또 KA의스테아린산에 스테르이기 때문에지용성이중가되어 피부에쉽게확 산될수있을것으로 예측된다. 따라서괴부에 적용할 때각질층을통과하여 살아있는표피 (viable epider- mis)에까지확산되어에스터라제에의해가수분해를받 을수있는지률평가하기위해경피확산실험장처틀이
용하여 KMS의 피부투과특성을 관찰하였다. Re-
1 0 2 0 3 0 4 0 5 0
Time (hr)
Fig. 2 — In vitro skin permeation of KMS ： Cumulative amount-time plot of KMS and KA in receptor medium of PBS/DMF (9；1 v/v). ▼ ； KA. • : KMS.
Pharm. Soc. Korea
1.51x10'' 4.60
4.13x10'' 1.68
6.12x10■오 11.3
Table I — Hydrolysis rate constants(K) and halHifedi/a) _________ of KMS____________________________________ _
Temp. K (hr기* ti/2 (hr)
0 2 4 6 a 10
Time (hr)
Fig. 1 — Concentration change profile of KA as a func
tion of time by enzymatic hydrolysis of KMS at different temperatures. 2(fC, O: 37T3, 5(rc.
이로인한효소의변성이일어난다.*®
가수분헤설험에서 초기 4시간까지는빠른 KA의생 성을보이다가, 이후 10시간까지지속적으로 KA률유 리시킴을알수었었다(Fig. 1). 벌도로효소틀함유하
지않은 blank 용액에서가수분해를비교실험한결과
KA외생성이관찰되지않았으며 , 따라서 KMS가피부 에스터라제에 외해가수분해되는것을확인할수었었 다. 이때가수분해는온도의존성을보였는데 37°C에서 는실온에서의가수분해속도에비해약 3배이상빠르게 관찰되었고, 50°C에서는오히려효소활성이급격히저 하되어실온에서보다 2배이상가수분해가지연됨을알 수었었다. 전체적으로 10시간까지의 데이터를세미로 그폴롯하였을때직선이성립되었으며, 따라서 1차속 도식에 따라가수분해속도상수률 구하여 비교하였다. 즉 3TC에서최고의에스터라제활성을나타내었으며, 이때외 가수분해 속도상수는 0.4132 hr"*이었고, 가수 분해반감기는 1.68 시간으로계산되었다(Table I). 따 라서프로드럭인 KMS는피부에흡수되면에스터라제 에 외해 비교적 빠르게 가수분해되면서 지속적으로 KA를 생성시킬 수 있을 것으로 판단되었다. 한편 50T：이상에서는초기에빠른에스터라제활성을보이 다가시간이지남에따라급격히소실되었는데이는위 에서설명한효소의번성에기인한것으로추정되었다. 그리고 KMS외낮은용해도로인하여 KMS가효소용
42 하 용 호 • 유 성 운 ■김동섬■임세진• 최영욱
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Time (hr)
Fig. 3 —— In vitro skin permeation profiles of (A) KA and (B) KMS ： Cumulative amount-time plot of KMS and KA in receptor medium of IPA/THF (4：1 v/v). O: KA. • ： KMS.
지속적으로생성시키는피부투과특성을가지는것으로 결론지을수있다.
미백효과
KA는산성이기때문에각질박러효과를가지고있고 피부침투력이 좋으며, 친수성이기 때문에 표퍼 (epidermis)에오래머무르지않고시간의존적으로퍼 부를투과한다. 그러나. KMS는위의피부투과실험에서 확인되었듯이 KA보다 친유성이기 때문에 viable ep- idermis와진피 (dermis)에잔류할수있는가능성이높 아피부내에오랫동안머물러었을것으로사료되고. 이 러한괴부체류성은델라닌생성억제효과를상승시킬수 있을것으로기대되었다. 따라서 KA 및 KMS를함유하 는시험제제로서외용크림을제조하였으며, 별도로첨가 세로서 PP-15를가하여크림을제조하고실험동물에적 용하여미백효과를비교평가하였다. PP-15는평균분자 ceptor 메질로서 PBS/DMF(9：1)률사용하였을때전
체적인투과양상을보면 KMS는극히소량만이검출된 반던 KA는 지속적으로 증가하였다(Fig. 2). 따라서 KMS틀 피부에 적용하면 에스터라제에 가수분해되면 서 KA를지속적으로생성시킬수있음을확인하였다. 또 12시간을경계로 KA의증가속도가다소늦어졌으 며 삽입된 그래프를 보면 초기에 약 2.1 시간외 lag
time 이있움을알수있다. 즉 KMS 자체로서는초기 에소량만이I투과된다옴더이상중가되지 않았으나. 가수분해되어 생성되는 KA는 12시간까지 0.068 lig/
cmVhr, 그이후에는 0.028 Hg/cmVhr외 flux를나타 내면서지속적으로증가되었다.
한편 KMS가 receptor쪽에서 경시적으로증가하지 않고미량만이검출된이유는 KMS외 receptor 메질에 대한낮은용해도때문인것으로추정되었으나. 이를확 인하기위헤 KMS가층분히용해될수있는매질로서 IPA/THF(4： 1 v/v) 흔액을사용하여동일한조건에서 비교하였을뿐만아니라대조실험으로서 KA의피부투 파성도상호 비교하였다. 먼저 donor측이 KA용액인 경우(Fig. 3A), KA 누적투과량은 경시적으로지속적 인증가롤보이면서 0.384 Hg/cmVhr의 flux를나타내 어 KA자체는생체막을통해매우쉽게확산됨을알수 있었다. 그러고 donor측이 KMS용액인경우에는(Fig.
3B). receptor 매질이 PBS/DMF(9： 1)일때와는다르 게 KA가거외생성되지않았으며오히려 KMS의누적 투과량이경시적으로증가하였고이때외 flux는 0.228 Hg/cmVhr로써 PBS/DMF의 경우보다약 10배이상 증가하였다. 이러한현상은일차적으로유기용매(IPA/
THF) 조건에서에스터라제가불활성화되어 퍼부가단
순한확산막으로서의 역할밖에할수없었기때문일것 이며 이차적으로는 donor 메질로의약물의분배가증 가되었기때문인것으로해석되며 , 결과적으로 recep- tor쪽에서 KMS 누적투과량이증가하고 KA는생성되 지못한것으로사료된다. 특히 KMS의 flux가 KA외 flux보다 작게 관찰되었는데, 그 이유는 일차적으로 KA에비하여 KMS가분자량이커서생체막을통해확 산되기가더어려웠기때문인것으로사료되며, 나아가 지용성인 KMS가상대적으로피부에비교적오래저류 되었을가능성도배제할수없었다.
이상의결과로부터 KMS는피부를통해확산될 수 었으며피부의생러구조를고려할때주로피부에체류 하면서피부에스터라제에외해가수분해되면서 KA를
코직산 모노스테아레이 트의 가수분해와 피부투과특성 및 미백효과 43
25
20 ao/OTroLUJd^어이야
unoal<{2LUO/6T0IroQLUJdHJ30LU< }한이
Time (day)
Fig. 4 — Whitening effect (AL： lightness change) of dif
ferent creams. control. O: KA cream. ▼ ： KMS cream, V； KMS cream (PP).
량 1,800으로무색, 무향, 2,500~3,(X)0cps외매우안 정한수용성물질로서 in vitro 상에서피부에거외흡수 가되지않고전연성과부드러운촉감및피부건조개선 효과룰가지고있으며, 약물을각질층과살아있는표피 즉, 피부상층부에오랫동안머물게하는특정을가지고 있는폴리머이다.*^
미백효과는검게그을린기니픽의등피부에 각크림 을도포하고피부색이 점차원래대로희복되면서밝아 지는 정도틀 lightness change(AL)로서 비교하였으 며 , 그결과는 Fig. 4와같다. 대조군에비하여각시험 제제들이 모두 미백효과가 있는 것으로 나타났으며, KA cream과 KMS cream이거의비숫한미백효과를 보였고 PP-15률 함유하는 KMS cream(PP)이가장 우수한효과를 나타내었다. 이것은 PP-15가 KMS를 표피상층에 효율적으로국재화(localization)시켜 vi- able epidermis층의에스터라제에외해서가수분해되 면서 KA를지속적으로생성시켰기때문인것으로사료 된다. 따라서 KMS는 KA외머백작용은그대로유지하 면서산성에기인한 KA의피부자극은즐일수있을것 으로기대되며, 이러한피부자극완화에 대해서는향후 크림제 뿐아니라다양한제형외외용제제를제조하여 국소독성시험을통해더검토할예정이다.
결 론
KA외프로드럭으로서 KMS를성공적으로합성 할
수있었으며, 합성된 KMS는피부균질액으로부터얻은 효소용액중에서 가수분해되어 KA 를 유러시켰고 3TC에서의가수분해속도정수는 0.4132 hr■■이었고가 수분헤반감기는 1.68시간으로서, 프로드럭인 KMS는 피부에흡수되어에스터라제에 외해비교적빠르게가 수분해됨을알수있었다. 그리고경퍼확산설험장처를 이용하여 KMS의 피부투과특성을 관찰한 결과, re
ceptor 매질로서 PBS/DMF(9：1)를 사용하였을 때 KMS 자체로서는초기에소량만이투과된다옴더이 상 중가되지 않았으나 가수분해되어 생성되는 KA는 12시간까지 0.068 나g/cmVhr, 그이후에는 0,028 나g/
cmVhr의 flux를나타내면서지속적으로중가됨으로써 KMS는피부의생리구조를고려할때주로괴부각질 및상피층에체류하면서 skin esterase에의해가수분 헤되면서 KA를지속적으로생성시키는피부투과특성 을가지는것으로결론지을수있었다. 한편 I'n vivo 머 백실험결과로부터 KMS는 KA외 미백작용은 그대로 유지하면서 산성에 기인한 KA의피부자극은즐일수 있을것으로기대되었으며, 특히 Polyolprepolymer를 함유한 KMS 크림은미백효과가매우우수하여앞으로 이상외결과돌을기초로한외용제제의개발이더욱필 요하다고사료된다.
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44 하용호• 유성운• 김동섬• 임세진■최영욱
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코직산 모노스테아레이 트의 가수분해와 피부투과특성 및 미 백효과 45
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