대나무 왕대 오일의 향균 활성
김 형 진*, 최 문 희**, 신 현 재*,†
*,†조선대학교, 생명화학고분자공학과
**조선대학교 산업기술창업대학원, 미용향장학과
Antimicrobial Activity of Phyllostachys bambusoides Oil Hyeong-Jin Kim*, Moon-Hee Choi
**, Hyun-Jae Shin
*,†
*,†Department of Biochemical and Polymer Engineering, Chosun University, Gwangju, Korea
**Department of Beauty and Cosmetology, Graduate School of Industrial Technology Startup, Chosun University, Gwangju, Korea
(Received : Oct. 31, 2020, Revised : Nov. 23, 2020, Accepted : Dec. 21, 2020)
Abstract : Antibacterial activity of bamboo (Phyllostachys bambusoides) oil (BO) was investigated for two types of gram-positive, gram-negative, and antibiotic-resistant bacteria to determine the possibility of its use as a preservative. Disc diffusion method and minimum inhibitory concentration (MIC) assay were used for the evaluation of the antibacterial activity. BO showed antibacterial activity for all strains, with relatively better antibacterial activity for Bacillus subtilis, Escherichia coli, and Salmonella typhimurium. The results of the disc diffusion method for these three strains showed widths of 1.5 to 25.9 mm, 16.1 mm, and 32.3 mm, respectively, and minimum inhibitory concentrations of 0.2, 0.4, and 0.2%, respectively.
These results suggest that the BO is valuable as a plant-derived antimicrobial resource.
Keyword : bamboo oil, antimicrobial activity, bacteria, antibiotic-resistant bacteria
1. 서 론
1)
대나무는 벼과(Poaceae)에 속하는 상록성 식물로 세계적으로 1,200여 종이 있고 아열대, 열대 및 온대 지방까지 다양하게 분포하고 있다. 우리나라에 자생 하고 있는 대나무류는 왕대, 솜대, 맹종죽, 조릿대 등 5속 19종이 있으며, 국내에는 남부지역의 전라남·북도, 경상남·북도 지역에 분포 면적이 대부분을 차지하고 있고 이외 강원도, 충청남도의 해안지방, 그리고 제주 도의 일부 지역에도 분포하고 있다[1]. 대나무는 예로 부터 고혈압, 중풍, 발한, 등의 치료에 활용되어왔으며, 방부 기능을 가지고있는 것으로 전해진다. 또한 대나
†Corresponding Author 성 명 : 신 현 재
소 속 : 조선대학교 생명화학고분자공학과 주 소 : 광주 동구 필문대로 309 조선대학교 전 화 : 062-230-7518
E-mail : [email protected]
무의 수액으로 알려진 죽력은 솜대나 왕대의 줄기를 약한 불로 열을 가할 때 생기는 맑은 즙액으로 중풍, 발열, 기침, 등에 효능이 있는 것으로 알려져 있다[2].
대나무에서 추출한 Essential Oil (EO)은 음식의 향신 료, 의약외품 등의 용도에 있어 항산화제, 체내 자유라 디칼 제거, 항균제 등에 대한 용도로 사용되고 있다 [3]. Bamboo oil (BO)의 Gas Chromatography-Mass Spectrometry (GC-MS)로 분석한 결과 41가지 화합 물이 확인되었고, Amino acid인 dl-alanine, gluconic acid 그리고, phosphoric acid와 hexadecanoic acid, phytol, pentacosane 같은 화 합물이 주요 화학성분으로 인해 항산화 활성이 높고, Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Esche richia coli, Saccharomyces cerevisiae 균에 대한 최소저해농도가 최대 0.56 mg/mL으로 보고된 바 있 으며, Candida와 같은 곰팡이에 대한 BO의 항균 활 성이 1.65-2.88 v/v% 인 것으로 보고되었다[4-6].
한편 항생제 내성균은 과거 1980년대 우리나라에 메티실린 내성 포도상 구균(methicillin-resistant S.
aureus, MRSA)의 발생이 보고되었으며, 이 MRSA는
메티실린뿐 아니라 암피실린(Ampicillin), 나프실린 (Nafcillin) 등의 거의 모든 항생제에 내성을 지니고 있어 항생제의 사용이 제한되었다[7].
기존 연구에서는 대나무의 열수 추출, 죽력, EO, ethanol 추출물 등에서 항균 활성과 항산화 활성 등을 보인다는 점이 확인되었다[8-12]. 또한 그람 양성균 (gram positive bacteria)인 Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus 등과 그람 음성균(gram negative bacteria)인 Escherichia coli, Salmonella typhimurium 등의 균주에 대한 조릿대 줄기와 잎의 열수 및 에탄올 추출물의 항균 활성, 항 산화 활성 등의 연구를 진행한 바 있고 의약품으로 사 용되는 항생제에 내성이 있는 항생제 내성균 (Antibiotic-resistant bacteria)에 대한 bamboo oil(BO)의 항균 활성에 관한 연구는 보고된 바가 없고 왁스 성분이 풍부한 죽순에서 추출한 BO에 관한 항균 활성 연구는 부족하다[13].
따라서 본 연구에서는 기존 BO에 대한 항곰팡이, 항균 활성에 관한 연구에서 더 나아가 그람 양성균, 그람 음성균, 항생제 내성균과의 항균 활성을 disc diffusion 방법과 최소저해농도를 구하여 비교하고 항 생제를 대체하여 사용할 수 있는 식물유래 천연 추출 물로서 대나무오일의 항균 자원 사용 가능성에 대해 조 사하였다.
2. 실험재료 및 방법
2.1 대나무 오일
본 실험에서 사용한 대나무 오일(bamboo oil, BO), (RV Essential, New Delhi, India)은 아마존 시약 구매사이트에서 구매하였으며, 대나무 종류는 왕대 (Phyllostachys bambusoides)로 확인이 되었다. 오일 추출 부위는 죽순이었으며 수증기 증류법을 사용하여 오일을 추출하였다.
2.2 사용 균주 및 균주 배양
본 실험에 사용된 균주는 그람 양성균 2종 한국미생물 보존센터(Korean Culture Center of Microorganisms) 에서 분양받았으며, Bacillus subtilis는 (KCCM 11316), Staphylococcus aureus (KCCM 11764), 그람 음성균 2종 Escherichia coli (KCCM 12119), Salmonella typhimurium (KCTC 1926)은 한국생 명공학연구원 생물자원센터에서 분양받았다. 항생제 내성균 2종 Staphylococcus aureus (CCARM 3108), Escherichia coli (CCARM 1229)를 사용하였다.
배양에 사용된 배지는 Nutrient broth (NB)를 사용 하였고 NB를 100 mL씩 제조하여 121℃, 1.5기압 하에서 15분간 autoclave로 멸균 후 clean bench 에서 각각의 균을 접종하여 incubator에서 37℃, 조건으로 배양하였다. 모든 균주는 (1×107 CFU/mL) 농도로 일정하게 조절하여 사용하였으며 3회 반복 수행되었다.
2.3 디스크 확산법(disc diffusion method)
대나무 오일의 미생물에 따른 항균활성을 조사하기 위하여 Balouiri[14]의 방법을 토대로 disc diffusion method를 이용하여 수행되었다. 항균 활성의 양성, 음성 대조군으로 positive control (0.025 mg/mL ampicillin), negative control (n-Hexane)를 사용 하였고, 농도를 달리한 시료(0.5, 1, 1.5, 2, 2.5 v/v%)를 paper disc에 100 μL씩 흡수시키고 건조하 여 보관하였다. Petri dish에 121℃, 1.5기압 하에서 15분간 autoclave로 멸균처리한 NA (Nutrient Agar) 를 25 mL씩 분주하여 평판배지를 만들고 각각의 균 을 200 μL 접종하고 도말 한 후 냉장 보관 중인 paper disc를 positive control, negative control과 함께 농도별로 처리하여 incubator에서 24시간 성장시 킨 후, paper disc 주위의 저해 넓이(Clear zone)를 측정하였다.
2.4 최소저해농도(Minimum Inhibitory Concentration, MIC) 측정
MIC시험은 Elshikh[15], Grela[16], Perumal[17]의 방법을 부분 이용하여 micro plate에서 수행되었다.
3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5 diphenyltetrazoli um bromide (MTT)를 멸균수에 0.5 mg/mL로 희석 하여 제조하고, 100% BO는 10% Dimethylsulfoxide (DMSO, v/v) + 0.5% Tween 80 용액으로 두 배 희석법으로 희석하여 제조하였다. 96 well에 순서대로 NB를 50 μL씩 분주하고 농도별로 희석된 시료를 100 μL씩 분주하였다. 배양된 균 B. subtilis, S. aureus, E. coli, S. typhimurium, 항생제 내성균 S. aureus, E.coli를 순서대로 50 μL씩 접종하였다. 24시간 배양 후 0.5 mg/mL MTT 50 μL를 각 well에 분주해 30 분간 발색반응을 진행하였다. 색 변화의 정도에 따라 균의 성장을 파악하였고 색 변화가 없는 마지막 농도를 최소저해농도로 하였다.
3. 결과 및 고찰
3.1 디스크 확산법 실험 결과
본 실험의 디스크 확산법 결과는 사용 균주별로 그람 양성균은 Table 1, 그람 음성균은 Table 2, 항생제 저항균은 Table 3, Figure 1.에 각각 나타내 었다. B. subtilis를 제외한 모든 균주는 BO 0.5%의 농도에서 항균 활성을 보이지 않았으나 B. subtilis는 0.5% 농도에서 약 10.2 mm의 저해 환을 나타내었고 S. aureus는 1% 농도에서 약 10.3 mm의 저해 환을 나타내었다. Positive control은 B. subtilis에서 약 31.8 mm의 저해 환을, S. aureus에서 약 32.8 mm의 저해 환을 나타내었다.
Table 1. Antimicrobial activities of Gram positive bacteria from bamboo oil
Concentration (%) Clear zone (mm) B. subtilis S. aureus
0.50 10.2±0.5 -
1.00 11.8±0.4 10.3±0.6
1.50 21.7±1.2 14.9±1.2
2.00 25.9±1.1 24.9±1.2
2.50 29.2±2.1 31.8±1.8
Positive 31.8±2.2 32.8±2.2
Negative - -
E. coli는 BO 1.5% 농도에서 약 13.2 mm의 저해 환을, S. typhimurium은 1% 농도에서 약 11.1 mm 의 저해 환을 나타내었고 positive control은 E. coli 에서 약 22.4 mm의 저해 환을, S. typhimurium에 서 약 31.2 mm의 저해 환을 나타내었다.
Table 2. Antimicrobial activities of gram negative bacteria from bamboo oil
Concentration (%) Clear zone (mm) E. coli S. typhimurium
0.50 - -
1.00 - 11.1±0.4
1.50 13.2±0.7 18.1±1.1
2.00 22.7±1.2 32.3±1.3
2.50 26.5±1.2 35.1±2.3
Positive 22.4±1.3 31.2±1.8
Negative - -
이는 B. subtilis와 S. aureus에 비해 E.coli가 BO에 대해 항균 활성이 낮다는 Wintola[18]의 연구 와 일치 하였지만, S. typhimurium이 항균 활성이 존재하지 않았다는 보고와는 다르게 1.5%, 2% 농도 에서 가장 큰 저해 환을 나타내었다. 또한 Lee[10]에 의하면 BO에 의한 항균 활성은 S. aureus보다 E.
coli에서 290-800% 정도 큰 항균 활성이 나타나 그 람 음성균에 대한 항균 활성이 대체적으로 클 것으 로 보고하였는데 이는 대나무 종류와 추출 방법, 실 험 방법에 의한 차이로 생각된다.
항생제 저항균인 S. aureus와 E. coli는 모두 0.5%와 1% 농도에서는 항균 활성이 측정되지 않았다.
S. aureus 1.5% 농도에서 약 12.4 mm의 저해 환을 나타내었고 E. coli는 1.5% 농도에서 약 9.8 mm의 미세한 수준의 저해 환을 나타내었다.
Table 3. Antimicrobial activities of Antibiotic-resistant bacteria from bamboo oil Concentration (%) Clear zone (mm)
S. aureus E. coli
0.50 - -
1.00 - -
1.50 12.4±0.4 9.8±0.2
2.00 18.2±0.9 16.1±0.4
2.50 19.8±0.9 20.1±0.5
Positive 23.1±1.1 20.5±0.3
Negative - -
E. coli에서 약 22.4 mm의 저해 환을, S.
typhimurium 에서 약 31.2 mm의 저해 환을 나타내 었고, 항생제 내성균 S. aureus에서 약 23.1 mm의 저해 환을, E. coli에서 약 20.5 mm의 저해 환을 나타내었다. Negative control인 n-hexane은 모든 bacteria 균주에 대해서는 저해 능이 나타나지 않았다 (Figure 1).
Figure 1. Result of antibiotic-resistant bacteria S.
aureus and E. coli, clear zone area. A; BO 0.5 %, B; BO 1.0 %, C; BO 1.5 %, D; BO 2.0 %, E; BO 2.5 %, F;
Ampicillin 25 μg/mL, G; n-Hexane.
3.2 최소저해농도 실험 결과
MIC 시험 결과 그람 양성균, 그람 음성균과 항생제 내성균의 실험결과를 각각 Table 4, 5, 6에 나타내었 다(Figure 2).
Figure 2. MIC assay result for six strains of bacteria on microplate. A; B. subtilis, B; S. aureus, C; E. coli, D;
S. typhimurium, E; Antibiotic-resistant bacteria S. aureus, F; Antibiotic-resistant bacteria E. coli, Length; different
concentrations of BO
B. subtilis는 0.2% 이상에서 항균 활성을, S.
aureus는 0.79% 이상에서 항균 활성을 보였다. B.
subtilis와 S. typhimurium 두 균주가 0.2% 이상에 서 항균활성을 보이는 등 비교적 낮은 농도에서 BO에 대해 가장 높은 항균 활성을 보였으며 항생제 내성균 인 S. aureus와 E.coli는 0.4% 이상에서 항균활성을 나타내었다.
Table 4. Minimum inhibitory concentrations of bamboo oil on Gram positive bacteria
Concentration (%) B. subtilis S. aureus
50.00 - -
25.00 - -
12.50 - -
6.25 - -
3.18 - -
1.59 - -
0.79 - -
0.40 - ++
0.20 - ++
0.10 + ++
Symbols ; ++ : growth, + : weak growth, - : no growth
Tao[19, 20]의 연구에서 B. subtilis와 E. coli에서 2.25 mg/mL에서 높은 항균 활성이 나타났다고 보고 한 결과와 일치하였다. 또한 이는 Shirotake[21]의 연 구 결과와 유사한데 일본 대나무 중 하나로 얼룩 조릿 대인 Kumazasa bamboo(Sasa·Veitchii)에 대한 MRSA 항균 활성 시험 결과 0.8-6.3%의 농도에서 강 한 항균 활성을 보여주었다.
Table 5. Minimum inhibitory concentrations of bamboo oil on Gram negative bacteria Concentration (%) E. coli S. typhimurium
50.00 - -
25.00 - -
12.50 - -
6.25 - -
3.18 - -
1.59 - -
0.79 - -
0.40 - -
0.20 + -
0.10 + +
Symbols ; ++ : growth, + : weak growth, - : no growth
또한 실론시나몬(Cinnamomum zeylanicum), 베틀 후추(Piper betle), 자메이카 후추(Pimenta dioica)의 EO는 E. coli, K. pneumonia, P. aeruginosa, P. vulgaris, S. aureus, P. acnes, S. peroris 등의 균주에 대하여 0.25-8 mg/mL 사이의 항균 활성을 보였으며[22], 동백 EO는 S. mutans, Lactobacillus casei, Malassezia pachyde rmatis, Malassezia furfur, B. cereus, S. aureus의 균주에 대해 최대 20μL 농도에서 항균 활성이 있는 것으로 보고되었는 데[23], 추출물의 종류는 다르지만 EO의 농도를 비교 했을 때 본 실험에서 사용한 BO의 항균 활성이 더 효 과적이라고 볼 수 있고, Soumya[6]에 의해 보고된 BO의 GC-MS 분석에서 linoleic acid, methyl salicylate가 38.37%, 15.35% 포함되었고, Candida albicans, Candida tropicalis, 그리고 Candida Pyrididakrusei와 같은 곰팡이 균종에 대해 1.65-2.88 v/v%의 강한 항진균 활동을 보였으므로 이 결과로 미루어 볼 때 BO를 방부 물질로 사용하여 효과를 기대 할 수 있다.
Table 6. Minimum inhibitory concentrations of bamboo oil on Antibiotic-resistant bacteria Concentration (%) S. aureus E. coli
50.00 - -
25.00 - -
12.50 - -
6.25 - -
3.18 - -
1.59 - -
0.79 + -
0.40 + -
0.20 ++ +
0.10 ++ +
Symbols ; ++ : growth, + : weak growth, - : no growth
4. 결론
대나무 왕대(P. bambusoides) 오일을 이용하여 그 람 양성균 2종과 그람 음성균 2종, 그리고 항생제 내 성균 2종에 대한 항균 활성을 조사하고 식물유래 천연 추출물로서 대나무 오일의 방부 물질 사용 가능성에 대해 연구하였다. 본 연구에서 대나무 오일은 모든 균 주에 대해 항균 활성을 보였고 그 중 B. subtilis, E.
coli, S. typhimurium에서 비교적 우수한 항균 활성 을 보였다. 위의 3가지 균주에 대한 디스크 확산법의 저해 넓이는 2.0% 에서 25.9 mm, 16.1 mm, 32.3 mm 이고, MIC 결과는 0.2, 0.4, 0.2%으로 확인되었 다. 또한 Positive control과 비교했을 때 대부분 2.5% 농도에서는 항균 활성이 유사하거나 그 이상의 저해환(Clear zone)을 나타냈다. 따라서 대나무 왕대 (P. bambusoides) 오일의 식물유래 항균 자원으로서 활용도가 높을 것으로 판단된다.
감 사
본 연구는 산림청(한국임업진흥원) 산림과학기술 연구 개발사업´(2020262D10-2022-AC02)´의 지원에 의하여 이루어진 것입니다.
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