LC-MS/MS를 이용한 농산물 중 Chlormequat 분석법 개발 및 유효성 검증
최영내․이두식․김희재․김정년․김정복 한국식품과학연구원
Determination of Chlormequat in Agricultural Products with High Performance Liquid Chromatography and Tandem Mass Spectrometry
Young Nae Choi, Du Sik Lee, Hee Jae Kim, Jung Nyen Kim, and Jung Bok Kim Korea Advanced Food Research Institute
ABSTRACT Chlormequat is a two quaternary ammonium compound that is used widely as a pesticide for various plants. LC-MS/MS using WCX cartridges was used to identify and quantity the level of chlormequat in agricultural products with high sensitivity and specificity. A calibration curve was obtained from 10 ng/mL to 200 ng/mL with a satisfactory correlation coefficient of 0.999. The limit of detection and limit of quantitation for chlormequat in matrix the were 0.0002 mg/kg and 0.001 mg/kg. The recoveries of chlormequat from spiked samples at 50∼500 ng/mL ranged from 94.4 to 111.6% with a relative standard deviation between 1.7 to 4.5%. The measurement of uncertainty of the LC-MS/MS method developed for chlormequat was based on the analytical process and quantification. An analysis method that is easier and faster than the chlormequat analysis method of agricultural products in the Korean Food Standards Codex was developed. The analytical method of chlormequat in agricultural products by LC-MS/MS was established.
Key words: chlormequat, method validation, WCX cartridge, LC-MS/MS
Received 28 October 2019; Accepted 25 November 2019 Corresponding author: Jung Bok Kim, Korea Advanced Food Research Institute, Uiwang, Gyeonggi 16001, Korea
E-mail: [email protected], Phone: +82-2-3470-8276
서 론
최근 환경뿐 아니라 사회적으로도 잔류농약의 광범위한 사용은 안전뿐 아니라 다양한 안전성 문제들로 인해 국내외 적으로 많은 관심이 증대되었다(Castro 등, 2000; 2001;
Vahl 등, 1998; Nunez 등, 2002). 특히 염소 성분을 포함한 탄소 화합물로 이루어진 일부 유기염소계 농약의 경우 인체 내 느린 대사속도로 인해 배설이 잘 안 되는 문제점과 만성 노출 시 ADHD를 유발하고 신경독소로 작용하기 때문에 이 미 유럽뿐 아니라 세계적으로 사용을 금지하고 있다. 유기염 소계의 농약 중 하나인 chlormequat의 경우 식물성장 조절 제로 현재 널리 사용되고 있는 대표적인 농약 성분으로서 꽃 의 개화를 촉진하고 과일과 채소 등의 성장을 개선하는 데 일반적으로 사용되고 있다(Castro 등, 2001; Zhao, 2000;
Aramendia 등, 2006). 유럽에서는 chlormequat을 밀과 보 리에서 많이 사용하고 있다(Julhler와 Vahl, 1999).
National Institute for Occupational Safety and Health (NIOSH)에서는 chlormequat을 동물 생식의 부작용과 내분 비 교란을 야기하는 독성 물질로 분류하여 관리되고 있다.
유럽연합(EU)의 경우 chlormequat을 pesticide residues monitoring list(PRML) 항목으로 분류하여 관리하고 있다 (Yu 등, 2010). 또한 개별 살충제 제한 농도는 0.1 µg/L, 총 살충제에는 0.5 µg/L로 기준규격이 설정되어 있다(Castro 등, 2000; 2001; Munez 등, 2004). 우리나라의 chlorme- quat의 경우 곡류 중 특히 쌀과 메밀 등에서 잔류허용기준 (maximum residue limit, MRL)은 0.05~10.0 mg/kg으로 설정되어 있다(Ministry of Food and Drug Safety, 2018).
Chlormequat의 분석방법으로는 본 연구에서 사용한 시 료가 다른 source waters 중 약산성양이온교환수지(WCX) 카트리지를 이용한 LC-MS 분석법이 있으며, 일부 유효성 검증을 실시하였다. 이 분석법에서의 검출한계는 14 ng/mL 로 보고되었다(Yu 등, 2010). Hau 등(2000)의 연구에서는 다양한 농산물 중에서 chlormequat 성분을 강산성양이온교 환수지(SCX) 카트리지를 사용해 LC-MS/MS를 이용하여 분석법을 확립하였다. 이 논문에서 검출한계는 0.5~1.5 μg/
kg, 정량한계는 1.5~4.0 μg/kg으로 확인되었다. 우리나라 식품의 기준 및 규격의 일반시험법에 수재된 감자, 귀리 등 농산물 중 chlormequat 분석법의 경우 물과 메탄올 혼합액 을 이용해 시료에서 추출한 후 강산성양이온교환수지를 이 용해 정제한 다음, 트리타트륨벤젠치오라이트 시약으로 유 도체한 후 GC-Nitrogen Phosphorous Detector(NPD)를 이용한 분석방법이 수재되어 있으며, 정량한계 농도는 0.05
Weighing of sample (10 g) 10 g
Shake extraction (MeOH : H2O＝1:1, v/v) 100 mL (vortexing 5 min)
Centrifugation －4°C, 3,000 G, 10 min
－Collect supernatant layer 5 mL
WCX cartridge (150 mg, 6 cc, OASIS, Waters)
－Condition: MeOH (4 mL), H2O (4 mL)
－Sample loading (5 mL)
－Washing: MeOH (1 mL)
－Eluting: ACN : H2O : TFA＝84:14:2 (v/v/v) 4 mL
Concentration of N2 Below of 40°C
－Redissolve of mobile phase (1 mL)
－Filter through syringe filter (PTFE, 0.2 μm) LC-MS/MS
Fig. 1. Sample preparation of chlormequat in sample.
mg/kg으로 설정되어 있다(Ministry of Food and Drug Safety, 2018).
식품의 기준 및 규격의 실험과정에 사용되는 트리타트륨 벤젠치오라이트 시약은 현재 시중에 판매되지 않아 분석자 가 직접 합성해야 하며 합성과정도 60시간 이상의 시간이 소요된다.
따라서 본 연구에서는 기존의 논문보다 낮은 검출한계와 정량한계 값을 갖는 분석법을 확립하였고, 시료를 적용하여 유효성 검증을 실시하였다. 또한 효과적인 시료 전처리 방법 을 개발하여 전처리 시간이 획기적으로 단축하였고, 이로 인해 비용 절감뿐 아니라 정확한 정량분석법 확립과 경제적 효과를 기대할 수 있게 되었다. 본 연구 내용을 바탕으로 향 후 chlormequat의 분석방법, 기준규격 설정 및 관리에 참고 자료가 될 수 있다고 판단된다.
재료 및 방법
시약 및 재료
분석법 개발과 시료 정량분석에 사용된 표준품인 chlor- mequat(Dr. Ehrenstorfer GmbH, Augsburg, Germany) 의 순도가 99.0%인 것을 구매하여 사용하였다. 시료 전처리 와 분석 장비에 사용된 용매 메탄올, 아세토니트릴 등은 HPLC grade(J.T Baker, Phillipsburg, NJ, USA)의 제품을 사용하였다. 분석과정에서 필요한 시액과 시약인 ammo- nium acetate, acetic acid, trifluoroacetic acid는 Sigma- Aldrich Co.(St. Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였 다. 정제에 사용된 WCX cartridge(OASIS, Waters, MA, USA)를 구입하여 사용하였고, SPE vacuum manifold(Sig- ma-Aldrich Co.)를 이용하여 일정한 속도와 압력을 조절하 여 정제하였다. 그 외 시험에 사용된 일반 시약들은 특급시 약 및 HPLC 등급을 사용하였다.
시료 전처리 방법
시료 10 g을 300 mL 비이커에 칭량 후 용매(물 : 메탄올
=1:1, v/v) 100 mL를 넣고 균질기를 이용하여 5분간 균질 하였다. 균질화한 시료를 진탕기로 5분간 심하게 혼합 후 감압여과기로 여과하였다. 여과된 용매를 100 mL 용량플라 스크에 용매(물 : 메탄올=1:1, v/v)를 이용하여 정용하였다.
Chlormequat 정제를 위해 WCX(150 mg, 6 cc) 카트리지를 메탄올 4 mL, 증류수 4 mL로 활성화한 후 WCX 카트리지에 앞에서 정용한 시험용액 5 mL를 주입하였다. 메탄올 1 mL 를 이용하여 WCX 카트리지를 세척하였다. 카트리지에 용출 액(ACN : DW : trifluoroaceitc acid(TFA)=84:14:2, v/v/v) 4 mL를 이용하여 용출한 후 질소 농축하였다. 건고된 시료 에 이동상(10% ACN 함유 50 mM ammonium acetate, 2%
acetic acid) 1 mL로 재용해한 후 LC-MS/MS에 주입하여 분석하였다(Fig. 1).
기기분석 조건
Chlormequat 표준품 0.1 g을 정밀히 달아 이동상에 녹여 100 mL씩으로 한 용액을 표준원액으로 하고 이동상을 이용 하여 10~500 ng/mL가 되도록 희석한 용액을 검량선 표준 용액으로 하였다. LC-MS/MS 분석 조건은 분석용 컬럼 Scherzo SM-C18(4.6×150, 3 μm), 이동상은 10% ACN in 50 mM ammonium acetate, 2% acetic acid, 온도는 40°C, 유속은 0.3 mL/min, 주입량 2 μL로 하였다. Mass Ionization Mode는 ESI이며 positive ion을 정량하였다.
MRM 조건으로는 DP(70), FP(400), EP(10) 및 CXP(2)를 확인하였다. Chlormequat 모분자이온(m/z=122.1)에 대한 딸이온은 m/z=58.1과 m/z=63으로 설정하였다. 이들 이온 중 m/z=58.1(CE:38)을 정량이온으로 설정하였고, m/z=63 (CE:29)을 정성이온으로 설정하여 분석하였다(Table 1).
Table 1. Instrumental conditions of chlormequat with LC-MS/MS
Instrument LC-MS/MS (API 5000)
HPLC
Column
Oven temperature Mobile phase Flow rate Injection volume
Scherzo SM-C18 (4.6×150, 3 µm) 40°C
10% ACN in 50 mM ammonium acetate, 2% acetic acid 300 µL/min
2 µL
MS/MS
Ionization type Source
ESI (positive ion mode) Turbo ion spray source Nebulizer gas
Voltage Temperature
11 5,500 470°C
Curtain gas CAD gas
DP, FP, EP, CXP
10 7
70, 400, 10, 2 Fragment ion (CE) m/z=58.1 (38), m/z=63 (29)
Fig. 2. Fish bone diagram of uncertainty.
Method validation
본 연구에서는 잔류허용기준이 가장 낮은 matrix를 선정 하여 ICH 가이드라인을 준용하여 method validation을 실 시하였다. Method validation 항목으로는 분석물질과 ma- trix의 방해와 간섭을 확인하기 위해 선택성과 특이성을 확 인하였다. 10~200 ng/mL의 직선범위에서의 직선성을 확 인하였고, 검량선 내 서로 다른 농도 3가지를 선택하여 이 농도들의 inter, intra-day의 정밀성, 정확도 및 회수율을 확인하였다. 추가로 method validation의 항목 중 하나인 측정 불확도 산출을 위해 불확도 요인을 선정하였다. 불확도 요인은 총 6가지로 표준품의 순도, 표준품의 제조, 검량선 3가지 농도, 검량선(회귀분석), 시료의 반복 측정 등으로 불 확도 요인을 Fig. 2와 같이 설정하여 각 과정 오차 각각의 표준불확도를 산출하여 합성 측정 불확도를 산출하는 방법 을 이용하여 식품 중 chlormequat의 정량분석법의 대한 측 정 불확도를 산출하였다.
결과 및 고찰 시료전처리 및 분석법 확립
Yu 등(2010)의 문헌에서는 source waters 중 WCX 카트 리지를 이용한 LC-MS 분석법, Hau 등(2000)의 문헌에서 는 다양한 농산물 중에서 chlormequat 성분을 SCX 카트리 지를 사용한 LC-MS/MS 분석법 등이 조사되었다. 조사된 두 문헌을 응용하여 식품의 기준 및 규격에 제시된 chlor- mequat 분석방법을 개선하였고, 기존 분석법보다 더 낮은 검출한계와 정량한계 값을 갖는 시료 전처리법을 Fig. 1과 같이 확립하였고, 확립된 분석방법의 유효성 검증을 실시하 였다. Blank 시료와 분석물질인 chlormequat와 간섭이 없 는 것을 LC-MS/MS 장비를 이용하여 정량분석법을 확립하 였고 그 결과는 Fig. 3과 같다.
선택성 및 특이성
선택성 확보를 위해 잔류농약인 chlormequat의 대상 시 료 중 잔류허용기준이 가장 낮은 쌀을 이용하여 선택성과 특이성을 확인하는 blank로 사용하였다. Chlormequat의 선 택성(selectivity)은 표준용액, 무처리 시료, 표준용액을 첨 가한 회수율 시료의 크로마토그램을 서로 비교함으로써 평 가하였다. 무처리 시료와 회수율 시료는 확립된 시험방법에 따라 분석한 결과 시료 중 chlormequat의 머무름 시간과
A
B
C
D
Fig. 3. Chromatogram and mass spectrum of chlormequat with LC-MS/MS. (A) Chromatogram of chlormequat standard (50 ng/mL), (B) mass spectrum of chlormequat standard, (C) chromatogram of sample (rice), (D) mass spectrum of sample.
Table 2. Linearity result of chlormequat in matrix
Conc. (ng/mL, n=3)
10 20 50 100 200 R2 Slope Intercept
1 day 2 day 3 day Mean Precision (%) Accuracy (%)
8.7 10.7 9.0 9.5 10.9 94.8
19.7 20.7 20.0 20.1 2.4 100.6
49.4 49.5 51.5 50.2 2.4 100.3
103.8 98.3 99.5 100.5 2.9 100.5
198.3 200.9 199.9 199.7 0.6 99.9
0.9992 0.9998 0.9999 0.9996
2,464.7 2,232.9 2,291.8 2,329.8
3,162.7
−3,517.4 886.4 177
Table 3. Result of accuracy and precision in intra and inter-day
Parameter Conc. (ng/mL, n=3)
10 50 200
Intra-day
Mean Precision (%) Accuracy (%)
9.5 1.6 94.8
51.5 2.1 102.9
197.0 3.3 98.5
Inter-day
Mean Precision (%) Accuracy (%)
10.5 10.6 104.8
53.2 6.2 106.4
206.4 6.7 103.2
Table 4. Result of recovery in matrix
Spiked STD Conc. (µg/mL, m/z=58.1)
Mean SD RSD (%) Recovery (%)
n=1 n=2 n=3
MDL1) 5 MDL 10 MDL
0.047 0.285 0.558
0.048 0.287 0.530
0.047 0.265 0.514
0.047 0.279 0.534
0.0008 0.0126 0.0220
1.7 4.5 4.1
94.4 111.6 106.8
1)MDL: 50 ng/mL.
Table 5. Result of peak area and height for LOD and LOQ (1 ng/mL) Analyte peak area Analyte peak height
m/z=58.1 m/z=63.0 m/z=58.1 m/z=63.0 n=1
n=2 n=3 n=4 n=5 n=6 n=7 n=8 n=9
6,220 5,950 6,600 5,430 5,900 6,570 6,330 6,230 6,110
2,450 1,200 2,300 2,300 2,000 1,880 2,790 2,300 2,390
784 811 827 801 842 854 769 865 783
325 184 308 310 328 312 318 339 322 Mean
SD RSD
6,148.9 340.8
5.5
2,178.9 423.6
19.4
815.1 32.0
3.9
305.1 43.8 14.4 질량 대 전하비(m/z)가 같은 방해물질의 간섭과 분석물질
검출되지 않는 것을 확인하였다.
직선성
직선성 확인을 위해 matrix를 적용한 표준용액을 이용하 여 직선성(linearity)을 확인하였다. Chlormequat 표준원액 을 blank를 이용하여 matrix effect를 최소화하여 재용해 용매인 이동상을 이용해 10, 20, 50, 100, 200 ng/mL로 계열 희석용액을 검량선의 표준용액으로 사용하였고, 그 결 과 결정계수(r2) 0.999 이상의 직선성을 확인하였고 검량선 각각의 농도의 정밀성의 경우 0.6~10.9%, 정확성은 94.8~
100.6%로 확인되었다(Table 2).
일내, 일간 정밀성 및 정확성
정밀성과 정확성을 확인하기 위해 검량선 내 3가지 농도 10, 50, 100 ng/mL를 선정하여 일내와 일간의 정밀성 및 정확성을 측정하였다. 그 결과 일내 정밀성은 3.3% 이하, 정 확성은 94.8~102.9%로 확인되었으며, 일간 정밀성은 10.6
% 이하, 정확성은 103.2~104.8%로 확인되었다(Table 3).
회수율
확립된 분석법의 회수율 측정을 위해 농약기준 규격의 잔 류허용기준(MRL=0.1 mg/kg)을 이용하여 MRL, MRL 5배,
MRL 10배 수준인 0.1, 0.5, 1.0 mg/kg의 농도를 선정하여 각각의 농도에서 chlormequat의 회수율 실험을 3 반복으로 수행하였다. 그 결과 각 농도에서 chlormequat의 평균 회수 율은 94.4~111.6%였다. 이때 상대표준편차는 모두 4.5%
이하로 확인되었다(Table 4).
검출한계(LOD) 및 정량한계(LOQ)
확립한 시험용액 조제 및 기기분석방법을 이용하여 sig-
Table 6. Expanded uncertainty of chlormequat in sample
Parameters of uncertainty Result Unit
Certified concentration The result of uncertainty Expanded uncertainty (U) Coverage factor (k) Degrees of freedom (veff)
Combined standard uncertainty (uc)
Combined relative standard uncertainty (ur/r)
10.0
10.00±0.85 (K=2, 95% confidence level) 0.85
2 1314054
0.4 0.043
mg/kg mg/kg mg/kg dimensionless unit dimensionless unit
mg/kg dimensionless unit
nal/noise(S/N) ratio법을 사용하여 검체 중 chlormequat 의 검출한계 및 정량한계를 산출하였다. Chlormequat의 검 출한계 및 정량한계 산출을 위해 저농도인 1 ng/mL의 농도 를 9회 반복 분석하여 chlormequat의 정량이온(m/z=58.1) 과 정성이온(m/z=63.0)의 peak area 값과 peak height를 확인한 후 S/N ratio를 이용하여 검출한계와 정량한계를 Table 5와 같이 산출하였다. 정량이온의 RSD의 경우 5.5%
로 확인되었다. 그 결과 chlormequat의 검출한계는 0.0002 mg/kg, 정량한계는 0.001 mg/kg으로 확인되었다.
측정 불확도 산출 결과
Chlormequat의 측정 불확도를 산출하기 위해 설정된 불 확도 요인은 총 6가지로 표준품의 순도, 표준품의 제조, 검 량선 3가지 농도, 검량선(회귀분석), 시료의 반복 측정으로 불확도 요인을 설정하였다. 설정된 불확도 요인과 자유도를 이용하여 합성상대표준불확도, 합성표준불확도, 포함인자 및 시료 측정 결과로 확장 불확도를 산출하였다. 그 결과 측 정 불확도는 10.00±0.85 mg/kg(신뢰수준 95%, K=2)으로 확인되어 낮은 불확도값 산출로 인해 발생할 수 있는 측정값 의 오차율을 줄일 수 있는 결과를 도출하였다(Table 6).
요 약
우리나라 식품의 기준 및 규격의 일반시험법에 수재된 chlormequat의 시험법에서는 물과 메탄올 혼합액으로 추출 한 용액을 강산성양이온교환수지로 정제 후 합성된 트리타 트륨벤젠치오라이트 시약을 이용하여 GC-NPD 분석장비 로 농산물 중 chlormequat을 분석하고 있다. 이 분석방법에 사용되는 트리타트륨벤젠치오라이트은 현재 시중에 판매되 지 않고 있으며, 직접 합성해야 하고 그 시간도 최소 3일 이상으로 소요되는 어려움이 있다. 따라서 본 연구에서는 메탄올과 물을 이용하여 농산물에서 chlormequat 성분을 추출하고, WCX 카트리지를 이용한 정제방법을 이용하여 농 산물 중 chlormequat의 분석법을 확립하였고 유효성 검증 을 실시하였다. 시료 중의 chlormequat을 분석에 사용한 컬럼은 Scherzo SM-C18(4.6×150, 3 μm), 이동상은 10%
ACN 함유 50 mM ammonium acetate, 2% acetic acid, oven 온도는 40°C, 유속은 0.3 mL/min으로 분석하였다.
Mass 분석조건으로는 분석물질의 분자량은 m/z=122.1의
정량이온 m/z=58.1(38), 정성이온 m/z=63(29), positive 이온, ESI 이온모드를 이용하여 분석하였다. 직선성 확인을 위해 matrix를 적용한 표준용액 10, 20, 50, 100, 200 ng/
mL로 희석하여 LC-MS/MS에 분석하였고 그 결과 모든 결 정계수(r2) 0.999 이상의 직선성을 확인하였다. 검량선 내 3가지 농도 10, 50, 100 ng/mL를 선정하여 일내와 일간의 정밀성 및 정확성 측정 결과 일내 정밀성은 3.3% 이하, 정확 성은 94.8~102.9%로 확인되었으며, 일간 정밀성은 10.6%
이하, 정확성은 103.2~104.8%로 확인되었다. 시험법의 정 밀성과 회수율 평가를 위해 농약 잔류허용기준(maximum residue limit=0.1 mg/kg)의 농도를 선정하여 chlormequat 의 회수율 실험을 3가지 농도를 3반복으로 수행하여 94.4~
111.6%의 회수율을 확인하였고, 상대표준편차는 4.5% 이 하로 확인되었다. 검출한계는 0.0002 mg/kg, 정량한계는 0.001 mg/kg으로 측정되었다. 측정 불확도는 10.00±0.85 mg/kg(신뢰수준 95%, K=2)으로 확인되었다. 확립된 chlor- mequat 분석법을 적용하여 기존 분석법보다 단순한 시료 전처리법 개발을 통해 분석시간의 단축뿐 아니라 경제적 비 용을 절감하였고, 개발된 분석법의 유효성 검증을 통해 정량 분석이 가능하게 되었다. 이런 분석법 개발을 통해 잔류농약 을 분석자뿐 아니라 기준규격 설정과 사후관리에 참고 자료 가 될 수 있다고 판단된다.
REFERENCES
Aramendia MA, Borau V, Lafont F, Marinas A, Marinas JM, Moreno JM, et al. Determination of diquat and paraquat in olive oil by ion-pair liquid chromatography-electrospray ion- ization mass spectrometry (MRM). Food Chem. 2006. 97:
181-188.
Castro R, Moyano E, Galceran MT. Determination of quaternary ammonium pesticides by liquid chromatography-electrospray tandem mass spectrometry. J Chromatogr A. 2001. 914:111- 121.
Castro R, Moyano E, Galceran MT. On-line ion-pair solid-phase extraction-liquid chromatography-mass spectrometry for the analysis of quaternary ammonium herbicides. J Chromatogr A. 2000. 869:441-449.
Hau J, Riediker S, Varga N, Stadler RH. Determination of the plant growth regulator chlormequat in food by liquid chroma- tography-electrospray ionisation tandem mass spectrometry.
J Chromatogr A. 2000. 878:77-86.
Juhler RK, Vahl M. Residues of chlormequat and mepiquat in grain－results from the Danish National Pesticide Survey. J
AOAC Int. 1999. 82:331-336.
Ministry of Food and Drug Safety. Korean Food Standards Codex. Ministry of Food and Drug Safety, Cheongju, Korea.
2018.
Nunez O, Moyano E, Galceran MT. Capillary electrophoresis- mass spectrometry for the analysis of quaternary ammonium herbicides. J Chromatogr A. 2002. 974:243-255.
Nunez O, Moyano E, Galceran MT. Time-of-flight high reso- lution versus triple quadrupole tandem mass spectrometry for the analysis of quaternary ammonium herbicides in drinking water. Anal Chim Acta. 2004. 525:183-190.
Vahl M, Graven A, Juhler RK, Analysis of chlormequat residues in grain using liquid chromatography-mass spectrometry (LC- MS/MS). Fresenius J Anal Chem. 1998. 361:817-820.
Yu Z, Jin F, Hu J, Zhang X, Sun J, Yang M. An improved meth- od for analyzing chlormequat and mepiquat in source waters by solid-phase extraction and liquid chromatography-mass spectrometry. Anal Chim Acta. 2010. 678:90-95
Zhao Y, Lazou K, Schelfaut M, De Reu L, Sandra P. Determina- tion of chlormequat residues in pears and pear concentrates by benchtop LC-ESI-MS. Chromatographia. 2000. 51:531-535.
