HPLC-PDA와 LC-MS를 이용한 식음료 중 Dimethyl Dicarbonate 분석법 개발 및 유효성 검증
신재욱․김정복 한국식품과학연구원
Determination of Dimethyl Dicarbonate in Food and Beverage with HPLC-PDA and LC-MS
Jae Wook Shin and Jung Bok Kim Korea Advanced Food Research Institute
ABSTRACT A sensitive and simple analytical method to identify derivatives of dimethyl dicarbonate (DMDC) resi- dues in fruit beverage and wine was developed and then validated using HPLC-PDA. The calibration curve was obtained from 1 µg/mL to 200 µg/mL with a satisfactory correlation coefficient of 0.999. The limit of detection and limit of quantitation for a derivative of DMDC were 0.30 µg/mL and 0.92 µg/mL, respectively. The recoveries of derivatives of DMDC from spiked samples at levels of 10∼200.0 µg/mL ranged from 92.8 to 101.0% with the relative standard deviation between 0.9 and 1.9%. The measurement of uncertainty of the developed HPLC method for identifying derivatives of DMDC was based on the analytical process and quantification. These results show that the method developed in this study is appropriate for DMDC identification and it can be used to maintain the safety of food products that contain DMDC residues.
Key words: derivative dimethyl dicarbonate, DMDC, method validation, HPLC-PDA, LC-MS
Received 7 June 2019; Accepted 7 August 2019
Corresponding author: Jung Bok Kim, Korea Advanced Food Re- search Institute, Uiwang, Gyeonggi 16001, Korea
E-mail: [email protected], Phone: +82-2-3470-8276
서 론
식품첨가물은 그 사용 목적이 명확한 물질로서 품목별 사 용기준에 따라 사용해야 하며, 식품 가공 및 제조뿐 아니라 모든 식품에서 사용되고 있다. 식품첨가물은 용도와 사용 목적에 따라 식품첨가물공전에 명시되어있다. 본 연구에서 는 다양한 문헌과 정보검색 방법을 이용하여 국가마다 상이 한 식품첨가물의 종류, 지정현황 및 사용기준을 조사하였고, 이러한 상황들이 국제무역뿐 아니라 기준 규격 관리에도 여 문제를 야기할 수 있다. 특히 식품첨가물 중 미생물의 증식 에 의한 부패나 변질방지 및 저장 기간을 늘리기 위해 사용 되는 보존료의 경우 그 종류와 기능들이 확대되고 있다. 특 히 국내 미설정 보존료 중 하나인 dimethyl dicarbonate (DMDC)의 경우 정량분석법 부재로 인해 국내 유통 식품에 대한 관리뿐 아니라 기준규격 설정에 많은 어려움을 겪고 있다. 일반적으로 와인의 경우 화학적, 물리적 및 온도처리 를 통해 와인의 미생물학적 안전성은 필요하다고 보고되었 다(Loureiro와 Malfeito-Ferreira, 2003). 기존에 사용되 던 화학적 보존료인 sulphur dioxide는 최근 들어 와인에서
잘 사용하지 않고 그 사용양도 점차 줄어들고 있다고 보고되 었다(Costa 등, 2008). 미국과 호주의 경우 음료에서 DMDC 를 소독제나 보존료로 사용되는 것이 허가돼 있다. 물에 용 해도가 높은 DMDC는 매우 적은 양의 메탄올과 이산화탄소 로 빠르게 가수분해 되며, 채소 등에 자연적으로 존재하는 성분으로 인체에 무해하다고 보고되었다(Stafford와 Ough, 1976). DMDC는 여러 효모와 박테리아에 대해 보존 효과가 있다고 평가되었으며, 초기 세포농도, 온도 및 pH 등 여러 요소의 존재에 따라 효과가 평가되었다(Porter와 Ough, 1982; Daudt와 Ough, 1980; Ough와 Langbehn, 1978;
Threlfall과 Morris, 2002).
실제로 미국, 호주 및 유럽에서 DMDC의 경우 와인 이외 에도 탄산과 비탄산 주스류뿐 아니라 스포츠 이온음료에서 도 소독제로 널리 사용되고 있다(Basaran-Akgul 등, 2009).
음료에 보존료로 사용된 DMDC의 사용기준은 미국과 호주 에서 최대허용량이 200 mg/kg으로 설정되어 있으며(Code of Federal Regulations, 2006), 유럽의 경우도 최대허용량 이 200 mg/L로 설정되어 있다(Commission Regulation, 2006). 또한 음료와 와인에 사용된 DMDC와 관련하여 많은 연구가 되고 있다(Chen 등, 2013). 하지만 우리나라의 경우 식품첨가물공전상 보존료 품목에 DMDC 항목도 없을 뿐만 아니라 국내외적으로 DMDC 분석법 부재로 인해 사용 식품 유형에 대한 규제 및 관리를 할 수 없는 실정이다. 보고된
Table 1. Instrumental conditions of dimethyl dicarbonate with HPLC-PDA
Column Detector Mobile phase Flow rate Injection volume Column temp.
Capcellpak UG 120 C18
(4.6 mm×150 mm, 5 μm) PDA (254 nm, scan 200∼600 nm) A: 0.5% formic acid in DW, B: 95% acetonitrile (A : B＝60:40, v/v) 1.0 mL/min
10 μL 40°C
Table 2. Instrumental conditions of dimethyl dicarbonate with LC-MS
Column Detector Mobile phase Flow rate Injection volume Column temp.
Capcellpak UG 120 C18
(2.0 mm×150 mm, 3 μm) m/z=166 (SIM mode, positive) A: 0.5% formic acid in DW,
B: 95% acetonitrile (A : B＝60:40, v/v) 0.2 mL/min
10 μL 40°C DMDC의 분석법으로는 GC를 이용한 분석 방법들이 보고되
어 있다(Stafford와 Ough, 1976; Peterson과 Ough, 1979;
Zhou 등, 2012). 현재까지 보고된 DMDC 분석법은 Zhou 등 (2012)이 보고한 On column을 이용한 GC-FID 분석 방법 이 유일한 기기분석이지만 이 방법의 경우 현재 잘 사용하지 않는 오래된 분석 방법이다. 또한 HPLC를 이용한 분석 방법 은 현재까지 보고된 사례가 없다. 또한 DMDC의 낮은 열 안정성 때문에 Mass 주입 시 고온으로 사용하는 Interface 의 온도 때문에 GC-MS 장비를 이용한 분석법 확립이 불가 능하다. DMDC의 여러 물리화학적 특징으로 인하여 정성 및 정량분석 확립이 어려운 실정이다. 더욱이 기존의 분석 방법들은 유효성 검증 또한 부족하여 정량분석 결과를 도출 하기에 부적합하다.
따라서 본 연구에서는 benzyl amine을 이용한 유도체 방 법과 보편화한 분석 장비인 HPLC-PDA와 LC-MS를 이용 한 분석법을 확립하였다. 확립된 분석법에 대한 유효성 검증 을 실시하였고, 특히 실험실 간 교차검증을 실시하여 현장에 서도 즉시 사용 가능한 시험법을 확립하였다. 시료 전처리의 안정성이 확보된 분석법을 적용하여 국내유통 식품뿐만 아 니라 수입식품에 대해서 확립된 분석법을 적용하여 정량분 석을 실시하였다.
재료 및 방법
시약 및 재료
시료의 분석을 위하여 사용한 DMDC(BOC SCIENCES, New York, NY, USA)는 순도 99.0%인 표준품을 구매하여 사용하였다. 유도체 시약인 benzyl amine(Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA)은 순도 99.0% 시약을 구입하여 사용하였다. HPLC에 이동상과 시료 전처리 용매인 formic acid, 아세토니트릴 등은 HPLC grade(J.T Baker, Phill- ipsburg, NJ, USA) 제품을 사용하였다. 그 외 시험에 사용된 일반 시약들은 특급시약 및 HPLC 등급을 사용하였다.
확립된 DMDC의 분석법 확립의 적용성 검토를 위해 서 울･경기 대형마트와 미국 현지에서 총 107건의 시료를 수집 하였다. 특히 DMDC가 보존료로 허용된 미국 현지에서 33 건의 시료를 구입하였고, 서울･경기 대형마트 및 중소형 식 품 도매점에서 74건을 수집하였는데 이 중 20건은 고체 시 료를 구입하였다. Matrix 선정은 국외에서 허용된 시료로써 이온음료, 과일탄산음료, white and red wine을 대상으로 분석법 검증을 실시하였다.
시료 전처리 방법
시료 전처리는 시료 2 g을 아세토니트릴 10 mL를 이용해 추출한 후 centrifuge를 이용해 원심 분리 후 상등액 500 μL에 아세토니트릴에 녹아 있는 1% formic acid 250 μL와 아세토니트릴에 녹인 1,000 μg/mL benzyl amine 250 μL 를 넣고, water bath를 이용해 60°C에 30분간 반응시켰다.
이 용액을 0.45 μm로 membrane filter 후 HPLC에 주입하 여 분석하였다.
기기분석 조건
DMDC 표준품 0.1 g을 정밀히 달아 아세토니트릴에 녹인 용액(100 mL)을 표준원액을 제조하였고, 표준원액을 이용 하여 1∼200 mg/L 농도가 되도록 희석한 용액을 검량선 표준용액으로 하였다. HPLC-PDA 분석 조건은 분석용 컬 럼이 Capcell pak UG 120 C18(4.6×150 mm, 5 μm), 이동 상인 solvent A는 증류수에 녹인 0.5% formic acid, sol- vent B는 95% 아세토니트릴 용액을 이용하였고(A : B＝
60:40), UV 흡수 파장은 254 nm, oven 온도는 40°C, 유속 은 1.0 mL/min으로 분석하였다(Table 1).
LC-MS 분석 조건은 분석용 컬럼이 Capcell pak UG 120 C18(2.0×150 mm, 3 μm), 이동상 solvent A는 0.5% for- mic acid, solvent B는 95% 아세토니트릴 용액을 이용하였 고(A : B＝60:40, v/v), m/z=166(SIM mode, positive), oven 온도는 40°C, 유속은 0.2 mL/min으로 분석하였다 (Table 2).
분석법 검증
본 연구에서 분석법 확립을 위해 국외에서 사용기준이 설 정된 식품 유형 4가지인 이온음료, 과일탄산음료, white wine 및 red wine을 blank로 선정하였다. 이 중 가장 복잡 한 matrix effect를 가진 red wine을 선정하여 유효성 검증 을 실시하였다. 분석법 검증 항목으로는 분석물질과 matrix 의 방해와 간섭을 확인하기 위해 선택성과 특이성을 확인하 였다. 1~200 μg/mL의 직선 범위에서의 직선성을 확인하였 고, 검량선 내 서로 다른 농도 3가지를 선택하여 이 농도들의
Fig. 1. Scheme of DMDC derivatization.
A B
C D
Fig. 2. Chromatogram of DMDC derivatization obtained using HPLC-PDA. A, Chromatogram of DMDC standard (100 μg/mL);
B, Chromatogram of spiked standard in sample (red wine); C, Spectrum of DMDC before derivatization; D, Spectrum of DMDC after derivatization.
inter, intra-day의 정밀성, 정확도 및 회수율을 확인하였 다. DMDC의 물리화학적 특성으로 인해 발생할 수 있는 액 체 시료의 문제점들을 극복하기 위해 추가적으로 고체 공시 료를 가지고 회수율을 측정하였다. 또한 분석법 검증의 항목 중 하나인 측정 불확도 산출을 위해 불확도 요인을 선정하였 다. 불확도 요인은 총 6가지로 표준품의 순도, 표준품의 제 조, 검량선 3가지 농도, 검량선(회귀분석), 시료의 반복 측정 등으로 불확도 요인을 설정하여 각각의 표준 불확도를 산출 하여 합성하여 측정 불확도를 산출하는 방법을 이용하여 식 품 중 DMDC의 함량분석의 유효성과 신뢰성을 확보하였다.
결과 및 고찰
시료 전처리 및 분석법 확립
HPLC-PDA를 이용한 분석의 경우 DMDC 10 μg/mL 농 도가 검출되지만, 시료 중 물과 에탄올에 DMDC가 반응하여 메탄올과 ethyl methyl carbonate가 생성되어 DMDC가 감 소하므로 미량분석에는 부적합하다. 또한 시료에 첨가된
DMDC의 stability가 1시간이 지나면 현저하게 떨어져 안정 성 확보와 유효성 검증이 어렵고, blank 시료의 matrix 간섭 으로 인해 DMDC 피크 구분이 어려워 정량분석법으로 적당 하지 않다고 판단되었다.
DMDC의 분석을 위해 benzyl amine을 이용한 유도체화 방법을 선택하였고, 이 방법의 최적 조건 확립을 위해 ben- zyl amine의 농도별, formic acid의 농도별, 반응 시간별, 반응 온도를 이용하여 유도체화 최적 조건을 확인하였다.
실험 결과 가장 좋은 조건과 비교적 손쉽게 처리할 수 있는 반응 조건을 선택하였다. 그 결과 유도체 시약인 benzyl amine의 농도는 1,000 μg/mL, formic acid 농도는 1%, 반 응 시간은 15분, 반응 온도는 40°C를 선정하였다. DMDC를 benzyl amine을 이용해 반응하여 n-benzyl methyl car- bamate로 유도체한 후 HPLC-PDA로 분석하였다(Fig. 1).
DMDC의 stability가 12시간까지 안정성을 확보하였다.
Blank와 matrix effect가 없는 것을 확인하였고, HPLC- PDA와 LC-MS를 이용한 추가 정성확인 분석법을 개발하였 으며 유효성 검증 또한 실시하였다(Fig. 2, 3).
특이성 확인
특이성이란 분석대상 물질을 불순물, 분해물, 배합성분 등으로부터 선택적으로 정확하게 분석할 수 있는 항목으로 서, 특이성 확인 시험을 위해 대상 시료 이온음료, 과일탄산 음료, white wine 및 red wine 중에서 matrix가 가장 복잡 한 red wine을 선정하여 제시된 시료 전처리 과정을 적용한
A
B
Fig. 3. Chromatogram and spectrum of DMDC derivatization with LC-MS. A, TIC of DMDC standard with LC-MS (m/z=166, SIM); B, Fragment of spiked DMDC standard (red wine).
Table 3. Linearity result of dimethyl dicarbonate in red wine
Conc. (μg/mL, n=3)
1 5 10 50 100 200 R2 Slope
1 day 2 day 3 day Mean Precision (%) Accuracy (%)
1.15 1.17 1.18
1.2 1.3 116.7
6.04 5.5 5.00
5.5 9.4 110.3
10.26 9.64 9.62 9.8 3.7 98.4
48.75 50.20 50.18
49.7 1.7 99.4
95.62 97.85 98.72 97.4 1.6 97.4
202.45 201.0 200.61 201.4 0.5 100.7
0.9990 0.9998 0.9999 0.9996
2546.4 2442.1 2444.1 2495.3
Table 4. Result of accuracy and precision in intra and inter-day Parameter Conc. (μg/mL, n=3)
5 10 100
Intra day
Mean Precision (%) Accuracy (%)
5.9 8.6 118.4
10.0 6.3 99.8
96.3 1.9 96.3 Inter
day
Mean Precision (%) Accuracy (%)
5.2 2.9 104.7
9.8 4.6 97.6
98.1 1.2 98.1 용액을 시험 용액으로 사용하였다. HPLC를 이용하여 머무름
시간과 PDA spectrum을 비교하여 분석물질과 간섭이 없는 것을 확인하는 방법으로 선택성과 특이성을 확보하였다.
직선성
확립된 시료 전처리법으로 DMDC가 검출되지 않은 ma- trix를 이용해 DMDC가 1~200 ppm의 농도가 되도록 첨가 하고 확립된 유도체 시료 전처리법을 적용해 전처리한 후 HPLC-PDA를 이용해 3회 반복 분석하였다. 그 결과 R2= 0.999 이상의 좋은 직선성을 나타냈으며, 정밀도는 0.5~
9.4%로 확인되었고 정확도는 97.4~116.7%로 좋은 결과를 확인하였다(Table 3).
일내, 일간 정밀도 및 정확도
검량선 내 서로 다른 농도 3가지로 5, 10, 100 μg/mL의 농도를 이용해 앞에서 제시한 유도체 전처리 방법을 적용하 여 3회 반복 분석하고 일내, 일간 정밀도와 정확도를 측정하
였다. 일내 측정 결과 5, 10, 100 μg/mL의 농도에 대해 정밀 도는 1.9~8.6%, 정확도는 96.38~118.4%로 확인되었다. 일 간은 5, 10, 100 μg/mL의 농도에 대해 정밀도는 1.2~4.6%, 정확도는 97.6~104.7%로 확인되었다(Table 4).
회수율, 검출한계 및 정량한계
유도체 시료 전처리방법을 이용하여 검량선 내 서로 다른 농도 3가지 10, 50, 100 μg/mL의 농도를 선정하여 특이성
Table 5. Recovery, LOD, and LOQ of DMDC form red wine spiked at three different concentrations (n=3) Matrix Conc.
(μg/mL) Mean
(μg/mL, n=3) RSD
(%) Recovery
(%) LOD
(μg/mL) LOQ (μg/mL) Red wine
10 50 100
9.0 50.7 97.2
0.9 0.9 1.9
92.8 101.0 99.3
0.30 0.92
Table 6. Expanded uncertainty of DMDC level using HPLC-PDA and 25.25 mg/kg in red wine
Parameters of uncertainty Result Unit
Certified concentration The result of uncertainty Expanded uncertainty (U) Coverage factor (k) Degrees of freedom (veff)
Combined standard uncertainty (uc)
Combined relative standard uncertainty (ur/r)
25.25
25.25±0.73 (k=2, 95% confidence level) 0.73
2 16824
0.4 0.014
mg/kg mg/kg mg/kg Dimensionless unit Dimensionless unit
mg/kg Dimensionless unit
이 확보된 matrix에 표준물질을 첨가한 후 회수율을 측정하 였다. 그 결과 10, 50, 100 μg/mL 농도에 대해 정밀도는 1.9% 이하이고, 회수율은 92.8∼101.0%로 측정되었다. 액 체 시료에서 확립된 분석법을 적용하여 고체 시료(시리얼) 에 서로 다른 농도 3가지(10, 50, 100 μg/mL)를 선정하여 회수율을 측정한 결과 92.8~101.0%의 회수율을 확인하였 다. 검출한계는 0.30 μg/mL, 정량한계는 0.92 μg/mL로 측 정되었다(Table 5).
측정 불확도 산출 결과
DMDC의 측정 불확도를 산출하기 위해 설정된 불확도 요인은 총 6가지로 표준품의 순도, 표준품의 제조, 검량선 3가지 농도, 검량선(회귀분석), 시료의 반복 측정 등으로 불 확도 요인을 설정하였다. 설정된 불확도 요인과 자유도를 이용하여 합성 상대표준 불확도, 합성 표준 불확도, 포함인 자 및 시료 측정 결과로 확장 불확도를 산출하였다. 그 결과 측정 불확도는 25.25±0.73 mg/kg(신뢰수준 95%, K=2)으 로 확인되어 낮은 불확도값 산출로 인해 발생할 수 있는 측 정값의 오차율을 줄일 수 있는 결과를 도출하였다(Table 6).
국내외 유통 식품 중 DMDC 함량 조사
확립된 DMDC의 분석법 확립의 적용성 검토를 위해 식품 첨가물로서 허용되어 기준규격이 설정되어 있는 국가에서 시료들을 직접 구입을 하였고, 국내에서는 허용된 국가와 유사한 식품 유형을 선정하였으며, 고체 시료를 이용해 화학 적 변화 없이 비의도적으로 혼합했을 경우를 대비해 국내 유 통 고체 시료인 시리얼을 이용해 회수율 등 유효성 검증항목 을 일부 실시하였다. 시료는 총 107건을 수집하였으며, 미국 현지에서 구입한 시료는 33건, 서울･경기 대형마트 및 중소 형 식품 도매점에서 74건 구입하였는데 이 중 액체 54건, 고 체시료 20건을 수집, 분석한 결과 모든 시료에서 불검출을 확인하였다. 향후 국내 미설정 보존료인 DMDC를 사용한
식품에 대해 정량한계(0.92 μg/mL)까지 분석할 수 있는 분 석법 확립과 국내에 비의도적으로 혼용될 수 있는 수입식품 에 사전사후 관리에 기여될 수 있을 것으로 판단된다.
요 약
본 연구에서는 국내 미설정 보존료인 dimethyl dicar- bonate(DMDC)가 보존료로 사용된 식품 유형들의 기준규 격 설정과 관리를 위해 국내외 다양한 분석법을 조사하고 비교 검토하였다. 다양한 분석법을 적용하여 DMDC의 분석 법을 조사한 결과 GC 장비로는 DMDC의 낮은 휘발성 때문 에 분석이 불가능하였고 유도체화 방법을 사용하지 않고는 HPLC 장비로는 분석이 불가능하였다. 본 연구에서 matrix 특히 white wine과 red wine에서 matrix effect로 인해 정 량분석이 불가능하였다. 이러한 문제를 해결하기 위해 ben- zyl amine을 이용한 유도체 방법을 선택하여 matrix effect 가 없는 정량분석법을 확립하였으며 안정성 또한 12시간을 확보하였다. DMDC의 직선성은 1~200 μg/mL 범위에서 R2=0.999 이상의 좋은 직선성을 나타내었으며, 정밀도는 9.4% 이하, 정확도 97.4~116.7%로 확인하였다. 일내, 일간 정밀도는 1.2~8.6%, 정확도는 96.3~118.4%로 확인되었다.
액체 시료의 회수율은 92.8~101.0%(상대표준편차 1.9%
이하), 고체의 경우 99.4~111.4%로 확인하였다. 검출한계 는 0.30 μg/mL, 정량한계는 0.92 μg/mL로 측정되었다. 측 정 불확도는 25.25±0.73 mg/kg(신뢰수준 95%, K=2)으로 확인되었다. 시료는 총 107건을 수집하였으며, 미국 현지에 서 구입한 시료는 33건, 서울･경기 대형마트 및 중소형 식품 도매점에서 74건인데 이중 액체 54건, 고체시료 20건을 수 집, 분석한 결과 모든 시료에서 불검출을 확인하였다. 본 연 구는 향후 국내 미설정 보존료인 DMDC를 사용한 식품에 대해 정량한계(0.92 μg/mL)까지 분석할 수 있는 분석법 확 립과 국내에 비의도적으로 혼용될 수 있는 수입식품의 사전
사후 관리에 기여할 수 있을 것으로 판단된다.
감사의 글
본 연구는 2015년도 식품의약품안전처의 연구개발비(14162 불량식971)로 수행되었으며 이에 감사드립니다.
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