Effect of Ochnaflavone as An Immunoadjuvant

Ochnaflavone의 면역보조제 효과

박민주·유기연·한용문^#

동덕여자대학교 약학대학 면역미생물학 실험실

(Received September 21, 2012; Revised September 29, 2012; Accepted September 30, 2012)

Effect of Ochnaflavone as An Immunoadjuvant

Minjoo Park, Ki Yon Rhew and Yongmoon Han^#

ImmunoMicrobiology Lab, College of Pharmacy, Dongduk Women’s University, Seoul 136-714, Korea

Abstract — In this present study, we determined whether or not there is an immunoadjuvant effect of ochnaflavone, a bifla- vone isolated from Lonicera japonica. As an antigenic source, the cell wall (CACW) of Candida albicans, a fungal pathogen, was used. CACW consists of 95% carbohydrate (mannan). In the experiments, BALB/c mice were immunized with emer- sion forms of CACW combined with or without ochnaflavone (Och) in the presence of IFA containing mineral oil or CACW alone. Then, the amounts of antisera collected from these mice groups were measured by the ELISA method. Data from these experiments showed that CACW combined with Och (CACW/Och/IFA) provoked the production of antisera app. 2.2 or 5 times more than the corresponding CACW/IFA or CACW alone (CACW/DPBS), respectively, in mice (P<0.05). We fur- ther examined the immune response type induced by Och. Analysis of the values of the IgG1/IgG2a ratios obtained from IgG isotyping revealed that Och induced Th2-immunity more dominantly than Th1. This finding was confirmed by cytokine profile. CACW/Och/IFA formulation induced IL-4 (Th2-type cytokine) more than IFNγ (Th1-type cytokine) as compared with CACW/IFA and CACW/DPBS formulations (P<0.05). All data combined, Och appears to have an immunoadjuvant activity that may convert Th1 immunity into Th2 immunity.

Keywords □ ochnaflavone, Candida albicans, immunoadjuvant, IgG isotyping, cytokine profile

면역계내의 면역반응에 중추적 역할을 담당하는 CD4+T-임파 구는 MHC(Major Histocompatability)로 제시되는 항원의 자극 에 의해서 활성과 증식과정을 통한 Th1-과 Th2- CD4+T-임파 구 작동세포(effector cell)로 분화된다.^1,2)분화된 CD4+T-임파 구는 다양한 cytokine을 분비하여 그 종류에 따른 cytokine profile이 설정되고³⁾이에 따른 작동기능을 예측될 수 있다. 그러 므로, 체내의 면역세포는 유입된 항원에 대한 면역반응 과정에 서 Th1과 Th2 반응비율에 따라 Th2 면역유도 지향성 체액면역 (Humoral Immunity)과 Th1 면역반응 지향성 세포매개면역 (Cell-Mediated Immunity)의 관련여부 유추가 가능하다.^4,5)

본 연구실에서는 지난 수 년 동안 면역보조제 개발에 많은 연 구를 수행해오고 있다. 이 연구의 일환으로 한약성분 중에서 대 략 60여 종류의 다양한 배당체 성분을 선택하여 이들 성분에 대 한 면역조절(Immunoregulation) 효과를 조사했는데 지금까지의

연구결과를 종합해보면, riterpenoide 계열의 인삼배당체 성분인 ginsenoside Rg1⁶⁾성분은 면역조절효과를 통해서 항균효과를 발 현하고 황기의 β-sitosterol 배당체인 daucosterol의 면역조절효 과에 의한 감염성관절염치료효과가 있으며,⁶⁾인동 성분 중에서 polyphenolic 계열성분인 chlorogenic acid⁷⁾과 flavonoid 계열의 rutin⁸⁾도 면역조절력이 있는 것으로 규명되었다. 이 연구결과에 서 CD4+T 임파구(lymphocyte)의 면역조절에 따른 Th1과 Th2 의 면역반응 유도성을 이용한 감염성질환의 치료가 가능하다는 것이다. 또한 몇 가지 성분에서는 사용농도에 따라 상반되는 면 역반응유도가 발현되기도 하고 이에 따라 질환치료가 달라질 수 있다는 것도 관찰되었다. 예를 들면, 감초의 지표성분으로 알려 진 glycyrrhizin의 비당부(aglycone)인 18β-glycyrrhetinic acid는 고농도에서는 CD4+T-임파구의 증식억제에 의한 기인성 감염성 관절염을 치료하는 효과가 있지만,⁹⁾반대로 저농도에서는 CD4+T- 임파구의 증식을 통해서 항체생성을 증진하는 면역보조제효과가 나타나기도 하였다.¹⁰⁾

최근 이주희의 발표논문¹¹⁾에 의하면 ochnaflavone(Och)은 Th2 면역반응을 유도하여 Th1 면역반응성을 선호하는 관절염 질환

#본 논문에 관한 문의는 저자에게로 (전화) 02-940-4521 (팩스) 02-940-4195 (E-mail) [email protected]

종설

의 치료가 가능하고, 이런 측면에서 면역보조제로서 항체의 생 성유도성이 예측되기도 한다. 그러나 이러한 이론적 추정에 대 한 직접적인 연구결과는 알려진 바가 없다. Och은 인동 [Lonicerae Folium et Caulis]과 금은화[Lonicerae Flos]에 함유 된 주요성분 중의 하나로 한방에서는 항염, 해열, 해독, 이뇨, 건 위, 강장 효과 등으로 사용하고 있다.¹²⁾특히 금은화는 은교산의 주요 주성성분으로, luteolin과 apigenin이 축합된 biflavonoid 형 태의 화학구조로 되어있고(Fig. 1), 항염증효과와 항암효과가 알 려진 바 있다.^13-18)

본 연구에서는 병원성 진균의 일종으로 원내감염(nosocomial infection) 원인의 4위를 차지하는^19,20) Candida albicans의 세포 벽을 항원(CACW)으로 사용하여 Och의 면역보조제로서의 효과 를 조사하였다. 이 진균의 세포벽은 주로 탄수화물인 mannan으 로 구성되어 있기 때문에,^21-23)단백질성 항원에 비교하여 상대 적으로 항체유도성(immunogenicity)이 매우 낮다. 그러므로 Och 의 첨가를 통해서 탄수화물 항원에 대한 항체의 증가가 수반된 다면 Och의 면역보조제로서의 효과 입증이 더욱 확실할 것으로 사료되어, 이에 이 병원성 진균을 선택하여 연구조사 하였다.

실험재료 및 방법

실험동물

본 실험에 사용된 생쥐는 6~7 주령의 BALB/c 암컷으로 Central Lab, Animal Inc., Seoul에서 구입한 후, 동물실 환경에 1주일간 적응시킨 후 실험하였다. 이 생쥐들은 멸균된 fiter-top cage에서 멸균된 사료와 물을 자유롭게 먹게 하였으며, 동물실의 환경은 온도 20±2^oC, 습도 50±10%로 유지하고 조명은 12시간 간격으로 주야를 조절하였다. 동물관리는 동덕여자대학교 동물 관리규정에 따라 취급하였다.

항원 및 항원분리

본 연구실의 기 연구에서 그 특성이 규명된 Candida albicans CA-1 strain^7,9,21,22)에서 추출한 세포벽(C. albicans cell wall;

CACW)을 사용하였다. CACW 추출을 위해서 진균배양은 37^oC 에서 GYEP(Glucose-Yeast Extract Peptone) 액체배지에서 배양

한 후 효모형태(blastoconidial form)의 세포를 원심분리법으로 수집하여 멸균된 인산완충용액(DPBS; Dulbecco's phosphated saline solution, Sigma, pH 7.4; 4^oC)으로 세척한 후에 기 연구 에서 사용한 방법^9,,21,23)을 이용하여 분리하였다. 분리방법을 간 략히 기술하면 다음과 같다. 수집한 세포를 disodium EDTA와 trisodium EDTA로 연속처리하고 β-mercaptoethanol으로 처리 한 후 상등액을 수집해서 투석막(membrane cut-off=2,000 Da) 에 넣고 멸균된 탈이온수에 대하여 투석하였다. 투석이 완료된 후 투석막 내부물질을 동결건조(Eyela FD-1000, Tokyo, Japan) 방법을 사용하여 분말화한 다음에 desiccator안에 저장보관하면 서 사용하였다.

항 C. albicans 항체생성 증진검색

백신제형을 제조하기 위해서 ochnaflavone(Och)(1 mg/ml)과 CACW(1 mg/ml)를 섞은 혼합액에 oil로만 조성된 IFA(Incomplete Freund's Adjuvant) 1 ml를 첨가하여 유화제 형태로 백신제형 (CACW/Och/IFA)을 제조하였다. 이 인동성분은 서울대학교 약학 대학 강삼식 교수님으로부터 기증받아서 사용하였다. 이 백신제 형 200 ml을 각 BALB/c 생쥐에 복강 내로 1차 면역접종을 한 후, 21일 후에 동일량의 CACW/Och 제형을 2차 접종(booster) 을 동일경로로 접종하였다. 일회 백신용량에는 CACW와 Och가 각 각 100 mg씩 함유되어 있다. 음성대조군으로는 CACW에 IFA 만을 첨가하여 유화제한 제형(CACW/IFA) 또는 CACW를 희석 액으로 사용한 DPBS에 용해한 제형(CACW/DPBS)을 제형 (formulation)을 각 생쥐그룹에 접종하였다. 2차 면역접종 일주일 후에 각 그룹의 생쥐들의 꼬리동맥에서 피를 수집하여 혈청 (polyclonal antiserum)을 분리하여 항체의 생성정도를 ELISA 방 법으로 검색하였다. 이 ELISA 방법은 본 연구실에서 기 연구에 서 사용한 방법으로,^2,24)간략히 기술하면 다음과 같다. 96-well flat bottomed plate에 항원으로 CACW를 2 mg/well로 coating한 후, 1% BSA 용액을 사용하여 blocking하고 4^oC에서 하루 밤 정 도 보관하였다. 그 후에 혈청을 1 : 100으로 희석하여 coating한 well에 첨가하고 일정시간 37^oC 5%-CO₂배양기에서 배양한 다 음에 희석용액(DPBS)으로 세척하였다. 세척 후에 poly Ig's 항 체(secondary antibody)를 첨가하고 상기처럼 동일한 배양조건에 서 배양하였다. 다시 DPBS로 세척한 다음에 OPD(o-phenyl- enediamine)을 첨가하여 30분 동안 처리한 후, 황산을 투여하고 microplate reader(Bio-Lab, USA)를 사용하여 발색정도를 측정 하여 항체생성 정도를 측정하였다.

IgG isotyping과 cytokine 생성검색

상기 기술한 방법에 따라 CACW/Och 면역한 생쥐에서 수집 한 혈청에서 IgG1, IgG2a, IgG2b 생성정도를 검색하였다. 이 실 험의 목적은 면역반응유도성을 조사하기 위한 것으로 IgG Fig. 1− Chemical structure of biflavonoidal compound, ochnaflavone.

isotyping 검색결과에 따른 Th1과 Th2 상관성^25-27)을 평가하였 다. 항체는 모두 Sigma에서 구입하여 사용였다. 또한, 동일한 목 적을 위해서 면역된 생쥐의 혈청을 biotinylated rat anti-INFγ 항 체와 biotinylated rat anti-IL-4 항체(Pharmingen, San Diego, CA, USA)를 사용하는 ELISA 방법으로 검색하였다. 평가방법은, IgG1과 IgG2a(또는 IgG2b)의 생성을 측정하여 Th1/Th2 비율을 계산한 후, IgG2a 생성이 우세하면 Th1 우세성 면역반응(Th1 predominant immunoresponse)이 유도된 것으로 평가하고, 반대 로 IgG1의 생성이 우세할 경우에는 Th2 우세성 면역반응이 유 도 된 것으로 평가 한다.²⁸⁾ 즉, IgG isotype 중에서 IgG1은 Th2 면역반응을 유도하며 IgG2a와 IgG2b는 Th1-immunotype의 면 역반응을 매개 한다.^29,30)이러한 평가방법에 근거하여 Och의 CD4+T-cell에 대한 면역유도성을 검색하였다. cytokine profile 에 의한 평가방법에서는 INFγ의 생산량이 많으면 Th1 lymphocyte가 더 활성화 된 것으로 평가하였으며, IL-4 생산이 많을 때는 Th2 lymphocyte가 더 관여한 것으로 판정하였다.^31,32)

통계

통계분석은 Student's t-test를 사용하여 분석하였고, 유의성 판 단에 사용된 유의수준(significance level)은 0.05이다.

결 과

Och의 항 캔디다 항체생성 증진효과

Och의 면역보조제효과를 검색하기 위해서 CACW 항원물질에 Och, IFA, 또는 DPBS와 혼합한 백신제형을 생쥐에게 각각 접종 한 후, 이 생쥐들로부터 혈청을 수집해서 anti-CACW antibody 생성의 증가여부를 ELISA 방법으로 조사하였다. 실험결과를 분 석해 볼 때, Och를 첨가한 백신제형(CACW/Och/IFA)은 CACW/

IFA 제형보다 대략 2.8배 이상의 항체생성이 증가되었으며(P<

0.05) CACW 단독(CACW/DPBS)으로 접종된 경우에 비교해서 는 무려 5배의 항체증가가 검색되었다(P<0.05)(Fig. 2). 한편, CACW/DPBS제형을 기준으로 해서 CACW/IFA 제형의 경우를 비교하면 보면 대략 2.2배의 항체증가가 있지만, Och가 첨가된 제형에 비교해서는 항체유도성이 현저하게 감소한 것을 알 수 있 었다(Fig. 2).

Och의 면역유도성 효과 - IgG isotyping

Och의 면역유도성을 먼저 IgG-isotyping 방법을 사용하여 조 사하였다. CACW에 Och를 첨가한 제형(CACW/Och/IFA)과 Och 를 첨가하지 않은 CACW/IFA 대조군간의 결과를 상호비교해보 면, 전체 IgG(total IgG) 생성에서 CACW/IFA 대조군에 비해서 거의 1.6배 이상의 증가가 있고(P<0.05), 아울러 IgG1과 IgG2a 의 생성도 이 대조군에 비해서 증가하였음을 알 수가 있었다(P<

Fig. 2− Ochnaflavone (Och) increases production of anti-candidal antiserum when combined with CACW. CACW/Och/IFA formula provoked production of antibody specific for C.

albicans app. 2.2 or 5 times more than the corresponding CACW/IFA or CACW alone (CACW/DPBS), respectively, in mice (P<0.05). This indicate that Och has an ability of immune adjuvanticity. Each mouse group contained five mice. Bar, S.E.

Fig. 3− Och induces Th2-immunity more dominantly than Th1 as determined by analysis of the IgG1/IgG2a form IgG isotyping. In the presence of Och, there was an increase of IgG1/IgG2a values indicating a conversion of Th1- immunity into Th2-immunity. This Th2 type dominance may be advantageous to provoke humoral immunity than cell-mediated immunity. Bar, S.E.

0.05)(Fig. 3). 또한, CACW/DPBS의 값어치를 1로 기준하여, CACW/Och/IFA 결과를 비교해보면 4.8배의 Total IgG 항체의 증 가가 있었다(Fig. 3). 한편, Och의 면역유도성을 조사하기 위해 서 IgG1/IgG2a 비율로 계산했을 때, CACW/Och/IFA의 경우에 는 그 비율이 1.10으로 CACW/DPBS에서 산출된 0.95 비율에 비교하면, Och를 첨가 시에 Th1 면역반응에서 Th2 면역반응성 으로 전환되는 경향이 있음을 알 수가 있었다(Table I). CACW 의 경우에도 비율이 0.98로 Th1 면역반응이 여전히 우세함을 알 수가 있어서 Och의 첨가로 인해서 면역유도성의 변화를 알 수 가 있었다(Table I).

Och의 면역유도성 효과 - cytokine profile

Och의 면역유도성을 확신하기 위해서 cytokine profile 방법을

사용하여 검색하였다. CACW/Och/IFA로 면역된 생쥐의 혈청과 CACW/IFA 또는 CACW/DPBS를 투여받은 생쥐그룹에서 획득 한 혈청에서 검색된 IFNγ과 IL-4의 생성정도를 상호 비교한 결 과를 분석해보면, 모든 경우에서 IFNγ와 IL-4 검색되었고, 두 대 조군 모두에서는 IFNγ 생성이 IL-4 생성보다 더 많은 반면에 CACW/Och/IFA로 처리된 생쥐군에서는 IL-4의 생성이 증가한 반면에 IFNγ의 생성은 감소 한 것으로 검색 되었다(P<0.05) (Fig.

4). 이 실험결과를 상기 IgG Isotyping 결과(Table I)와 비교하면, 이 분석결과도 IgG isotyping에서 분석한 결과처럼 CACW/Och/

IFA로 면역된 생쥐에서 Th2 면역반응이 더 우세하게 발현되는 것을 확인되었다.

고 찰

본 연구에서는 주로 인동과 금은화에 함유하고 있는 ochnaflavone(Och)의 면역보조조제 효과여부를 병원성 진균인 C.

albicans의 세포벽(CACW)을 항원으로 사용하여 조사하였다. 이 미 서론에서 언급하였듯이 이 세포벽은 거의 탄수화물을 함유하 고 있기 때문에 그 자체로서는 항체유도성이 매우 적다. 이점에 착안하여 본 연구실의 기 연구에서 사용한 방법을 이용해서 CACW를 분리 추출하여 Och와 혼합 유화제 형태를 조성하기 위 해서 순수 oil로만 조성되어 IFA를 첨가하여 소위 백신제형을 제 조하였다. 대조군으로는 Och를 포함하지 않은 CACW/IFA와 희 석액으로 사용한 완충용액(DPBS)에 용해한 제형인 CACW/DPBS 를 사용하여 산출된 결과를 상호비교하여 Och의 면역보조제효 과를 그리고 더 나가서, Och의 면역조절효과를 연구조사하였다.

실험결과에서 Och를 첨가한 백신제형(CACW/Och/IFA)은 Och 를 함유하지 않은 제형에 비해서 월등하게 항체생성의 증가가 관 측되었다. CACW/IFA제형이 CACW를 단독으로 사용한 경우에 비해서는 약 2배의 항체생성의 증가가 관찰되었으나, Och가 포 함된 제형(약 5배)에 비교하면 그 증가율은 적다. 물론 Och가 포 함된 제형에서 항체생성의 증가율은 IFA에 의한 효과도 포함되 어 있는 것으로 사료된다. 그러나 단순히 산술적 계산에 의하면, 그 5배에서 IFA 효과(2.2배 정도)에 의한 부분을 제외한 거의 2.7 배에 가까운 항체증가 효과는 Och에 의한 것으로 평가된다. 이 로서 Och는 CACW 항원에 대한 항체유도 시에 면역보조제로 작 용함이 분명해 보인다. 이런 면역보조작용에 대한 일종의 작용 기전을 검사하기 위해서 Och에 의한 면역유도성 효과를 검색하 였다. 이 검색을 위해서 IgG isotyping과 cytokine profile 방법 을 사용하였다. 먼저 Och를 첨가한 제형과 첨가하지 않은 제형 간의 증가 수치(values)를 비교해보면, 우선 total IgG, IgG1, IgG2a 모두에서 Och가 첨가 되었을 때 증가율이 월등하게 증가 하였다. 이 는 Och의 면역보조제 효과로 인하여 전반적으로 항 체(anti-candidal antisera) 생성의 양이 증가했을 것으로 사료된 Table I− Och induces Th2-immunity more dominantly as analyzed

by IgG isotyping

Treatment Total IgG^*1

Ratio of IgG1/IgG2a

Evaluation of Immune Response

CACW/DPBS 1.00 0.92 Th1-dominant

CACW/IFA 1.73 0.98 Th1-dominant

CACW/Och^*2/IFA 4.80 1.10 Th2-switched Note:*1) Total IgG vakues were based on CACW/DPBS value as 1.

*2) Och stands for ochnaflavone.

Fig. 4− The cytokine profile confirms that Och indeed provokes Th2 type immune response. Data resulting from ELISA analyses revealed that IL-4 (Th2 type cytokine) production was increased whereas INFγ (Th1 type cytokine) production was reduced when Och was combined with CACW. These data implicate that Och has an immunoadjuvant activity inducing Th2 immunity more dominantly than Th2. Bar, S.E.

다. 더욱 흥미로운 점은, Och의 면역유도성 분석을 위한 IgG1/

IgG2a 비율의 분석에 의하면 CACW/Och/IFA의 경우에는 1.10 이며 CACW/DPBS에서의 비율은 0.92로 평가되어서 CACW에 Och를 첨가하면 Th1 면역반응에서 Th2 면역반응성으로 전환되 는 경향이 있다는 것이다. 이 결과는 cytokine profile 방법으로 도 확인이 되어서 Och의 존재여부에 따라서 Th1 면역반응의 대 표적인 cytokine인 IFNg과 Th2 면역반응의 대표적인 cytokine 인 IL-4의 생성에 역전되어서 Th1[IFNγ>IL-4]이 Th2[IFNγ<IL- 4]로 전환되었다. 이 결과 역시 Och는 Th2 면역반응을 유도하는 것으로 평가된다. 하지만 Och에 의해서 Th1에서 Th2로 전환이 되었다고 하더라도 여전히 Th1의 면역성도 존재하기 때문에 어 느 한 쪽의 면역성만 존재한다고는 할 수가 없다. 그래서 CACW/

Och/IFA 백신제형이 체액면역과 세포매개 면역반응을 모두 유도 하지만 세포매개면역반응보다는 체액면역이 우세하게 유도하는 것으로 추정된다.

결론적으로 이에 ochnaflavone은 항 캔디다항체 생성을 증진 하는 면역보조제 효과가 있으며, 이는 이 한약성분의 Th1 면역 성을 Th2 면역성으로 전환하는 능력과 관계가 있는 것으로 여 겨진다. 이에 대한 확실한 결과를 규명하기 위해서 현재 Och를 면역보조제로 하는 진균백신을 개발하는 연구가 본 연구실에서 진행 중에 있다.

사 사

본 연구에 사용한 Ochnaflavone을 선물로 주신 서울대학교 약 학대학의 강삼식 교수님께 진심으로 감사드립니다.

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