Research Paper

http://dx.doi.org/10.7841/ksbbj.2019.34.4.267 ISSN 1225-7117 / eISSN 2288-8268

다양한 배양조건에 따른 Lactobacillus plantarum BG0001 배양액의 항균활성

박동민¹, 강경곤¹, 권덕호¹, 박재범¹, 양병근², 하석진¹*

Antibacterial Activity of Lactobacillus plantarum BG0001 Culture Broth Depending on Various Fermentation Conditions

Dong-Min Park¹, Kyoung-Gon Kang¹, Deok-Ho Kwon¹, Jae-Bum Park¹, Byung-kun Yang², and Suk-Jin Ha¹*

Received: 2 December 2019 / Revised: 18 December 2019 / Accepted: 19 December 2019

© 2019 The Korean Society for Biotechnology and Bioengineering

Abstract: Lactic acid bacteria (LAB) has been known to produce various antimicrobial agents such as bacteriocin which causes cell growth restriction or death. LAB having antimicrobial activity was isolated and identified as Lactoba- cillus plantarum BG0001. The culture broth of L. plantarum BG0001 exhibited antimicrobial activity against the both of gram positive (Bacillus cereus, Staphylococcus aureus) and negative (Escherichia coli, Vibrio parahaemolyticus, Salmo- nella typhimurium) strains by paper disc diffusion assay.

Since the optimization of fermentation conditions could pro- mote antimicrobial activity, we compared the antimicrobial activity of L. plantarum BG0001 culture broth depending on fermentation temperatures. When L. plantarum BG0001 was fermented at 30^oC, the lowest minimum inhibited concentra- tion (9.92 mg/mL) was shown as compared to those from 32, 35, 37^oC. When 100 mL/L of molasses and 80 mL/L of corn steep liquor (CSL) were used instead of MRS medium, the minimum inhibited concentration (MIC) was 17.36 mg/L which suggesting molasses and CSL could be used for the fer- mentation of L. plantarum BG0001 as an alternative fermen- tation medium.

Keywords: bacteriocin, Lactobacillus plantarum, molasses, corn steep liquor

1. INTRODUCTION

유산균이란 유기산 (organic acid)의 한 종류인 젖산 (lactatic acid)을 생산하는 미생물로 사람의 체내뿐만 아니라 동물과 식물에 널리 분포하고 있다 [1]. 고대 식생활에서 유산균은 발효식품의 발효종으로써 식품의 맛과 향기를 증진시키는 목적으로 많이 이용되어 왔다 [2]. 과학기술의 발달과 함께 미생물 또한 많은 연구와 발전이 이뤄졌으며, 그 중 유산균 은 저분자 항균물질로 알려진 박테리오신 (Bacteriocin)을 생 산하는 것으로 알려져 있다 [3-5].

현재 사용되는 항균제는 미생물의 발육억제와 살균작용 을 하는 항균물질, 천연 항균제의 구조를 변화시켜 만든 반 합성 (semi-synthetic) 항균제 그리고 화학적인 합성을 통해 만들어진 화학요법제가 사용되고 있다 [6]. 미생물의 리보 솜 (ribosome)에서 생합성되는 박테리오신은 주로 단백질 (peptide 또는 protein)로 이루어져 있으며, 식중독 세균으로 알려진 Bacillus cereus 균을 포함한 병원성 세균의 세포표면 에 부착하여 세포벽 합성을 저해하거나 단백질 합성을 억제 하여 결국 세균 세포를 사멸시키는 역할을 한다 [5, 7-11]. 이 러한 특성을 지닌 박테리오신은 천연물질이며 단백질로 이 루어져있기 때문에 인체에 무해하다는 가장 큰 장점을 가지 고 있다. 그리고 유전자 조작 및 배양조건의 최적화 등의 산 업화 과정을 거쳐 원활한 균주 배양과 대량 생산으로 더 많은 항균물질을 생산할 수 있다 [12-14]. 또한 천연 항균제는 화학

1강원대학교 생물공학과

1Department of Bioengineering and Technology, Kangwon National University, Chuncheon 24341, Korea

Tel.: 82-33-250-6278, Fax: 82-33-243-6350 e-mail: [email protected]

2㈜비오지노키

2Biogenoci Co., Ltd., 89 Seoho-ro, Gwonseon-gu, Suwon 16614, Korea

Research Paper

적 합성으로 만드는 항균제보다 독성이 낮으며, 생산과 이용 이 쉽다는 장점도 가지고 있다 [15-18]. 특히 Lactobacillus plantarum 균주는 plantaricin이라는 이름의 박테리오신을 생 산하는 유산균으로 잘 알려져 있다 [19-21].

본 연구에서는 항균능력을 띄는 유산균인 L. plantarum BG0001을 이용하여 다양한 항균능력을 확인하기 위한 연구 를 수행하였으며 또한 산업적인 대량생산을 위하여 배지 최 적화와 이에 따른 항균력의 변화를 확인하기 위한 연구를 수 행하였다.

2. MATERIALS AND METHOD

2.1. 균주 및 배양 조건

본 연구에 사용된 유산균은 발효식품에서 분리된 L. plantarum BG0001균주를 사용하였다. 전 배양은 Lactobacilli MRS 배 지 (Difco Laboratories, Detroit, Mich.)를 사용하였으며 30^oC 와 200 rpm 조건에서 24시간 동안 배양하였다. 본 배양은 전 배양 후에 배양액의 흡광도를 OD600 1.0으로 조정하여 새로 운 Lactobacilli MRS 액체배지에 1% 비율로 접종하여 실험 하였다. 교반속도 100 rpm의 조건에서 배양 온도를 30, 32, 35, 37^oC로 달리하여 배양을 진행하였다.

2.2. L. plantarum BG0001 배양액의 항균활성 확인 L. plantarum BG0001 배양액의 항균 활성을 확인하기 위해

paper disc diffusion assay 방법 [22]을 변형하여 실시하였다. 총 6 종류의 미생물 (Bacillus cereus, Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Vibrio parahaemolyticus, Salmonella typhimurium, Saccharomyces cerevisiae)을 각각 LB 또는 YPD 액체 배지에 서 24시간 동안 전 배양한 후, 새로운 고체 배지에 도말하였 다. 도말된 고체 배지에 24시간 동안 MRS 배지에서 배양한 L. plantarum BG0001의 배양액을 원심분리 후 상등액을 동 결건조를 통해 10배 농축하여 LB 고체 배지 위의 직경 0.5 cm의 paper disc에 50 µL씩 분주한 후 37^oC에서 배양하며 저 해환의 생성 정도를 비교하였다.

최소 저해농도 (minimum inhibitory concentration, MIC) 측 정을 위하여 L. plantarum BG0001 배양액을 동결건조하여 건조중량을 측정하였다. Paper disc diffusion assay에 사용된 5종류의 미생물을 각각 LB, YPD, MRS 등의 액체 배지에서 24시간 동안 전 배양한 후, 새로운 액체 배지에 접종하고, 동 결건조한 L. plantarum BG0001 배양액을 적당한 농도로 희 석한 후각각의 배지에 서로 다른 농도로 첨가하여 농도에 따 른 5종류의 미생물의 성장 정도를 비교하였다.

2.3. 발효기를 이용한 유산균 발효 방법

발효기를 이용한 L. plantarum BG0001의 배양을 위해 MRS 배지를 사용하여 30^oC와 200 rpm 조건에서 24시간 전 배양 을 실시한 후 멸균수로 2 회 세척하여 접종하였다. 발효기는 바이오트론의 2.5 L 발효기 (BioTron, Republic of Korea)를 사용하였으며 초기 OD600는 1.0으로 하였다. 배양온도, 교반

Fig. 1. Results of paper disc diffusion assay using culture medium by L. plantarum BG0001 against B. cereus (A), E. coli (B), S. aureus (C), V. parahaemolyticus (D), S. typhimurium (E), or S. cerevisiae (F).

속도와 통기조건은 각각 30^oC, 300 rpm, 0.5 vvm이며 12시간 간격으로 시료를 취하여 분석하였다.

2.4. 대사산물 분석

유산균의 성장은 흡광광도계 (Biomate 5, Thermo, NY, USA) 를 사용하여 600 nm 파장에서 흡광도를 측정하여 분석하였 다. 자일로스, 자일리톨, 에탄올 등은 고성능 액체 크로마토 그래피 (HPLC 1200 series, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)를 이용하여 분석하였으며, 사용된 컬럼은 Rezex ROA-Organic acid H+ (Phenomenex, Torrance, CA, USA)를 사용하였다. 컬럼과 refractive index detector의 온도는 50^oC 를 유지하였으며, 0.6 mL/min의 유속으로 0.005 N의 황산용 액을 이동상으로 사용하였다.

3. RESULTS AND DISCUSSION

3.1. L. plantarum BG0001 배양액의 미생물에 대한 항균 활성 확인

다양한 그람 양성 또는 그람 음성 세균에 대한 L. plantarum BG0001 배양액의 항균활성 존재 여부를 먼저 간략하게 확 인하였다. 총 6종류의 미생물 (B. cereus, E. coli, S. aureus, V.

parahaemolyticus, S. typhimurium, S. cerevisiae)을 각각 액체 배 양배지에서 전 배양한 후 이들에 대한 L. plantarum BG0001 배양액의 항균활성을 paper disc diffusion assay 방법을 통해 확인하였다. 농축된 L. plantarum BG0001의 배양액을 LB 고 체배지 위의 직경 0.5 cm의 paper disc에 50 µL씩 분주한 후 37^oC에서 배양하며 저해환의 생성 정도를 비교하였다. 세균 류인 B. cereus, E. coli, S. aureus V. parahaemolyticus, 그리고 S. typhimurium의 경우엔 L. plantarum BG0001 배양액에 의 해 각각 17, 16, 15, 18, 18 mm 직경의 clear zone이 확인되어 세균류의 성장이 저해되는 결과를 확인 할 수 있었다. 특히 그람 양성균 (B. cereus, S. aureus)과 그람 음성균 (E. coli, V.

parahaemolyticus, S. typhimurium)에 대해 모두 항균력을 확 인 할 수 있었다. 하지만 진핵세포인 효모 (S. cerevisiae)에 대 해서는 전혀 항균활성이 나타나지 않았다(Fig. 1).

좀더 정확한 항균활성을 비교하기 위해 L. plantarum BG0001 배양액을 이용하여 최소 저해농도 (minimum inhi- bitory concentration, MIC) 측정을 하였다. 사용된 균주는 그 람 양성균 (S. aureus)과 그람 음성균 (E. coli) 그리고 효모 (S.

cerevisiae)가 각각 사용되었다. 그람 양성균인 S. aureus의 경 우 L. plantarum BG0001의 배양액이 6.39 mg/mL의 농도로 첨가되었을 경우 첨가하지 않은 음성대조군에 비해 균체의 성장이 20% 감소하였으며 12.79 또는 19.18 mg/mL의 L.

plantarum BG0001의 배양액이 각각 첨가되었을 경우에 균 체의 성장이 각각 76%, 86% 저해를 받는 것을 확인할 수 있 다(Fig. 2(A)). 따라서 L. plantarum BG0001 배양액의 B.

cereus에 대한 최소 저해농도는 19.18 mg/mL라고 판단된다.

E. coli의 경우 L. plantarum BG0001의 배양액이 6.39 mg/mL

의 농도로 첨가되었을 경우 균체의 성장에 저해를 받지 않았 으나 12.79 mg/mL의 농도로 첨가되었을 경우에 균체의 성장 이 90% 저해를 받는 것을 알 수 있다(Fig. 2(B)). 따라서 L.

plantarum BG0001 배양액의 E. coli에 대한 최소 저해농도는 12.79 mg/mL라고 판단된다. 효모인 S. cerevisiae의 경우엔 paper disc diffusion assay 방법의 결과와 마찬가지로 최소 저 해농도를 확인할 수 없었다(Fig. 2(C)). L. plantarum BG0001 의 배양액의 농도가 각 미생물의 최소 저해농도 보다 증가함 에 따라 균체의 성장이 소폭 증가하는 이유는 동결건조를 통 하여 배양액을 농축하는 과정에서 유산균 배양액의 영양성 분이 동시에 농축되어 균체의 성장을 촉진시킨 것으로 사료 된다.

3.2. 배양 온도에 따른 항균활성 비교

L. plantarum BG0001의 배양온도를 각각 30, 32, 35, 그리 Fig. 2. Evaluation of MIC using culture medium by L. plantarum BG0001 against B. cereus (A), E. coli (B), or S. cerevisiae (C).

고 37^oC로 달리하여 250 mL flask에서 MRS 배지를 이용하 여 24시간 동안 발효를 수행한 후 배양액을 이용하여 L.

plantarum BG0001의 성장 정도를 흡광도 (OD600)를 이용하 여 비교하였다. Table 1의 결과와 같이 30-37^oC의 배양온도 조건에 따른 L. plantarum BG0001의 성장 정도는 큰 차이를 나타내지 않았다. 다만 37^oC의 배양온도 조건에서 흡광도는 5.04로 가장 낮은 값을 나타내었다. 항균활성의 차이를 비교 하기 위하여 B. cereus를 대표균주로 각 온도 별 paper disc diffusion assay를 수행했으나, 이 역시 큰 차이를 확인하지 못하였다(data not show). 온도조건에 따른 항균활성의 정확 한 비교를 위해 발효기를 통해 30^oC와 37^oC 두 가지 온도조 건에서 L. plantarum BG0001을 각각 배양한 후 균체의 성장 정도와 배양액의 최소 저해농도를 확인하고 비교하였다.

온도조건에 따른 L. plantarum BG0001의 성장을 먼저 비 교하면 flask 배양 결과와 마찬가지로 37^oC의 경우에 비해 30^oC의 온도조건에서 균체의 성장이 소폭 증가하였다 하지 만 유의적인 큰 차이를 확인할 수 없어 배양 24시간의 배양

액을 이용하여 최소 저해농도 확인 실험을 수행하였다. Fig. 3 에서 30^oC와 37^oC 각각의 온도조건에서 발효한 L. plantarum BG0001의 배양액은 B. cereus 균주에 대한 항균활성의 큰 차 Fig. 3. Evaluation of MIC using culture medium by L. plantarum BG0001 depending on temperatures, 30^oC (■) and 37^oC (■) against B. cereus.

Table 1. Comparisons of cell growths depending on culture temperatures by measuring optical density of L. plantarum BG0001

Culture Temperatures (^oC) 30 32 35 37

Optical Density (OD600) 5.43 ± 0.40 5.23 ± 0.33 5.39 ± 0.41 5.05 ± 0.45

Fig. 4. Comparisons of fermentation results by L. plantarum BG0001 using 100 mL/L of molasses and various concentrations of CSL.

The concentration of CSL were 60 (A), 80 (B), 100 (C), and 120 (D) mL/L. Symbols; glucose (), lactate () and OD600 ().

이를 나타내고 있음을 알 수 있다. 30^oC 온도조건의 배양액 을 7.44 mg/mL을 첨가한 경우 B. cereus의 성장이 약 39% 가 량 저해를 받았으며, 9.92 mg/mL을 첨가한 경우 약 95% 가 량 저해를 받아 최소 저해농도는 9.92 mg/mL로 판단된다. 이 에 비해 37^oC 온도조건의 배양액의 경우엔 배양액의 농도가 12.40 mg/mL에서 B. cereus의 성장이 약 64% 가량 저해를 받 았으며 14.88 mg/mL의 농도에서 균체의 성장이 약 94% 가 량 크게 저해를 받는 것을 알 수 있다. 따라서 37^oC 온도조건 에서 배양한 L. plantarum BG0001 배양액의 B. cereus 균주 에 대한 최소 저해농도는 14.88 mg/mL라고 판단된다. 결과 적으로 30^oC 온도조건에서 발효를 수행한 L. plantarum BG0001의 배양액이 37^oC 온도조건에서 발효를 수행한 경우 에 비해 보다 낮은 최소 저해농도를 나타내는 것을 알 수 있다.

3.3. 산업용 배지를 이용한 L. plantarum BG0001의 배양 및 항균활성 확인

최근 Enterococccus mundtii 또는 Pediococcus pentosaceus 등 의 유산균 배양을 위해 산업용 배지인 당밀 (molasses) 또는 옥수수침지액 (corn steep liquor, CSL)이 이용되었다는 보고 가 있다 [23, 24]. 따라서 L. plantarum BG0001의 대량 배양 을 위해 MRS 배지를 당밀 또는 CSL로 대체하기 위한 시도 를 하였다. 당밀은 glucose를 다량 함유하고 있으므로 탄소 원의 대체를 위해 주로 사용되고 옥수수침지액은 질소원의 대체를 위해 주로 사용되었다. 따라서 초기 glucose의 농도 를 약 20 g/L로 맞추기 위해 당밀의 농도는 100 mL/L로 고정 하였으며 옥수수침지액의 농도를 60, 80, 100, 120 mL/L로 달리하여 유산균의 성장과 이에 따른 배양액의 항균력을 확 인하였다. Fig. 4의 결과와 같이 질소원인 옥수수침지액의 농 도가 증가할수록 glucose의 소비속도가 소폭 증가하는 것을 알 수 있으며 생성되는 lactate의 농도도 옥수수침지액의 첨 가농도의 증가와 함께 점진적으로 증가하고 있음을 알 수 있 다. 각각의 배양액을 이용하여 paper disc diffusion assay를 통해 B. cereus 균주에 대한 항균력을 확인한 결과 36시간 배 양액을 사용한 경우 모든 실험구에서 저해환이 확인되었으 며 저해환은 옥수수침지액을 80 mL/L의 농도로 첨가한 경우 가 다른 실험구에 비해 다소 증가하였음을 확인하였다. 따라 서 당밀과 옥수수침지액을 각각 100 mL/L와 80 mL/L의 농 도로 첨가하여 발효기를 통해 배양을 수행한 후 최소 저해농 도 확인 실험을 수행하였다. Fig. 5(A)의 결과와 같이 발효기 에서 glucose의 소비 속도는 더욱 증가하여 24시간에 모두 소비하였으며 이때 균체의 OD600는 13.94이고 생성된 lactate 의 농도는 20.20 g/L이었다. 배양액의 최소 저해농도를 측정 한 결과 배양액의 농도가 증가할수록 B. cereus 균주의 성장 이 점진적으로 저해를 받다가 17.36 mg/L의 농도로 첨가하 였을 경우 B. cereus 균주의 성장이 약 85% 가량 저해 받는 것 을 확인하였다(Fig. 5(B)). 따라서 산업용 배지인 당밀과 옥 수수침지액을 이용한 배지조건에서도 L. plantarum BG0001 배양액의 항균력을 확인하여 산업적 대량생산에 적용할 수 있을 것으로 사료된다.

4. CONCLUSION

항균능력을 나타내는 L. plantarum BG0001의 배양액을 이용 하여 미생물에 대한 항균력을 확인한 결과 그람 양성균과 음 성균 모두에 대한 항균력을 가지고 있음을 확인하였다. 배양 온도에 따른 항균력을 확인한 결과 30^oC 온도조건의 배양액 이 최소 저해농도 9.92 mg/mL를 나타내어 32, 35, 37^oC의 온 도조건의 경우에 비해 낮은 최소 저해농도를 나타내었다. 대 량생산을 위한 산업용 배지의 사용 가능성을 확인한 결과 당 밀과 옥수수침지액을 사용한 배지를 이용하여 17.36 mg/L의 최소 저해농도를 확인하였다. 이는 MRS 배지에 비해 가격 적인 부분에서 유리한 산업용 배지를 사용한다는 점에서 장 점이라 할 수 있겠다.

Acknowledgements

본 연구는 중소벤처기업부와 한국산업기술진흥원의 “지 역특화산업육성사업(P0006338)”으로 수행된 연구결과 입 니다.

Fig. 5. Fermentation results with 100 mL/L of molasses and 80 mL/L of CSL by L. plantarum BG0001 (A) and evaluation of MIC using culture medium by L. plantarum BG0001 against B.

cereus (B). Symbols; glucose (), lactate () and OD600 ().

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