The Anti-inflammatory Effect of Cheongyeonsan for Allergic Rhinitis

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알러지성 비염에 대한 청연산 추출물의 항염증효과

김정원¹․안상현²․김기봉^1,3

1부산대학교 한의학전문대학원, ²세명대학교 한의과대학 해부학교실, ³부산대학교한방병원 한방소아과

Received: January 16, 2018 ∙ Revised: February 4, 2018 ∙ Accepted: February 6, 2018 Corresponding Author: Kibong Kim

Department of Korean Pediatrics, Pusan National University Korean Medicine Hospital, Geumo-ro 20, Mulgeum-eup, Yangsan-si, Gyeongsangnam-do, 50612, Republic of Korea Tel: +82-55-360-5952 / Fax: +82-55-360-5952

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Abstract

The Anti-inflammatory Effect of Cheongyeonsan for Allergic Rhinitis

Kim Jeong Won¹․Ahn Sang Hyun²․Kim Ki Bong^1,3

1School of Korean Medicine, Pusan National University,

2Department of Anatomy, College of Korean Medicine, Semyung University,

3Department of Korean Pediatrics, Korean Medicine Hospital, Pusan National University

Objectives

This study investigated the effects of Cheongyeonsan for allergic rhinitis.

Methods

First, the GS/MS was used to analyze the effects of Cheongyeonsan by measuring inflammatory markers. Second, 3 groups of 10 6-week-old BALB/c mice were divided into Ctrl (no treatment), ARE (allergic rhinitis-induced without treatment), and CRT (allergic rhinitis-induced after Cheongyeonsan treatment) groups. Ovalbumin (OVA) was used as an antigen to induce allergic rhinitis and sensitization was performed by intraperitoneal injection of 0.1% OVA solution 21, 14, and 7 days before the onset of allergic rhinitis. Allergic rhinitis was induced by dropping OVA solution on the nasal cavity of each mouse for 5 days after the last sensitization. Seven days after the first induction, second induction was introduced by the same method. After making the section, MMP-9, substance P, TNF-α, NF-κB p65, COX-2, iNOS and Nrf, apoptotic cells were observed by Masson trichrome staining, immunohistochemical staining, TUNEL of nasal mucosal tissues of each group.

Results

GC/MS results showed undecanoic acid. Masson trichrome results showed that the CRT group had less respiratory epithelial damage. Immunohistochemical staining showed CRT group had 58% decrease in MMP-9, 61% decrease in substance P, 55% decrease in TNF-α, 38% decrease in NF-κB p65, 53% decrease in COX-2, 54% decrease in iNOS, 87% increase in Nrf compared to those of the ARE group. TUNEL showed a positive reaction of 84%

increase in apoptotic cells greater than that of the ARE group.

Conclusions

Cheongyeonsan alleviates nasal mucosal damage and reduces inflammatory mediators from allergic rhinitis-induced mice.

Key words: Cheongyeonsan, Allergic rhinitis, Substance P, TNF-α, NF-κB p65

ISSN 1226-8038(Print), 2287-9463(Online), https://doi.org/10.7778/jpkm.2018.32.1.019

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Ⅰ. Introduction

알러지성 비염 (Allergy rhinitis, AR)이란 집먼지 진 드기, 꽃가루 등의 알러지 항원으로 인한 코점막의 자 극에 의해 생기는 질환으로, 주 증상은 지속되는 재채 기, 코막힘, 맑은 콧물 등을 특징으로 한다¹⁾. 증상 자체 는 위중하지 않지만, 환자의 삶의 질을 크게 저하시키 며 육체적, 정신적 손실을 유발한다^2,3). 2015년 보건복 지부 국민건강영양조사를 살펴보면 만 19세 이상 성인 의 16.4%가 알러지성 비염으로 진단을 받았으며 유병 률은 3~19%에 다다른다. 비록 국가나 인종에 따른 차 이를 보이지만 스트레스와 환경오염 등으로 인한 면역 력의 저하로 전세계적으로 알러지성 비염은 지속적으 로 증가하고 있는 추세이다⁴⁾.

알러지성 비염의 표준 진단 및 치료는 2015년 발표된 미국 이비인후과학회 (American Academy of Otolaryngology- Head and Neck Surgery, AAO-HNSF)의 가이드라인을 따르고 있으며, 기존 가이드라인인 ARIA (Allergic Rhinitis and Its Impact on Asthma)에서 권장되지 않았 던 침 치료가 새로 추가되었다. 가이드라인에 따른 알 러지성 비염의 치료 방법으로 스테로이드제와 항히스 타민제의 사용, 아래코선반 절제술 (Inferior Turbinate Reduction), 면역요법 (Immunotherapy) 등을 제시하고 있다⁵⁾. 그러나 항히스타민제는 졸음을 유발하며, 국소 스테로이드제는 비중격 천공과 비출혈 등을 야기한다

6). 또한 소염진통제는 심혈관 질환, 사망 등의 치명적 인 부작용과 청력감소가 나타나는 등의 위험성을 가지 고 있다^7,8).

한의학에서 비염은 鼻齆, 鼻臭, 鼻噴, 鼻鼽의 범주 에 속하며, 脾, 肺, 腎의 虛弱, 飮食勞役의 內因과 風寒邪氣, 運氣, 六淫의 外因, 心火, 七情內鬱 등의 不內外因을 원인으로 보며, 扶正祛邪하여 궁극적으로 脾, 肺, 腎의 기능조절을 치료의 목적으로 한다⁹⁾.

청연산 (淸淵散, Cheongyeonsan, Qīngféisàn)은 ≪晴崗醫鑑≫에 나오는 처방으로 鼻流淸涕, 鼻塞, 前頭痛, 鼻聲不爽을 주치로 한다. 청연산이 알러지성 비염에도 효과가 있을 것으로 생각되어 청연산의 알러지성 비염 치료효과에 대한 선행 연구를 조사해 보았지만 관련된 연구는 찾을 수 없었다. 반면 본 실험과 유사한 방법으 로 荊芥連翹湯과 防風通聖散을 사용한 연구에서 알러 지성 비염을 유발한 생쥐의 항염증 매개물질을 조절하 는 효과가 있음을 확인할 수 있었다^10,11). 이에 본 연구

에서는 청연산 추출물로 알러지성 비염 치료에 활용할 수 있는 근거를 마련하기 위하여 청연산 추출물의 비 강 점막손상의 완화와 항염증효과를 관찰한 결과, 유 의성을 확인하였기에 보고하는 바이다.

Ⅱ. Materials and Methods

1. 실험 약물

실험에 사용된 청연산은 부산대학교한방병원에서 제조하였다 (Table 1). 청연산 2첩을 증류수 1500 ㎖에 넣어 3시간 전탕 후 여과하였다. 그 여액을 rotary evap- orator를 사용하여 50 ㎖으로 감압, 농축하여 동결 건조 한 후 추출물 24 g (수득률 22.2%)을 얻어 사용하였다.

투여량은 400 ㎎/㎏로 결정하였고, 알러지성 비염 유발 후 경구 투여하였다.

Table 1. The Amount and Composition of Cheongyeonsan Extract

Herbal Name Scientific Name Dose (g)

荊芥穗 Schizonepetae Spica 12

連翹 Forsythiae Fructus 8

蒼朮 Atractylodis Rhizoma 8

升麻 Cimicifugae Rhizoma 8

防風 Saposhnikoviae Radix 8

羌活 Osterici Radix 8

藁本 Angelicae Tenuissimae Radix 8

川芎 Cnidii Rhizoma 8

薄荷 Menthae Herba 6

細辛 Asiasari Radix 6

黃芩 Scutellariae Radix 6

白芷 Angelicae Dahuricae Radix 6

麻黃 Ephedrae Herba 4

甘草 Glycyrrhizae Radix et Rhizoma 4

生薑 Zingiberis Rhizoma Recens 4

蔥白 Allii Fistulosi Bulbus 4

Total amount 108

2. GC/MS

청연산 추출물의 염증조절 성분의 분석을 위한 GC/MS로 6890N GC/ 5975i MS (Agilent, USA)를 사용 하였다. GC/MS 분석을 위한 컬럼은 DB-5MS UI (30 m, 0.25 mm, 0.25 mm)를 사용하였다. 오븐 온도는 처 음 80 ℃에서 2분을 유지한 후 1분당 10 ℃씩 올려 300

℃까지 올리고 5분 동안 머물게 하였다. 시료 2 μL를 분할 주입법으로 주입하였으며, 유속은 1.0 mL/min으

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로 설정하였다. 시료 주입구, 연결부분, 이온 원의 온도 는 각각 280 ℃, 230 ℃ 및 150 ℃로 맞추었다. 질량분 석범위 50∼800 m/z를 가지는 이온들을 scan monitor- ing (순차적으로 반복 검출하는 방법)으로 분석하였다.

분석은 RT (retention time)에 대하여 library 검색을 하 였고, Wiley 7 library을 기준으로 하였다.

3. 실험동물

대한실험동물센터에서 태령 6주된 Balb/c계 수컷 생 쥐를 분양 받은 후, 무균사육장치내에서 2주 동안 적응 시킨 뒤 체중이 20 g이 된 생쥐를 선별하였다. Ctrl (정 상군), ARE (알러지성 비염 유발군), CRT (알러지성 비 염 유발 후 청연산 추출물 투여군)으로 나누고 각 군에 각 10마리씩 배정하였다.

알러지성 비염 유발을 위한 항원으로 ovalbumin (OVA:

chicken egg albumine, grade V, Sigma)를 사용하였다.

OVA 25 ㎍ : 수산화알루미늄겔 (Al(OH)3 gel) 1 ㎎ : 인산완충용액 (phosphate buffered saline, PBS) 300 ㎕로 구성된 0.1% OVA용액을 알러지성 비염 유발 시작 21, 14, 7일 전에 복강주사하여 감작시켰다. 최종 감작 일 주일 경과 후 5일 동안 OVA 100 ㎍ : PBS 20 ㎕로 구성된 OVA용액을 생쥐 비강에 점적하여 알러지성 비 염을 1차 유발하였다. 7일 경과 후 1차와 동일한 방법

으로 2차 유발을 진행하였으며, 콧물과 코 긁기 행동으 로 유발을 확인하였다 (Fig. 1).

본 연구과정은 부산대학교 IACUC 승인을 받아 시 행되었으며 (IACUC number: PNU 2016-1187), 실험실 동물의 관리와 사용은 NIH 가이드라인에 맞추어 시행 되었다.

4. 조직화학

각 군을 sodium pentobarbital 용액으로 마취한 후 10% 중성 포르말린용액 (neutral buffered formalin, NBF), vascular rinse으로 심장관류고정을 하였다. 머리 를 분리한 후 비강 주변 구조물을 제거하고 10% NBF 에 24시간 동안 실온에서 고정하였다. 12시간 동안 탈 회액 (decalcification solution, BBC, UK)에 처리하여 세 척한 후, 파라핀에 포매하여 5 ㎛ 두께의 연속절편을 만들었다. 연속절편에서 점막손상 변화는 Masson trichrome 염색을 통해 조사되었다. 1시간 동안 50-60 ℃ Bouin 용액에서 매염 처리한 후 picric acid를 70% 에탄 올에서 제거하였다. 10분 동안 Weigert iron hematox- ylin에 반응시켜 핵을 염색하고, 15분 동안 phosphomo- lybdic-phosphotungstic acid와 Biebrich scalet-acid fuch- sin에서, 5분간 Aniline blue에서 처리 후 관찰하였다.

Mice were sensitized on days 0, 7, and 14 by intraperitoneal injection of ovalbumin (OVA) emulsified in alum hydroxide (Alum) (OVA 25 ㎍ : Alum 1 ㎎ : PBS 300 ㎕). On days 22 through 26 after initial sensitization, the mice were challenged with OVA (OVA 100 ㎍ : PBS 20 ㎕) intranasally. On days 34 through 38 after initial sensitization, the mice were challenged with OVA (OVA 100 ㎍ : PBS 20 ㎕) intranasally. CRS was orally administered on days 22 through 40.

Abbreviation. CRS: Cheongyeonsan, PBS: Phosphate-buffered saline.

Fig. 1. Protocol for allergen sensitization and challenge

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5. 면역조직화학

코점막내 염증 변화를 조사하기 위해 조직을 5분 동 안 proteinase K (20 ㎍/㎖)에서 proteolysis 과정을 거친 후 실온에서 blocking serum인 10% normal goat serum 에 4시간 동안 반응시켰다. 1차 항체인 mouse anti-matrix metallopeptidase (MMP)-9 (1:100, Santa Cruz Biotec, USA), mouse anti-substance P (1:100, Santa Cruz Biotec, USA), mouse anti-tumor necrosis factor (TNF)-α (1:50, Santa Cruz Biotec, USA), mouse anti-nuclear factor (NF)- κB p65 (1:500, Santa Cruz Biotec, USA), mouse anti-in- ducible nitric oxide synthase (iNOS) (1:250, Santa Cruz Biotec, USA), mouse anti-cyclooxygenase (COX)-2 (1:100, Santa Cruz Biotec, USA) 그리고 mouse anti-nuclear factor (erythroid-derived 2)-like 2 (Nrf2) (1:100, Santa Cruz Biotec, USA)에 72시간 동안 4 ℃ humidified chamber에서 반응시켰다. 그 후 실온에서 24시간 동안 2차 항체인 biotinylated goat anti-mouse IgG1 (1:100, Santa Cruz Biotec, USA)에 반응하였고, 이후 1시간 동 안 실온에서 avidin biotin complex kit (Vector Lab, USA) 를 사용하여 반응시켰다. 0.01% HCl과 0.05% 3,3'-dia- minobenzidine (DAB)이 포함된 0.05 M tris-HCl 완충용 액 (pH 7.4)에서 발색시킨 후, hematoxylin으로 대조염 색을 하였다.

6. TUNEL assay

코점막내 apoptosis 변화를 관찰하기 위해 in situ apoptosis detection kit (Apoptag, Intergen, USA)로 TUNEL을 실시하였다. 먼저 5분간 조직 절편을 proteinase K에 proteolysis 시킨 후 20초간 equilibration buffer 에서 처리하였다. 이후 strength TdT enzyme (36 ㎕ TdT enzyme : 72 ㎕ reaction buffer)을 처리하고 1시간 동안 37 ℃의 humidified chamber에서 반응시킨 후 10 분 동안 strength stop/wash buffer에서 처리하였다. 1시 간 동안 Anti-digoxigenin-peroxidase에 반응시킨 이후 DAB를 처리하였다. Methyl green으로 대조염색 후 광 학현미경으로 관찰하였다.

7. 영상처리

면역조직화학과 TUNEL assay의 결과는 image Pro Plus (Media cybernetics, USA)를 이용하여 영상분석을 했 고 이를 수치화 (means ± standard error)했다. 각 군의 표 본에서 임의로 선정된 점막을 x400 배율에서 촬영한 후 positive pixels/20,000,000 pixels로 영상을 분석하였다.

8. 통계

SPSS software (SPSS 23, SPSS Inc., USA)로 이루어졌 고, one-way ANOVA를 시행하여 유의성 (P<0.05) 검증 후, LSD (Least significant difference)로 사후 검증하였다.

Arrow, peak of Undecanoic acid (RT 11.659 / Area 1.22%) Fig. 2. The GC/MS of component in Cheongyeonsan

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Ⅲ. Results

1. 청연산 추출물의 GC/MS

염증억제능이 있는 Undecanoic acid (RT 11.659 / Area 1.22%)을 확인하였다.

2. 호흡상피 손상 완화

Masson trichrome 염색 결과, 알러지성 비염 유발 후 아래코선반에서 호흡상피의 손상이 증가하였다. CRT

는 ARE에 비해 손상된 호흡상피가 적었다 (Fig. 3).

3. MMP-9의 변화

ARE에서 MMP-9 양성반응은 주로 세포질에서 강하 게 나타났다. ARE에 비해 CRT은 58%의 유의성 있는 감소를 보였다 (Fig. 4).

4. Substance P 반응 변화

ARE에서 Substance P 양성반응은 주로 세포질에서 강하게 나타났다. ARE에 비해 CRT은 61%의 유의성

Abbreviation. Ctrl: no treated mouse, ARE: Allergic rhinitis elicited mouse, CRT: CRS treated mouse after allergic rhinitis colitis elicitation, NC: Nasal cavity, RE: Respiratory epithelium, SM: Submucosa. Bar size, 100 ㎛.

Fig. 3. The repair of AR induced respiratory epithelial damages (arrow) by CRS (Masson trichrome stain)

Arrow, MMP-9 positive reaction; *, P<0.05 compared with ARE. Abbreviations same as Fig. 3.

Fig. 4. The alleviation of edema by CRS (MMP-9 immunohistochemistry)

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있는 감소를 보였다 (Fig. 5).

5. TNF-α, NF-κB p65 반응 변화

ARE에서 TNF-α 양성반응은 주로 세포질에서 강

하게 나타났다. ARE에 비해 CRT은 55%의 유의성 있 는 감소를 보였다. ARE에서 NF-κB p65 양성반응은 주 로 핵 주변에서 강하게 나타났다. ARE에 비해 CRT은 38%의 유의성 있는 감소를 보였다 (Fig. 6).

Arrow, Substance P positive reaction; *, P<0.05 compared with ARE. Abbreviations same as Fig. 3.

Fig. 5. The alleviation of itching by CRS (Substance P immunohistochemistry)

Arrow, TNF-α, NF-κB p65 positive reaction; *, P<0.05 compared with ARE. Abbreviations same as Fig. 3.

Fig. 6. The down-regulation of pre-inflammation cytokine by CRS (TNF-α& NF-κB p65 immunohistochemistry)

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Arrow, iNOS, COX-2 positive reaction; *, P<0.05 compared with ARE. Abbreviations same as Fig. 3.

Fig. 7. The decrease of inflammation cytokine by CRS (iNOS & COX-2 immunohistochemistry)

Arrow, Nrf2, TUNEL positive reaction; *, P<0.05 compared with ARE. Abbreviations same as Fig. 3.

Fig. 8. The anti-inflammation effect of CRS (Nrf2 immunohistochemistry & TUNEL assay)

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6. iNOS, COX-2 반응 변화

ARE에서 iNOS 양성반응은 주로 세포질에서 강하 게 나타났다. ARE에 비해 CRT은 54%의 유의성 있는 감소를 보였다. ARE에서 COX-2 양성반응은 주로 세 포질에서 강하게 나타났다. ARE에 비해 CRT은 53%

의 유의성 있는 감소를 보였다 (Fig. 7).

7. Nrf2 반응 변화

ARE에서 Nrf2 양성반응은 주로 핵과 주변 세포질 에서 강한 양성반응을 보였다. ARE에 비해 CRT은 87%의 유의성 있는 증가를 보였다. Apoptotic cell의 핵 에서 나타나는 강한 양성반응은 ARE에 비해 CRT은 84%의 유의성 있는 증가를 보였다 (Fig. 8).

Ⅳ. Discussion

국민건강보험공단 발표에 따르면 2015년 알러지성 비염으로 진료 받은 환자는 634만 명에 이르며, 그 중 12세 이하 아동, 청소년의 진료인원은 30%에 해당하 는 190만 명이다. 이는 2010년 555만 명에서 5년 동안 14.1%가 증가한 것으로, 주요 알레르기 질환인 천식과 아토피 피부염이 각각 25%, 11% 감소한 것과 대조적 이다.

알러지성 비염의 한방치료에 대한 최근 연구에 따 르면, 한방병원에서 알러지성 비염 치료 시 침 치료가 72%에 해당하고, 한약 치료 중에서 탕약은 32.8%, 비 보험 한약제제는 25.4%, 보험급여 한약제제는 4.2%의 비율을 차지하고 있다^4,12). 또한 건강보험 처방으로 小靑龍湯, 補中益氣湯, 荊芥蓮翹湯, 蓮翹敗毒散이 주로 처방되었고, 이 중 荊芥蓮翹湯이 가장 많았다. 비보험 제제는 清咽利膈湯, 通竅湯, 麗澤通氣湯, 苓甘薑味辛夏仁湯, 六味地黃湯, 麥門冬湯, 麻黃附子細辛湯, 葛根湯이 처방되었으며, 清咽利膈湯이 가장 많이 처방되었 다^13,14).

청연산은 荊芥蓮翹湯의 변방이며, 荊芥蓮翹湯에서 當歸, 白芍藥, 柴胡, 枳殼, 梔子, 桔梗을 빼고, 升麻, 蒼朮, 羌活, 藁本, 薄荷, 細辛, 麻黃, 生薑, 蔥白을 추가한 처방이다. 이 중 連翹와 荊芥는 알러지성 비염 완화효 과가 확인된 荊芥蓮翹湯과 防風通聖散에서도 공통적 으로 처방되는 약재이며, 연구결과 각 약재의 항염증

매개물질 조절 능력이 확인되었다^15,16). 이를 통해 볼 때, 連翹와 荊芥가 청연산의 항염증작용에 핵심적인 역할을 하는 것으로 생각된다.

알러지성 비염은 상기도에 알러지가 유입되어 비강 점막이 지속적으로 면역반응 및 염증반응을 일으키는 것이다. 비강 점막의 조직손상정도는 이러한 반응들에 비례하여 나타난다. 알러지성 비염의 치료는 과도한 면역반응과 염증반응을 억제시키는 것으로 비강 점막 조직의 손상정도로 효과를 확인할 수 있다¹⁷⁾. 이에 본 연구는 Balb/c 생쥐 비강 점막에 인위적으로 알러지성 비염을 유발한 후, 청연산 추출물의 비염 완화 효과를 살펴보기 위하여 청연산 추출물의 염증조절 성분을 분 석하였다. GC/MS를 실시한 결과 염증억제능이 있는 Undecanoic acid를 확인하였다 (Fig. 2). Undecanoic acid 는 화학식 CH3(CH2)9COOH를 가진 자연 발생적인 카 르복시산으로 백선이나 무좀 치료에 항진균제로 자주 사용되며, 미국에서는 특허 받은 국소적 항염증제 (특 허발행번호: US 4343798 A)의 성분 중 하나로 알려져 있다. GC/MS 실시 결과 청연산 추출물에서 이 성분이 존재한다는 것은 청연산 추출물의 항염증효과에 대한 충분한 가능성을 제시한다.

실제로 코점막조직표본을 Masson trichrome 염색을 통해 확인한 결과, CRT군의 아래코선반의 호흡상피 손상이 ARE에 비해 적은 것을 확인하였다 (Fig. 3). 이 에 저자들은 항염증기전과 관련된 매개물질들에 대한 변화를 조사하였다.

IgE는 the surface high affinity receptors for IgE (Fcε RI)와 결합하여 비만세포의 활성화를 유도한다¹⁸⁾. 이로 인해 활성화된 비만세포에서는 MMP-9와 substance P 등을 분비해 염증반응을 일으키게 된다^19,20). 분비된 MMP-9는 type IV collagen과 fibronectin, elastin, lam- inin을 선택적으로 분해하여 세포외기질 분해와 기저 막의 파괴에 핵심적인 역할을 하며²¹⁾ 이로 인해 부종을 일으키는 것으로 알려져 있다²²⁾. MMP-9의 양성반응을 관찰한 결과 ARE군에 비해 CRT군에서 58%의 유의성 있는 감소가 보였다 (Fig. 4). 이러한 결과로 볼 때, 청연 산 추출물은 MMP-9의 분비를 억제시키는 것으로 보 인다. 억제된 MMP-9로 인해 기저막의 파괴를 감소시 키고, 염증관련세포의 이주가 조절되어 진피내 부종을 경감시킨다²³⁾. 청연산 추출물의 MMP-9 분비 억제가 비만세포에서 분비된 cytokine으로 인한 알러지성 비염 증세를 완화시키는 것으로 생각된다.

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Substance P는 감각신경원 말초신경종말에서 분비 되며, 비만세포를 활성화시켜 여러 활성매개물질을 유 리시킨다. 이러한 작용으로 피하조직내로 백혈구 침윤 이 일어나고, 혈관내피세포에 작용하여 혈관확장, 발 진 및 가려움이 유발된다²⁴⁾. Substance P의 양성반응을 관찰한 결과 CRT군이 ARE군에 비해 유의성 있게 감 소하였다 (Fig. 5). 청연산 추출물이 Substance P 분비를 억제시킴으로써 비만세포의 활성을 저하시켜 탈과립 을 억제하는 것으로 보인다. 또한 비만세포에서 분비 되는 cytokine의 감소를 통해 소양증을 감소시키는 것 으로 생각된다.

Lipopolysaccharide (LPS), H2O2와 같은 자극은, 세포 에서 TNF, interleukin-1 (IL-1), interleukin-6 (IL-6) 같은 염증성 cytokine을 분비시킨다. 그로 인해 TNF-α 같은 염증 매개 물질과 NF-kB p65 같은 전사인자가 활성화 된다. 활성화된 NF-kB p65는 COX-2를 활성화시켜 염 증반응을 증가시킨다. 또한 NF-kB p65는 iNOS의 발현 과도 관련되어 NO를 생성하여 신경세포의 산화적 손 상을 유발한다²⁵⁾. 이러한 기전을 고려할 때, CRT군이 ARE군에 비해 TNF-α, NF-kB p65 양성반응이 감소하 였다 (Fig. 6)는 것은 청연산 추출물이 TNF-α, NF-kB p65와 같은 전염증효소의 활성화를 감소시키고, NF-kB p65의 신호에 의해 활성화 되는 iNOS의 발현과 COX-2 의 활성을 억제시킴으로써 (Fig. 7) 이에 의해 매개되는 알러지성 염증반응을 감소시키는 것으로 생각된다.

청연산 추출물의 항염증효과를 알아보기 위해 Nrf2 의 양성반응을 살펴본 결과, CRT군에서 ARE군에 비 해 유의성 있는 증가를 확인할 수 있었다 (Fig. 8). Nrf2 는 항산화 유전자를 발현하는 대표적인 전사인자로서 산화적 스트레스로부터 다양한 항산화 효소 (주로 Phase II enzyme)를 유도하여 세포 및 조직을 보호한다. 평소 Nrf2는 Kelch-like ECH-associated protein-1 (Keap1)과 결합하여 세포질에 불활성형으로 존재한다²⁶⁾. 그러나 산화적 스트레스를 받게 되면 Keap1으로부터 분리되 어 핵 안으로 이동한 뒤 항산화응답요소 (antioxidant response element)와 결합을 하여 Phase II enzyme의 발 현을 유도한다²⁷⁾. Nrf2 양성반응의 증가는 청연산 추출 물이 항산화 유전자를 발현시킴으로써 과도한 산화적 스트레스를 조절하는 역할을 하는 것으로 생각되며, 항산화 유전자의 발현이 Phase II enzyme을 유도하여 알러지성 비염으로 인한 세포손상으로부터 코점막 세 포를 보호하는 것으로 생각된다.

또한 apoptosis의 조절을 관찰하기 위한 TUNEL assay 결과, apoptotic cell의 핵에서 나타나는 강한 양성반 응이 CRT군에서 ARE군에 비해 유의성 있는 증가를 보였다 (Fig. 8). 이는 청연산 추출물이 염증 조절기전 에 작용하여 과도한 염증반응을 일으키는 세포를 사멸 하도록 조절하여, 염증반응에 의해 손상된 피부가 감 소되는 것이라 생각된다²⁸⁾.

이러한 결과들을 종합해 볼 때, 청연산 추출물은 알 러지성 비염으로 인한 비강 점막 손상을 완화시키며 항염증효과도 있음을 확인하였다. 그러나 청연산 추출 물이 알러지성 비염의 발병 기전 중 어느 단계에 어떻 게 작용하는지에 대해서는 구체적인 확인이 필요하다.

또한 쥐를 이용한 동물 실험이기에 인간의 알러지성 비염 유발에 영향을 주는 유전적 요인은 고려되지 않 았다. 향후 치료기전에 대한 추가적인 연구와 임상연 구가 필요하다고 생각된다.

Ⅴ. Conclusion

알러지성 비염에 대한 청연산 추출물의 항염증효과 를 관찰하기 위한 본 연구에서 Balb/c계 수컷 생쥐 비강 점막에 OVA 항원을 자극하여 인위적인 알러지성 비염 을 유발시킨 뒤, 청연산 추출물을 투여하였다. 확인 결 과 비강 코점막 상피세포 손상, 부종, 소양감이 감소하 였고 TNF-α 생성 감소, NF-κB p65 활성 억제, iNOS와 COX-2 생성 감소를 통하여 항염증효과를 보였다. 항 염증작용의 원인으로 작용할 수 있는 Nrf2의 항산화와 apoptosis 증가가 유의하게 관찰되었다. 이상의 결과로 청연산은 알러지성 비염으로 인한 코점막 손상을 치료 할 수 있을 것으로 기대된다.

Acknowledgement

이 연구는 부산대학교 기본연구지원사업 (2년)에 의 하여 연구되었다.

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