수산물의 비타민 B
12분석을 위한 Pepsin-Assisted Extraction 및 Immunoaffinity-HPLC/DAD 분석법의 유효성 검증
문금주1․최용민2․천지연1
1순천대학교 식품공학과
2농촌진흥청 국립농업과학원 기능성식품과
Validation of Pepsin-Assisted Extraction and Immunoaffinity-HPLC/DAD Analysis for Vitamin B
12in Seafood
Geumju Mun1, Youngmin Choi2, and Jiyeon Chun1
1Department of Food Science and Technology, Sunchon National University
2Functional Food & Nutrition Division, National Institute of Agricultural Science, RDA
ABSTRACT Vitamin B12 exists in free and bound forms in foods. Use of proteolytic enzymes is recommended for vitamin B12 extraction from protein-rich foods, but information applicable to seafood is very limited. In this study, pepsin-assisted extraction (PE) coupled with immunoaffinity-HPLC/DAD (I/H/D) was validated and applied for determi- nation of total vitamin B12 contents (sum of free and bound) in four types of seafood with different matrices (littleneck clam, blue crab, mackerel, and squid). PE-I/H/D showed good specificity and linearity (R2=0.9992). Limits of detection and quantification of PE-I/H/D were about twice as high (0.015 and 0.106 µg/100 g, respectively) as those of non-PE-I /H/D. Both PE- and non-PE-I/H/D showed good accuracy based on higher than 95% recoveries from the certified reference material, BCR-487. Precision of PE-I/H/D was acceptable based on AOAC guidelines, although it decreased upon application of PE (coefficient variations of repeatability and reproducibility: 9.4 and 13.6% for PE-I/H/D and 6.0 and 10.5% for non-PE-I/H/D, respectively). Free and total vitamin B12 contents of the four types of seafood were analyzed by using the validated PE-I/H/D. The total vitamin B12 contents of littleneck clam (55.16 µg/100 g) and mackerel (5.60 µg/100 g) were significantly higher than corresponding free vitamin B12 contents (46.91 and 4.64 µg/100 g, respectively), indicating that 18∼20% of total vitamin B12 exists in bound form in littleneck crab and mackerel.
On the other hand, there was no significant difference between free and total vitamin B12 contents in blue crab and squid within the ranges of 6.09∼6.87 and 2.39∼2.45 µg/100 g, respectively. The results of this study suggest that PE-I/H/D assay would be effective to release vitamin B12 from protein-rich seafood tissues and to produce acceptable selectivity, sensitivity, accuracy, and precision of vitamin B12 analysis, indicating PE-I/H/D is applicable for the determi- nation of vitamin B12 at low levels in seafood.
Key words: vitamin B12, pepsin-assisted extraction, seafood, method validation
Received 27 November 2017; Accepted 1 December 2017 Corresponding author: Jiyeon Chun, Department of Food Science and Technology, Sunchon National University, Suncheon, Jeonnam 57922, Korea
E-mail: [email protected], Phone: +82-62-750-3208
서 론
비타민 B12는 cyanocobalamin류를 총칭하는 수용성 비 타민으로, 식품 중 hydroxocobalamin, adenosylcobalamin, methylcobalamin 및 cyanocobalamin 등 다양한 형태로 존 재한다. 소나 양 같은 반추동물들은 위 내에 존재하는 박테 리아에 의해 비타민 B12가 생합성될 수 있지만, 인간은 합성 이 되지 않기 때문에 식품이나 보조제를 통한 비타민 B12 섭취 가 필수적이다(1). 성인 기준으로 비타민 B12의 일일 요구량
은 2.4 μg으로 소량이지만, 엽산과 함께 핵산 합성에 관여하 고 조혈 기능을 조절하며 체내에서 N-methyltetera-hy- drofolic acid를 운반하는 데 필수적인 역할을 하므로 결핍 시 엽산 대사가 이루어지지 않아 거대적아구증(megalo- blastic), 치매, 파킨슨병 등의 신경 정신 질환이 발생할 수 있는 것으로 알려져 있다(2-4). 식품을 통해 섭취되는 비타 민 B12는 위에서 단백질과 분리된 후 위 내에 존재하는 내인 자(intrinsic factor)와 결합하여 복합체를 형성한 다음 회장 에서 흡수되기 때문에(5) 위산 분비가 적어지는 노인, 위장 절제 수술 후의 환자, 채식주의를 선호하는 사람들에게서 비타민 B12 결핍이 빈번히 발생하는 것으로 보고되어 왔다 (6,7). 이러한 미량 영양소의 결핍과 질병과의 관계에 관심 이 높아지면서 최근 식품 중의 비타민 B12 수준에 관한 관심 이 높아지고 있으나, 국민 영양평가를 위해 필요한 신뢰도
있는 비타민 B12 분석 데이터베이스는 거의 전무한 실정이 다. 특히 한국은 삼면이 바다로 둘러싸여 있기 때문에 계절 에 따른 수산 자원이 풍부하며 한국 식단을 구성하는 주요 동물성 자원임에도 불구하고 이들에 대한 신뢰성 있는 비타 민 B12 데이터베이스 구축 및 관련 분석법 검증에 관련 연구 는 매우 미약한 실정이다.
비타민 B12는 식품 내에 다양한 형태로 소량 존재하기 때 문에 정확한 정량 분석이 어려운 것으로 알려져 있다. 이러 한 단점을 극복하기 위해 다양한 분석법들이 시도되고 있는 데 주로 미량의 비타민 B12를 선택적으로 검출할 수 있는 검출방법을 다양하게 시도하는 분석법들이 소개되고 있다.
일반적으로 국제 영양성분 데이터베이스를 교류하고 표준 화하기 위하여 비타민 B12 성분의 경우 Lactobacillus lei- chmannii를 이용한 미생물학적 분석법이 권장되어 왔으나, 미생물학적인 분석법은 민감성은 좋지만 특이성이 부족하 고 고도의 분석 숙련도를 요하고 분석자에 따른 결과의 재현 성이 낮은 단점(8) 때문에 최근에는 분광광도법(spectro- photometry), 방사선 동위원소법, HPLC 등 다양한 검출법 이 이용되고 있다(9-11). HPLC법은 신속하고 간편하여 널 리 사용되고 있으나 UV를 검출기로 사용하는 경우 감도가 낮은 단점이 있어 최근에는 이를 극복하기 위해 solid phase extraction(SPE)이나 immunoaffinity column을 이용한 clean-up 및 농축과 같은 전처리를 통하여 식품 중 낮은 함량의 비타민 B12를 신뢰성을 확보하여 분석할 수 있는 방 법이 시도되고 있다(12,13).
식품 중 비타민 B12는 자유(free) 또는 단백질과 결합 (bound)한 형태로 존재하는 것으로 알려져 있다(14). 특히 단백질 함량이 높은 동물성 식품에서는 조직 내에서 비타민 B12가 단백질과 결합되어 있기 때문에 이를 효율적으로 추 출하기 위해서는 pepsin과 같은 단백질 분해효소를 이용하 여 비타민 B12를 분리하고 효소처리 하지 않은 자유 형태의 비타민 B12와 효소처리로 얻어진 비타민 B12의 총 함량인 총 비타민 B12를 분석하는 분석방법이 보고되어 있다(14).
하지만 현재까지 이러한 pepsin을 이용한 추출법은 일부 동 물성 식품의 분석에 한정되어 적용되어(12,14) 한국 식단에 서 다소비되는 수산 자원에 적용 가능 여부와 관련된 연구가 요구되고 있다.
본 연구에서는 단백질 함량이 높은 수산 자원의 정확한 비타민 B12 함량 분석을 위하여 pepsin-assisted extrac- tion을 immunoaffinity-HPLC/DAD 분석과 병행하여 결합 형 비타민 B12를 포함한 총 비타민 B12 함량을 분석하고자 하였으며, 이를 위하여 분석수행지표(선택성, 민감성, 직선 성, 정확성, 정밀성)를 평가하여 분석법의 유효성을 검증하 였다. 또한, 검증된 분석법을 이용하여 매트릭스가 다른 4종 의 국내 다소비 수산 자원의 자유 및 총 비타민 B12 함량을 분석하고 매트릭스에 따른 영향을 평가하기 위하여 회수율 을 비교하였다. 아울러 본 연구는 국가식품영양성분표 개정 을 위한 수산 자원의 비타민 B12 분석법 개선에 대한 연구를
수행하였다.
재료 및 방법
시약
비타민 B12의 표준품인 cyanocobalamin(purity 96.0~
102.0%)은 Sigma-Aldrich사(St. Louis, MO, USA)에서 구 입하였으며, sodium acetate trihydrate와 acetic acid는 Wako사(Osaka, Japan)에서 구입하여 사용하였다. 분석에 사용된 용매는 모두 HPLC급으로 구매하여 사용하였다. 분 석법 검증에 사용된 인증참고물질(certified reference material, CRM)로는 BCR® 487(pig liver)을 EC(European Commission)사의 IRMM(Institute for Reference Mate- rials and Measurement, Geel, Belgium)에서 구입하여 사 용하였다. 분석품질관리를 위해는 시판 분유(Imperial dream XO world class 3step, Namyang, Seoul, Korea)를 구매 하여 사용하였다.
시료 준비
시료는 2017년 농촌진흥청이 국가표준식품성분표 제9개 정판 개정을 위해 선정한 다소비 수산물 중 어류, 갑각류, 연체류, 조개류에서 각 1종씩을 선정(고등어, 꽃게, 오징어, 바지락)하고 이를 순천시 소재의 지역 시장에서 각각 총 중 량 3 kg 이상씩 구매하였다. 각각 비가식부를 제거한 후 가 식 부위를 모두 균질화(Blend master-57199R, Hamilton Beach/Proctor-Silex, Glen Allen, VA, USA)한 다음 약 80 g씩 뚜껑이 있는 밀폐용기에 소포장하여 -70°C에서 보 관하며 분석 시료로 사용하였다.
자유 비타민 B12 추출
뚜껑이 있는 250 mL-glass tube에 균질화된 시료를 시 료의 비타민 B12 함량 수준에 따라 0.5~5 g 칭량하여 0.2 M sodium acetate trihydrate buffer(pH 4.0) 49.5 mL와 1% sodium cyanide 0.5 mL를 가한 후 10분간 초음파(Cole- Parmer 8893, Chicago, IL, USA) 처리하고 100°C 항온수 조(WB-20M, Jeio Tech Co., Daejeon, Korea)에서 1시간 추출하였다. 추출된 시료는 실온으로 냉각한 후 50 mL 정용 병으로 증류수를 가하여 정용한 다음 Whatman No.1(GE Healthcare, Amersham Place, UK)로 여과하였다.
총 비타민 B12 추출
뚜껑이 있는 250 mL-glass tube에 균질화된 시료의 비 타민 B12 함량 수준에 따라 0.5~5 g 칭량하여 0.2 M sodium acetate trihydrate buffer(pH 4.0) 49.5 mL와 1% sodium cyanide 0.5 mL를 가하여 10분간 초음파(Cole-Parmer 8893) 처리하였다. 시료액에 pepsin 2 g을 가하여 37°C 배양기(HB-201SF, Hanbaek Scientific Co., Bucheon, Korea)에서 3시간 반응시킨 다음 100°C 항온수조에서 1시
Table 1. HPLC analysis condition for vitamin B12 analysis
Units Conditions
HPLC system Column Column temp.
Flow rate Injection volume Detection
Agilent 1260 infinity (Agilent, Santa Clara, CA, USA)
C18 ACE 3 AQ (3 mm×150 mm, ACE, Scotland, UK)
35°C 0.25 mL/min 100 μL
Photodiode array detector (DAD), 361 nm
Table 2. Gradient condition of mobile phases for vitamin B12
analysis by HPLC
Time (min) Water (%) Acetonitrile (%) 0
11 19 20 26 35
100 85 75 90 100 100
0 15 25 10 0 0 간 추출하였다. 추출된 시료액은 실온으로 냉각한 다음 50
mL 정용병에 증류수를 이용하여 정용한 후 Whatman No.1 로 여과하였다. Pepsin에 내재되어 있는 비타민 B12 함량 측정을 위해 시료가 없는 enzyme blank를 시료와 함께 동 일한 방법으로 분석하여 pepsin에 내재된 비타민 B12 함량 을 계산하고 이를 시료의 총 비타민 B12 함량 계산에서 제외 하였다.
비타민 B12 정제 및 농축
냉장 보관되어 있는 immunoaffinity column(Easi-Ex- tract Vitamin B12, r-Biopharm, Glasgow, UK)을 실온에 서 30분간 방치한 다음 column 내에 충진된 완충용액을 제 거하고 증류수 3 mL를 주입하여 column을 활성화시켰다.
여과된 시료 추출액을 비타민 B12 농도에 따라 3 mL씩 3회 까지 주입하여 추출액 중의 비타민 B12를 column에 흡착시 킨 후 증류수 3 mL씩 3회 주입함으로써 불순물을 세척하였 다. 주사기를 이용하여 air(~40 mL)를 주입하고 column 내 수분을 제거한 후 메탄올 3 mL를 column에 주입하여 흡착 된 비타민 B12를 메탄올에 용해시켜 추출액을 시험관에 수 집하였다. 메탄올 추출액은 질소농축기(EYELAMG-2200, Tokyo Rikakikai Co., Tokyo, Japan)를 이용하여 모두 휘 발시킨 다음 증류수 0.5 mL를 가하여 재용해시켰다. 재용해 된 시험액은 0.45 μm membrane filter(cellulose acetate, DISMIC®-13CP, Advantec®, Osaka, Japan)로 여과하여 갈색 vial에 담은 뒤 HPLC/DAD의 분석시료로 사용하였다.
HPLC/DAD 분석
비타민 B12 표준용액은 표준품 cyanocobalamin 10 mg 을 물 1 mL에 용해시켜 1 mg/mL의 농도로 stock solution 을 제조하고 -18°C의 냉암소에 보관하여 사용하였으며, 시 료의 비타민 B12 수준에 따라 working solution으로 희석하 여 사용하였다. 비타민 B12 분석에 사용된 분석조건은 Table 1과 같았으며, 분리를 위한 이동상의 gradient 조건은 Table 2와 같았다.
분석법의 특이성, 민감성, 직성성 분석
AOAC(8)와 ICH(15)의 single laboratory 분석법 검증 가이드라인에 따라 pepsin 처리 추출 및 immunoaffinity-
HPLC/DAD 분석법을 적용한 비타민 B12 분석법 검증을 수 행하였다.
특이성(specificity)은 인증참고물질인 BCR® 487의 비 타민 B12 추출액을 HPLC로 분석 시 cyanocobalamin 피크 의 purity를 확인하고 DAD 검출기 200~600 nm 범위에서 의 spectrum을 수집하여 이를 표준용액의 cyanocobala- min 피크와 머무름 시간(retention time, RT) 및 spectrum 패턴을 비교하였다. 직선성(linearity)은 표준용액인 cya- nocobalamin을 일반적인 식품 중의 비타민 B12 농도 수준 을 포함하는 5가지 농도(0.025, 0.05, 0.1, 0.2, 0.4 μg/mL) 로 제조하여 측정된 피크의 면적과 농도와의 상관성을 분석 하였다. 검출한계(limit of detection, LOD), 정량한계(limit of quantification, LOQ)는 바탕 시험액(blank) 분석 시 크 로마토그램의 signal-to-noise(S/N)의 평균값과 표준편차 를 구하여 평균값에 표준편차를 각각 3.3과 10으로 각각 곱한 값을 더하여 LOD와 LOQ를 구하였다.
분석법의 정확성 및 정밀성 분석
정확성(accuracy)은 분석품질관리를 위한 인증값이 제 시된 인증참고물질 BCR® 487의 비타민 B12 함량을 pepsin 처리 여부에 따른 추출법으로 각각 분석하고 IRMM에서 제 시한 인증값과 비교하여 회수율(%)로 계산하였다. 또한, 시 료 총 4종의 매트릭스에 따른 비타민 B12 회수율을 측정하기 위하여 각 시료의 비타민 B12 농도 수준의 100%에 해당되는 양의 cyanocobalamin을 spike 한 시료를 unspiked 시료와 함께 pepsin 처리에 따른 비타민 B12 함량을 각각 분석하여 회수율(%)을 계산하였다. 분석법의 정밀성(precision)은 품 질관리 시료로 이용되는 commercial infant formula를 하 루에 5반복 실험하여 repeatability(intra-day, RSDr)를, 5 일 동안 1회씩 실험하여 reproducibility(inter-day pre- cision, RSDR)의 coefficient variation(CV, %)을 계산하여 두 추출법을 이용한 분석법의 정밀성과 재현성을 비교하였 으며 AOAC 가이드라인(8)에서 제시하는 정밀성 수용 기준 의 적합성 여부를 검증하였다.
통계처리
통계는 SPSS(Statistics Package for the Social Sci- ence, Ver. 22.0 for Window, SPSS Inc., Chicago, IL, USA) 프로그램을 이용하였고 분석 결과의 평균과 표준편차
A B
C D
Fig. 1. HPLC chromatograms of cyanocobalamin standard (A), samples (squid) with (B) and without (C) pepsin treatment, and their overlapped DAD spectrums (D) of vitamin B12 at 200∼600 nm. Top, middle, and bottom lines in (D) indicate spectrums of cyanocobalamin peaks in (A), (B), and (C) respectively.
를 구하였으며, 두 분석법의 유의적 차이는 t-test를 이용하 여 P<0.05 수준에서 유의성을 검정하였다.
결과 및 고찰
분석법의 특이성, 민감성, 및 직선성 검증 및 비교 식품 중의 비타민 B12 분석은 일반적으로 농도 수준이 매 우 낮고 다양한 형태로 존재하기 때문에 재현성 있는 분석을 위해서는 분석법의 특이성과 민감성(sensitivity)의 검증이 중요한 분석검증 지표가 된다. 본 연구에서는 수산물 4종의 비타민 B12 분석을 위하여 단백질과 결합된 형태의 비타민 B12를 pepsin으로 가수분해한 후 immunoaffininy-HPLC/
DAD로 정량 분석하였으며 이에 대하여 AOAC 가이드라인 (8)에 따라 검증을 수행하였다. 이를 위해 효소 처리(free) 및 처리하지 않은 시료(total) 두 가지로 구분하여 비타민 B12
를 유리(free)와 총(total) 비타민 B12 함량으로 각각 분석하 였으며 각각의 방법에 대한 검증 지표를 비교 분석하였다.
먼저 분석법의 특이성은 cyanocobalamin 표준용액과 시 료의 비타민 B12 추출액을 HPLC로 분석하여 얻어진 HPLC chromatogram과 cyanocobalamin의 200~600 nm에서 얻어진 DAD spectrum을 비교 분석하였다(Fig. 1). Fig 1의 HPLC 크로마토그램에서 표준용액(A)과 효소 처리(B) 및 처리하지 않은 시료(C)의 cyanocobalamin 피크의 머무름 시간은 약 30.4분으로 모두 일치하였으며, peak purity를 확인한 결과 효소 처리 여부와 상관없이 모두(B와 C) 99%
이상으로 높게 나타나 cyanocobalamin 피크가 단일 성분으
로 분리되었음을 확인할 수 있었다. 또한, 세 cyanocobala- min 피크(Fig. 1A, 1B, 1C)의 DAD spectrum을 over- lapping 한 Fig. 1D에서 나타나듯이 B와 C의 흡광패턴 모두 가 200~600 nm 범위에서 standard의 spectrum과 상호 일치하는 것이 확인되어 효소 처리 여부와 상관없이 HPLC/
DAD 분석에서의 specificity가 우수함을 알 수 있었다. Pa- pain과 같은 단백질 분해효소를 사용하는 경우 불순물로 인 하여 크로마토그래피 분석에서 간섭을 나타내는 것으로 보 고(16)되어 있어 pepsin 사용이 권장되고 있다. 본 연구에서 pepsin 가수분해 단계를 추가한 분석 시료의 경우 pepsin 처리를 하지 않은 시료에 비하여 HPLC 크로마토그램의 baseline에서의 noise가 상대적으로 더 크게 나타나 pepsin 처리법으로 인한 불순물이 영향을 주는 것으로 보였으나 (data not shown), 분리 검출된 cyanocobalamin의 peak purity 분석에서 pepsin 처리 여부와 상관없이 순도가 높게 나타나 immunoaffinity-HPLC/DAD 분리 정량에서는 pep- sin 처리 추출법을 적용하는 방법도 가능한 것으로 판단된 다.
식품 중의 비타민 B12 분석을 위해 다양한 분석법들이 시 도되고 있는데 L. leichmannii를 이용한 미생물학적 분석법 은 민감성은 좋으나 특이성이 부족하고 재현성이 낮은 방법 으로 보고되고 있으며(8), protein-binding assay에서 sur- face plasma resonance spectroscopy 검출법의 경우 검 출한계가 2 ng/g으로 낮아 식품 중 미량으로 존재하는 비타 민 B12 분석에 활용이 가능하지만 분석에 사용되는 binding protein이 cobalamin analogs와 반응하는 단점이 있다고 보
Table 3. LOD, LOQ, and linearity of immunoaffinity-HPLC/
DAD assay for vitamin B12
Parameters
Calibration curve equation (y=Ax+B) Correlation coefficient, R2
Range (μg/mL)
LOD1) and LOQ2) for pepsin-untreated analysis (μg/100 g)
LOD and LOQ for pepsin-treated analysis (μg/100 g)
y=2008x－19.757 0.9992 0.025∼0.400 0.006 and 0.061 0.015 and 0.106
1)LOD＝Blank test value+3.3×SD.
2)LOQ＝Blank test value+10×SD.
Table 4. Accuracy of vitamin B12 analysis for certified reference material by pepsin-assisted extraction and immunoaffinity-HPLC/
DAD
Extraction method
Vitamin B12 content
(µg/100 g)1) Accuracy Reference (%)
value Analysis value Pepsin-untreated
Pepsin-treated 112±0.09 107.90±6.64 111.31±3.22
96.34 99.39
1)Means without asterisk superscript in the same column are not significantly different at α=0.05.
고되어 있다(12). Inductively coupled argon plasma emis- sion spectrometric detection(16)의 경우 LOD가 150 mg/
g으로 높기 때문에 비타민 B12 함량이 상당히 높은 식품들의 분석에만 한정되어 적용이 가능한 것으로 알려져 있다. 한편 HPLC를 이용한 분석법은 사용하는 UV의 감도가 낮은 단점 을 극복하기 위해 solid phase extraction(SPE)이나 im- munoaffinity column을 이용하여 불순물의 clean-up과 분 석 성분을 농축하는 등의 전처리를 병행하여 식품 중 낮은 수준으로 존재하는 비타민 B12 분석의 정확성을 개선하는 연구들이 시도되고 있다(12,13).
본 연구에 적용된 immunoaffinity-HPLC/DAD법의 LOD 와 LOQ는 pepsin을 처리하지 않은 경우 각각 0.006과 0.061 μg/100 g, pepsin을 처리한 경우 각각 0.015와 0.106 μg/100 g으로 나타나 효소 처리법이 무처리 방법보다 약 2배 정도 높게 나타났으나(Table 3) 여전히 수산 자원 중 비타민 B12의 농도 수준에 대한 정량 분석이 가능한 수준이 었다. 이는 pepsin과 같은 효소 처리를 비타민 B12 추출에 이용 시 효소에서 기인되는 불순물로 인하여 cyanocobala- min 주변의 HPLC 크로마토그램 baseline의 S/N 비율이 높아지기 때문에 효소를 처리하지 않는 방법에 비하여 LOD 와 LOQ가 높아질 수 있으나, 본 연구에 적용한 immuno- affinity column은 불순물을 효과적으로 제거함과 동시에 분석하고자 하는 cyanocobalamin 성분을 선택적으로 농축 할 수 있기 때문에 불순물에 의한 간섭을 최소화할 수 있고 이에 따라 UV의 검출한계와 정량한계도 효과적으로 낮출 수 있는 것으로 판단된다.
한편 분석법의 직선성은 시료 중의 비타민 B12 농도에 대 한 검출기 측정 반응의 직선적 비례관계를 나타낸다. 본 연 구에서는 식품 중의 비타민 B12 농도 수준을 고려하여 이를 포함할 수 있는 농도 수준으로 cyanocobalamin 표준용액을 제조하여 HPLC/DAD를 이용하여 분석한 결과를 검량선으 로 작성한 결과 직선식 y=2008x－19.757을 얻었으며 높은 상관계수 R2=0.9992 값을 얻어 직선성이 우수함을 확인할 수 있었다(Table 3).
분석법의 정확성과 정밀성 검증 및 비교
분석법의 정확성 검증은 인증참고물질 BCR® 487(pig
liver)을 pepsin 처리 여부에 따라 분석한 유리 및 총 비타민 B12 함량을 정량 분석하고 이를 IRMM에서 제시한 인증값 (112.00±9.00 µg/100 g)과 비교하여 계산한 회수율을 평 가하였다(Table 4). Pepsin을 처리하지 않은 BCR 487 시 료에서 비타민 B12의 회수율은 96.3%, pepsin을 처리한 시 료에서는 99.4%의 회수율을 얻어 pepsin 처리 방법의 회수 율이 다소 높은 것으로 나타났으나 두 방법에서 얻어진 회수 율 모두 AOAC 가이드라인(8)에서 제시하는 정확성의 수용 범위 수준(시료의 분석 성분의 농도 1 µg/g 기준으로 75~
120%)을 충족하는 것으로 확인되었다. 한편 기존의 추출법 으로 얻어진 분석값 107.9 μg/100 g에 비하여 pepsin을 처 리한 분석법에서 참값인 112 μg/100 g에 보다 근접한 분석 치(111.3 μg/100 g)를 얻을 수 있었으나 두 가지 분석값 모두 BCR 487 비타민 B12 함량 인증값 범위인 103~121 μg/100 g 안에 포함되어 두 추출법 모두 정확성이 우수함을 확인할 수 있었다.
두 가지 추출법으로 분석한 비타민 B12 분석의 정밀성 측 정을 위해 분석품질관리시료(infant formula)를 동일한 분 석일에 3반복씩 5회 독립적으로 분석하여 얻은 반복성 (repeatability)과 각각 다른 분석일에 3반복으로 5회 분석 한 재현성(reproducibility)의 결과는 Table 5와 같다. Pep- sin을 처리한 분석법으로 얻어진 반복성과 재현성의 CV는 각각 6.0과 10.5%였으며, pepsin을 처리하지 않은 분석법 에서는 각각 이보다 높은 9.4와 13.6%를 나타냈다. Pepsin 을 처리한 분석법의 정밀성이 처리하지 않은 시료보다 높게 나타났으나 두 방법 모두 시료 중의 비타민 B12의 농도 수준 에 대한 AOAC 가이드라인(8)에 제시하는 정밀성 수용 기준 인 15% 이하의 값으로 모두 신뢰성 있는 정밀성을 보이는 분석법임을 확인할 수 있었다.
본 연구에서는 시료 중 단백질과 결합된 형태의 비타민 B12를 가수분해하기 위하여 사용된 pepsin이 cyanocobal- amin을 내재적으로 함유하고 있기 때문에 효소공시료(en- zyme blank)를 시료와 동일하게 분석한 후 pepsin 사용으 로 인한 오차를 제거하였다. Pepsin을 사용하는 분석법의 경우 enzyme blank 측정 오차와 효소에서 기인되는 불순물 로 인한 검출 오차 등이 발생할 수 있으므로 pepsin을 이용 하지 않는 분석법에 비하여 재현성 오차가 증가되는 요인이 될 수 있을 것으로 보인다. 하지만 본 실험에서 pepsin 처리
Table 5. Precision of immunoaffinity-HPLC/DAD assay for vitamin B12
Extraction method Vitamin B12 content (µg/100 g)1)
Parameters2) Repeatability3) Reproducibility4) Pepsin-untreated Mean±SD
CV (%)
5.20±0.31 6.0
4.72±0.50 10.5 Pepsin-treated Mean±SD
CV (%)
4.82±0.45 9.4
5.11±0.69 13.6
1)Means without asterisk superscript in the same column for different treatments are not significantly different at α=0.05.
2)SD: standard deviation. Coefficient of variation (CV, %)＝100×(SD/mean).
3)Repeatability refers to the results of 5 independent determinations in triplicates carried out for the same sample on the same day.
4)Reproducibility refers to the results of 5 independent determinations in triplicates carried out for the same sample on different 5 assay days.
Table 6. Vitamin B12 contents and recoveries of selected seafoods
Homogenized raw samples Vitamin B12 content (µg/100 g, wet basis)1) Recovery (%)2) Free V-B12 Total V-B12 Free V-B12 Total V-B12
Littleneck clam (Ruditapes philippinarum) Blue crab (Portunus trituberculatus) Mackerel (Scomber japonicus) Squid (Todarodes pacificus)
46.91±0.37 6.87±0.07 4.64±0.07 2.39±0.02
55.16±0.46* 6.09±0.82 5.60±0.17* 2.45±0.26
81.2±0.3 108.6±4.1 106.9±3.8 105.9±2.2
72.7±1.9 90.9±4.3 90.7±1.2 100.8±8.3
1)Free V-B12 indicates free forms of vitamin B12 obtained by pepsin-untreated extraction. Total V-B12 indicates sum of free and bound vitamin B12 forms obtained by pepsin-treated extraction.
2)Recovery (%)＝100×vitamin B12 content in spiked sample/ (the spiked amount of vitamin B12+vitamin B12 content in unspiked sample).
*Means with a asterisk within the same row for vitamin B12 content are significantly different each other at α<0.05.
를 적용한 비타민 B12 분석에서도 AOAC 가이드라인(8)에 서 제시하는 정확성과 정밀성 수용 범위를 충족하는 결과를 얻었기 때문에 결합된 형태의 비타민 B12를 함유하고 있는 식품의 비타민 B12 함량 분석 시 pepsin을 적용한 분석법으 로도 신뢰성 있는 결과를 생산할 수 있을 것으로 보인다.
수산물 4종의 비타민 B12 함량 및 회수율 비교
보통 육류와 수산물과 같이 단백질 함량이 높은 동물성 식품에서는 단백질과 결합한 형태의 비타민 B12가 상당량 존재하는 반면에 가공식품이나 비타민 B12 등을 강화한 식 품에서는 대부분 자유 비타민 B12 형태로 존재한다. 한국에 서 다소비되는 수산물 중 매트릭스가 다른 4종의 수산물의 비타민 B12를 pepsin을 이용한 비타민 B12 추출, immu- noaffinity column을 이용한 clean-up, 그리고 HPLC/DAD 를 이용하여 자유 비타민 B12와 여기에 결합 형태를 포함한 총 비타민 B12를 분리하여 정량 분석한 결과는 Table 6과 같다. Pepsin 처리로 분석된 바지락(littleneck clam), 꽃게 (blue crab), 고등어(mackerel), 그리고 오징어(squid)의 총 비타민 B12 함량은 각각 55.16±0.46, 6.09±0.82, 5.60±
0.17, 2.45±0.26 µg/100 g으로 나타났는데, 이는 바지락과 고등어의 경우 자유 비타민 B12 함량과 유의적인 차이를 보 이는 결과인 반면(P<0.05), 꽃게와 오징어의 자유 비타민 B12 함량과는 유의적인 차이가 보이지 않는 수치였다. 이러 한 자유와 총 비타민 B12 함량의 차이들은 바지락과 고등어 에서는 비타민 B12의 각각 18%와 20%가 단백질과 결합된
형태로 존재하고 pepsin 처리에 의해 자유형으로 분리되었 음을 보여준다고 할 수 있다. 한편 fluorescent marker를 이용하여 HPLC-fluorimetric detection 법으로 단백질 함 량이 높은 동물성 식품의 비타민 B12를 분석한 Pakin 등(14) 은 고등어의 경우 자유 및 총 비타민 B12 함량이 각각 21.8과 140 ng/g, 연어의 경우 각각 11.2와 26.5 ng/g이라고 보고 하여 본 연구 결과와 달리 결합형 비타민 B12가 상당량 존재 하는 것으로 보고한 반면, 달걀에서는 자유와 총 비타민 B12
함량 사이에 큰 차이가 없는 것으로 보고하였다. 이러한 연 구 결과들의 차이는 자유 비타민 B12를 검출 및 정량하는 방법의 차이뿐만 아니라 자유 비타민 B12를 추출하는 방법 의 차이에서도 기인되는 것으로 보이는데, Pakin 등(14)의 연구에서는 자유 비타민 B12 추출에 증류수만을 사용한 반 면에 Heudi 등(12)은 자유 비타민 B12 추출을 위해 본 연구 와 같이 sodium cyanide 존재 하에 sodium acetate buffer (pH 4)를 이용하였기 때문에 본 연구나 Heudi 등(12)의 연 구와 달리 Pakin 등(14)의 연구에서는 결합된 비타민 B12 함량이 크게 나타난 것으로 보인다.
다음으로 immunoaffinity-HPLC법으로 비타민 B12 함량 분석 시 시료의 매트릭스에 따른 영향을 조사하기 위하여 수산물 4종 시료의 비타민 B12 함량을 미리 분석하여 이들 중의 비타민 B12 농도 수준을 파악한 다음 이 수준과 동일한 수준(100%)의 비타민 B12 함량을 분석 시료에 첨가하여 spiked sample을 만들고, 두 시료의 비타민 B12 함량을 분 석한 값으로부터 회수율을 계산하였다(Table 6). 바지락 시
료의 경우 회수율이 자유와 총 비타민 B12 함량 분석법으로 부터 각각 81.2와 72.7%로 다른 시료보다 비교적 낮은 회수 율을 나타냈으나, 고등어, 꽃게, 바지락 시료에서는 유리와 총 비타민 B12 함량 분석에서 90.9~108.6%의 비교적 높은 회수율 범위를 보였다. AOAC 가이드라인(8)에서는 분석법 의 정확성을 검증할 수 있는 회수율 수용 범위를 시료 중 분석 성분이 존재하는 농도 수준에 따라 10 µg/g(ppm)에서 는 80~115%, 1 µg/g에서는 75~120%, 10 µg/kg(ppb)에 서는 70~125%로 제시하고 있다. 본 연구에서 분석한 4종 수산물 시료의 비타민 B12 함량 수준은 1~100 µg/100 g 수준으로 AOAC가 제시한 분석법의 정확성을 검증할 수 있 는 회수율 수용 범위를 충족시킴을 알 수 있었다.
미생물법을 이용하여 수산물의 비타민 B12 함량을 분석한 Kwak 등(17)은 오징어의 비타민 B12 함량을 2.33 μg/100 g으로 보고하였는데, 이는 본 연구에서 immunoaffinity- HPLC로 분석한 오징어의 비타민 B12 함량 수준과 유사하였 으나, 바지락의 경우 본 연구의 비타민 B12 함량보다 훨씬 낮은 수준인 30.5~36.1 μg/100 g이라고 보고하였다. 이는 분석방법의 차이뿐만 아니라 수산 자원의 품종과 계절에 따 른 차이로 기인된 결과라 생각된다. Kwak 등(17)은 고등어 와 함께 한국인이 즐겨먹는 꽁치와 같은 등푸른생선을 구이 의 방법으로 조리한 후 비타민 B12 함량을 분석한 결과 조리 에 의한 큰 차이는 관찰되지 않았다고 보고하였다. 일반적으 로 비타민 B12는 수용성 비타민이기 때문에 이러한 건식 조 리에서보다는 습식 조리에서 손실이 크게 나타나는 것으로 알려져 있다(18,19). 삼면이 바다로 둘러 쌓여있는 한국의 지리적 특성으로 인하여 한국 식단에서는 계절에 따라 다양 한 수산 자원이 이용되고 있어 이들 수산 자원의 신뢰도 있 는 비타민 B12 데이터베이스를 구축하는 것은 국민영양실태 조사 및 관련 영양정책을 수립하는 데 중요한 선행 요건이 다. 본 연구에서 검증한 pepsin 활용 추출 및 immunoaf- finity-HPLC/DAD 분석법은 향후 다양한 수산 자원의 비타 민 B12 함량 분석 및 국가영양성분 데이터베이스 구축에 활 용될 수 있을 것으로 판단된다.
요 약
한국은 삼면이 바다로 둘러 쌓여있어 연중 다양한 수산물이 식단에 활용되고 있기 때문에 수산물은 쇠고기나 돼지고기 와 같은 육류 자원과 함께 한국 식단에서 비타민 B12 섭취를 위한 우수한 급원이 되고 있다. 식품 중의 비타민 B12는 단백 질과 결합된 형태로 존재할 수 있으므로 국내 수산 자원의 비타민 B12 함량에 대한 신뢰도 있는 데이터베이스 구축을 위해서는 비타민 B12 추출법에 대한 검증이 필요하다. 따라 서 본 연구에서는 매트릭스가 다른 수산물 4종(바지락, 꽃 게, 고등어, 오징어)을 선정하여 pepsin을 이용한 비타민 B12 추출을 immunoaffinity column을 이용한 clean-up 및 HPLC/DAD 분석에 적용하는 분석법의 유효성을 검증하였
다. 시료는 생물을 구입하여 가식 부위만 균질화한 다음 pep- sin 처리 없이 추출된 자유 비타민 B12와 pepsin을 처리하여 결합된 비타민 B12를 포함한 총 비타민 B12 함량을 각각 분 석하였으며, 이에 대한 분석법 검증(특이성, 민감성, 직선성, 정확성, 정밀성)을 수행하였다. 효소 처리 여부와 상관없이 특이적으로 cyanocobalamin을 분석할 수 있었으며 우수한 직선성(y=2008x－19.757, R2=0.9992)을 나타내었다. 검 출한계(LOD)와 정량한계(LOQ)는 pepsin 무처리 시 각각 0.006과 0.061 µg/100 g을 나타내었으나 pepsin 처리 시 약 2배가 높은 0.015와 0.106 µg/100 g을 나타내었다. 인증 참고물질 BCR-487(pig liver)을 분석한 회수율 측정에서 pepsin 처리가 99.4%, 무처리 추출이 96.3%로 효소 처리법 이 다소 높은 회수율을 나타내었다. 정밀성 시험에서는 pep- sin 무처리 추출의 반복성과 재현성이 각각 6.0과 10.5%, pepsin 처리 시 각각 9.4와 13.6%로 나타나 효소를 이용한 추출에서 정밀성이 더 높아지는 것으로 나타났다. 그러나 두 분석법 모두 AOAC에서 제안하는 수용 범위 수준을 충족 하는 정확성과 정밀성을 나타내어 식품 중의 비타민 B12 분 석에 적용 가능할 것으로 보인다. Pepsin 처리 추출법을 적 용한 immunoaffinity-HPLC 분석법으로 4종 수산물(raw, wet basis)의 비타민 B12 함량을 분석한 결과, 바지락의 자 유와 총 비타민 B12 함량은 각각 46.9와 55.2µg/100 g으로 총 비타민 B12 함량이 유의적으로 높게 나타났으나(P<0.05), 꽃게와 오징어의 경우 각각 6.09~6.87µg/100 g과 2.39~
2.45µg/100 g의 범위를 보이며 유의적인 차이를 나타내지 않았다. 이는 바지락과 고등어의 경우 총 비타민 B12 함량 중에서 각각 약 18%와 20%가 단백질과 결합된 상태로 존재 하는 것을 의미하며 이는 pepsin과 같은 효소를 이용한 추출 법이 필요하다는 것을 가리킨다 하겠다. 또한, 본 연구의 LOD와 LOQ 결과는 pepsin 처리를 이용한 immunoaf- finity-HPLC/DAD 분석법이 식품 중에 낮은 수준으로 존재 하는 비타민 B12를 분석하는 데 적용 가능한 분석법임을 보 여준다. Pepsin을 이용한 비타민 B12 분석은 정밀성과 정확 성이 수용 범위 수준이기는 하지만 무처리 분석보다는 높기 때문에 다양한 수산 자원의 매트릭스에 따른 이들의 적용 여부는 보다 구체적인 접근 방법을 검토해보는 것이 필요하 다 생각된다.
감사의 글
본 연구는 2017년도 농촌진흥청 공동연구사업(과제번호:
PJ01083802)의 지원에 의해 수행되었으며, 이에 감사드립 니다.
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