Single Dose Toxicity Study on Galgeuntang in Mice

▒

▒

갈근탕 추출물의 단회투여 독성 시험

이지혜 ¹ , 이재훈 ¹ , 마충제 ² , 마진열 ¹

1한국한의학연구원 신한방제제연구센터

2강원대학교 바이오산업공학부 생물소재공학전공

Single Dose Toxicity Study on Galgeuntang in Mice

Jihye Lee ¹ , Jaehoon Lee ¹ , Choongje Ma ² , Jinyeul Ma ¹

1Center for Herbal Medicine Improvement Research, Korea Institute of Oriental Medicine

2Department of Biomaterials Engineering, School of Bioscience and Biotechnology, Kangwon National University

In this study, we investigated the single dose toxicity and safety about water-extracted Galgeuntang. To evaluate single dose toxicity, 20 male and 20 female ICR mice were observed survival rates, general toxicity, changes of body weight for 14 days after single oral administration of 0 (control group), 1250, 2500 and 5000 ㎎/kg Galgeuntang. And after 14 day, We observed autopsy. Compared with the control group, we could not find any toxic alteration in all treated groups (1250, 2500 and 5000 ㎎/㎏). LD50 of Galgeuntang might be over 5000 ㎎/kg and it is very safe to ICR mice.

keyword : Galgeuntang, Single dose toxicity, Safety, LD 50

I. 서 론

葛根湯은 약 2000여년전부터 한방에서 사용해 오고 있는 처방으로서, 傷寒論에 의하면 “太陽病으로 등과 목이 뻣뻣 하면서 당기고, 땀이 나지 않으면서 바람을 싫어할 때 갈근 탕을 반드시 사용한다”고 하였다. 갈근탕은 갈근, 감초, 작 약, 마황, 대조, 계피, 생강의 7가지 한약재로 이루어진 처방 으로, 한방에서는 해열, 감기, 두통, 편두통 및 진경 등에 약 으로 사용되고 있다.

¹⁾

한방처방이나 한약재에 대한 관심이 크게 증가하면서 갈

근탕의 효능을 과학적으로 검증하기 위한 다양한 실험적 연 구가 이루어 졌다. 갈근탕의 주성분인 갈근의 생리 활성 성 분인 puerarin, daidzin, daidzein, genistein, biochanin A

²⁾

³⁾

^4,5)

⁶⁾

⁷⁾

⁸⁾

⁹⁾

¹⁰⁾

¹¹⁾

1990년대 이후 마황에 함유된 ephedrine 성분의 안전성

Herb Scientific Name Dose(g)

葛根 Puerariae Radix 400

麻黃 Ephedrae Herba 200

乾薑 Zingiberis Rhizoma 50

大棗 Zizyphi Fructus 200

桂皮 Cinnamomi Cortex 150

芍藥 Paeoniae Radix 150

甘草 Glycyrrhizae Radix 100

Total weight 1250.0

<Table 1> The prescription of Galgeuntang

에 대한 논란과 800여건에 이르는 부작용 사례가 미국식품 의약국(FDA)에서 제기되며, 마황을 포함한 한방처방의 안 전성에 대한 연구의 필요성이 대두되고 있다.

^12,13)

14)

Ⅱ. 재료 및 방법

1. 시험물질

본 실험에서 사용한 갈근탕의 구성처방인 갈근, 대조, 작약 은 영천현대약업사(경북 영천시 완산동 925-15)에서 구입하 였으며, 마황, 계피는 풍산제약(경북 안동시 수하동 311-1) 에서, 건강은 백제허브(대전 광역시 동구 중동 23-4)에서, 감초는 미륭생약(경북 영천시 금노동 377-26)에서 각각 구 입하였다. 본 연구에서는 전탕추출법(한국, 경서추출기 cosmos-660)에 의한 시험물질 조제를 실시하였으며 처방 구성(Table 1)에 따른 각 한약재들은 16.7 L의 생수(화이트, 경남 산청군 삼장면 덕교리 800)에 1시간동안 침적시킨 다음 180분간 열탕 추출하였고, 동결건조기(한국, 일신 FD5512) 를 사용하여 분말 형태로 조제하였다(수율 29.43%).

2. 실험동물 및 사육환경

실험구역은 한국한의학연구원 동물실험실에서 실시하였 으며, 암․수 ICR 마우스(오리엔트 바이오, 경기도 성남시 중원구 상대원동 143-1) 4주령을 사용하였다. 동물입수 시 외관을 육안으로 검사한 후, 일주일간 시험을 실시하는 동 물실에서 순화시키고 그 중 건강한 동물을 골라 실험에 사 용하였다. 순화 기간 중, 일반 임상증상을 관찰하여 건강한 동물을 암․수 20마리씩 선정하여 체중범위에 따른 무작위 법에 의하여 군 분리를 실시한 후, 본 실험에 사용하였다.

실험은 실험동물윤리위원회의 승인을 거쳐 이루어졌으며, 순화 및 실험기간 동안의 사육환경은 온도 23±3℃, 상대습 도 50±10%, 환기횟수는 시간당 12～16회, 조명은 12시간 명암주기(점등 7:00, 소등 19:00), 조도는 150～300 Lx로 조정하여 일정한 사육환경 조건을 유지하였다. 그리고 실험 동물용 고형사료(PMI nutrition, USA)와 물은 자유 섭취 조건으로 하였다.

3. 실험군 및 한약재투여

5주령 마우스에 대한 급성 경구독성을 평가하기 위하여 암․수 ICR 마우스를 각각 4개의 용량군으로 나누었다 (Table 2). 투여 경로는 한방 임상에서 가장 널리 이용되고 있는 경구투여법을 이용하였으며, 본 연구에서 설정된 투여 용량은 한계용량 5000 ㎎/㎏을 기준으로 하여 공비 0.5로 3개 군을 설정하고, 대조군을 포함하여 모두 4개의 군 (5000, 2500, 1250, 0 mg/kg)으로 정하였다. 각 용량군의 한약재는 투여 직전에 3차 증류수에 희석하여 실험에 공시 하였으며 동물을 하룻밤 절식시킨 후 배부 피부 고정법으로 고정하고 경구투여용 금속제 존데와 주사관을 이용하여 강 제 경구 투여하였다.

Group Animal

Number No. of

animal Sex Volume

(㎖/㎏) Dose

(㎎/㎏/day)

C^* 1～5 5 Male 10 0

T^†1 6～10 5 Male 10 1250

T2 11～15 5 Male 10 2500

T3 16～20 5 Male 10 5000

C 21～25 5 Female 10 0

T1 26～30 5 Female 10 1250

T2 31～35 5 Female 10 2500

T3 36～40 5 Female 10 5000

* ; Control group.^†; Treatment group.

<Table 2> Experimental groups

Sex Dose ( ㎎/ ㎏)

No. of mal ani

Days after treatment LD

( ㎎/ ㎏) 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

M a e l

0 5 0/5*0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5

>5000

㎎/㎏

1250 5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 2500 5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 5000 5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5

F e m a e l

0 5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5

>5000

㎎/㎏

1250 5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 2500 5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5

5000 5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5

*: Values are expressed as No. dead/No. animal.

<Table 3> Mortality of male and female ICR mice treated with galgeuntang

4. 임상증상 및 부검

임상 증상은 투여 당일에는 투여 직후부터 6시간 동안 매 시간 관찰하였으며, 그 후 14일(1일 1회) 동안 일반증상 관 찰법에 의하여 관찰하였다.

¹⁵⁾

5. 통계학적 방법

실험결과의 통계학적 분석은 SPSS package program (version 12.0)을 이용하였으며, 평균과 표준편차는 one- way ANOVA(analysis of variance)를 사용하여 구하였 고, 사후분석은 Duncan's multiple comparison test를 하 여 유의수준p < 0.05 수준에서 검증하였다.

Ⅲ. 결과

1. 치사율 및 LD50 값

<Table 3>과 같이 갈근탕 추출물을 경구로 단회 투여한 시험물질 투여군과 3차 증류수를 단회 경구 투여한 대조군

의 암․수 ICR 마우스를 14일 동안 관찰한 결과 사망동물 은 관찰되지 않았다. 따라서 본 실험의 경우 한계용량(5000

㎎/㎏/day)까지 경구 투여하여도 사망례를 관찰할 수 없어 LD

50

2. 임상 증상

<Table 4>와 같이 갈근탕 추출물을 경구로 단회 투여한 암․수 ICR 마우스를 투여 후 6시간 까지 매시간, 투여 다 음날부터 14일 까지는 매일 1회 이상씩 관찰한 결과 각 농 도의 갈근탕 추출물을 투여한 모든 마우스에서 대조군과 비 교하여 보행장애, 행동이상, 웅크림, 설사, 부종, 호흡촉박, 몸단장, 뛰어오름, 유루, 무기력증, 구토, 비루, 마비, 유연 등 시험 물질 투여와 관련된 어떠한 임상증상의 이상소견도 관찰되지 않았다.

Variable

＼Sex Male Female

＼Group C T1 T2 T3 C T1 T2 T3

＼Dose

( ㎎/㎏) 0 1250 2500 5000 0 1250 2500 5000

＼No. of

animal 5 5 5 5 5 5 5 5

Ataxia 0/5* 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5

Bizarre

Behavior 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5

Crouching 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5

Diarrhea 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5

Edema 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5

Gasping 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5

Crooming 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5

Jumping 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5

Lacrimation 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5

Lethargy 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5

Nausea 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5

Nasal

Discharge 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5

Paralysis 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5

Salivation 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5

*: Values are expressed as No. abnormal/No. animal.

<Table 4> Clinical signs of male and female ICR mice treated with galgeuntang

3. 체중 변화

갈근탕 추출물을 경구로 단회 투여한 시험물질 투여군 및 대조군의 체중 변화를 관찰한 결과는 <Table 5>와 같다.

경구 투여 후 시험물질 투여군과 대조군 모두 개시체중에

Varia ble

＼Sex Male Female

＼Group C T1 T2 T3 C T1 T2 T3

＼Dose

( ㎎/㎏) 0 1250 2500 5000 0 1250 2500 5000

＼No. of

animal 5 5 5 5 5 5 5 5

Heart 0/5* 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5

Lung 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5

Thymus 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5

Liver 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5

Spleen 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5

Kidney 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5

Adrenal

gland 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5

Intestines 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 Autopsy finding at 1 day treatment of test substances.

*: Values are expressed as No. abnormal/No. animal.

<Table 6> Autopsy Finding of Male and Female ICR Mice Orally Treated with Galgeuntang

비하여 체중이 증가하였으나, 투여 전, 투여 후 1, 3, 7, 14일 모두 대조군과 각 농도별의 갈근탕 추출물 투여군 간의 유 의적인 체중변화의 차이는 관찰할 수 없었다.

Sex Group No. of animal

Body Weights (g) Days after treatment

0 1 3 7 14

Male

C 5 30.58±2.02* 32.03±2.00 33.16±1.77 34.45±1.89 37.28±1.16 T1 5 30.66±1.73 34.86±2.07 35.11±1.66 36.79±2.31 38.06±2.24 T2 5 31.07±2.00 33.02±2.53 34.23±2.48 35.22±2.83 37.15±2.99 T3 5 30.56±2.57 33.64±3.47 34.54±3.09 36.11±3.00 39.19±2.35

Female

C 5 24.57±1.33 27.12±2.01 27.27±1.03 27.70±1.89 28.95±2.42 T1 5 24.31±0.81 27.17±1.26 26.89±0.86 27.89±1.94 30.26±3.21 T2 5 23.71±0.75 25.76±1.12 26.39±1.91 27.02±1.95 28.76±1.57 T3 5 24.57±0.83 26.60±1.14 26.13±0.98 26.89±0.92 29.13±2.25

* : mean±SD

<Table 5> Means of body weight changes of male and female ICR mice orally treated with Galgeuntang in single dose toxicity.

4. 부검 소견

실험 종료 시, 모든 실험동물을 부검하여 주요 내부 장기 의 육안적 소견을 관찰한 결과 <Table 6>과 같이 갈근탕 추출물 1250, 2500, 5000 ㎎/㎏ 투여군과 대조군 모두에서 심장, 폐, 흉선, 간, 신장, 부신, 비장, 위, 대장 맹장등 주요 내부 장기에 대한 외관상의 어떠한 이상 병변도 발견되지 않았다.

Ⅳ. 고찰

갈근탕은 전통적으로 한방에서 사용되어온 다 빈도 처방 으로 다양한 방면에서 질병의 완화 및 치료에 사용되어 왔으 며 최근 그 한약처방 및 한약처방에 사용되는 한약재 중의 유효성분과 효능에 대한 다양한 과학적 검증

^2-11)

¹⁶⁾

즉, 갈근탕 전탕액은 동결 건조하여 0(control), 1250, 2500, 5000 ㎎/㎏ 용량으로 암․수 ICR 마우스에 단회 경구투여 하였고, 이후 14일 간 치사율, 체중, 임상증상 및 부검 후 내부 장기의 이상 병변 유무에 대한 육안적 소견을 관찰하였 다. 갈근탕 추출물에 대한 급성독성 시험을 실시한 결과 갈 근탕 추출물을 0, 1250, 2500, 5000 ㎎/㎏ 용량으로 투여한 모든 암․수 ICR 마우스에 대하여 사망이 관찰되지 않았고, 이로 인하여 LD

50

㎏을 훨씬 상회하는 5000 ㎎/㎏ 용량에서 실험동물에 독성 이 나타나지 않았기에 갈근탕은 급성독성이 없는 안전한 물 질로 생각된다.

Ⅴ. 결론

한방처방으로 널리 사용되고 있는 갈근탕에 대한 급성독 성을 실험적으로 평가하고자 ICR 마우스에 투여한 후 임상 증상 및 부검소견, 그리고 치사율과 체중변화 등을 관찰한

결과 다음과 같은 결론을 얻었다.

1. 시험기간 중 갈근탕 추출물 투여군 및 대조군에서 사 망동물이 관찰되지 않아, LD

50

2. 시험물질 갈근탕 추출물 투여에 의한 어떠한 독성증상 도 관찰되지 않았다.

3. 갈근탕 추출물 투여로 인한 체중변화 역시 관찰되지 않았다.

4. 실험 종료 시, 모든 동물의 장기에 대하여 육안적 병변 을 관찰하였으나 이상 병변은 관찰되지 않았다

이상의 결과로부터 갈근탕의 LD

50

수 ICR 마우스에 단회 경구 투여 시 급성독성을 나타내는 변화가 관찰되지 않아 저독성인 안전한 물질로 작용되는 것 으로 생각된다.

Ⅵ. 감사문

이 연구는 교육과학기술부 지원 한국한의학연구원 기관 고유사업 K09040의 지원을 받아 수행되었음.

Ⅶ. 참고문헌

1. 박영순, 한방의 약리해설, 서울:아카데미서적, 2002:196-202.

2. Wang C.Y., Huang H.Y., Kuo K.L., Hsieh Y.Z., ｢Analysis of puerariae radix and its medicinal

preparations by capillary electrophoresis｣, J Chromatogr A, 1998;802(1):225-231, 3. Sato T., Kawamoto A., Tamura A., Tatsumi Y., Fujii

T., ｢Mechanism of antioxidant action of pueraria glycoside(PG)-1 (an isofla-vonoid) and mangiferin (a xanthonoid)｣, Chem Pharm Bull, 1992;40:721 -724.

4. Keung W.M., Vallee B.L., ｢Kudzu root, an ancient Chinese source of modern antidipsotropic agents｣,

Phytochemistry, 1998;47:499-506.

5. Kurihara T., Kikuchi M., ｢Studies on the constitu-

ents of flowers, V, On the components of flower of Pueraria thunbergiana benth, (2) Isolation of a new isoflavone glycoside｣, Yakugaku Zasshi, 1975;95:

1283-1285.

6. 김현아, 정지천, 박선동, ｢승마갈근탕 및 승마갈근탕합사 물탕의 항 Histamine 효과에 관한 연구｣, 한의학연구 원논문집, 1994;3:207-222.

7. 송성필, 김진만, 임규상, 김남권, 권일호, ｢승마갈근탕가 미방이 소염작용에 미치는 영향｣, 대한안이비인후피부 과학회지, 2004;17(2):12-30.

8. 연규봉, 권창호, ｢Rat 간조직 대사에 미치는 갈근탕의 영 향에 관한 연구｣, 경희대약대논문집, 1974;2:53-57.

9. 권창호, ｢갈근탕 투여가 흰 쥐의 스트레스 저항 반응에 미치는 영향에 관한 연구｣, 생약학회지, 1974;5(4):

217-222.

10. 양태규, 김윤범, 채병윤, ｢갈근탕과 가미갈근탕의 항알 레르기 및 소염, 해열, 진통작용에 대한 실험적 연구｣,

대한안이비인후피부과학회지, 2002;15(1):76-95.

11. 조의환, 김일혁, ｢의약품의 병용 투여 효과에 관한 연구 (I) : 갈근탕 엑기스와 Aspirin의 병용 투여가 항염 및 진통작용에 미치는 영향｣, 생약학회지, 1985;16(1):

7-11.

12. 임경아, 조여원, ｢High performance liquid chrom- atography에 의한 마황 분획물의 ephedrine 분석｣,  생활과학논집, 2000;4(1):39-46.

13. 장문석, 심경준, 오지훈, 윤지원, 최문정, 김도림, 양웅 모, 임형호, 이명종, 박성규, ｢SD계 흰쥐에 대한 마황 추출물의 급성 경구투여 독성 시험 연구｣, 동의생리 병리학회지, 2008;22(4):762-765.

14. 김동렬, 곽결순, 정석문, 이승철, 하정욱, ｢시판 갈근탕 의 항산화능의 비교｣, 한국식품영양과학회지, 2003;

32(5):728-732.

15. Wallace H.A., Principles and methods of toxi- cology, New York Press, 1984;17-19.

16. 이재준, 장해춘, 이명렬, ｢김치로부터 분리한 Leucon-

ostoc citreum GJ7의 마우스에 대한 급성독성｣, J

Kirean Soc Food Sci Nutr, 2007;36(5):534-539.