Neuroprotective Effects of Bee Venom, which Removes High Molecular Elements against $MPP^+$-induced Human Neuroblastoma SH-SY5Y Cell Death

(1)

․교신저자: 이혜정 서울특별시 동대문구 회기동 1번지 경희대학교 한의과대학 경혈학교실 TEL: 02-961-0975 FAX: 02-963-2175 E-mail:[email protected]

MPP ⁺ 로 유도된 SH-SY5Y신경세포 사멸에 대한 고분자성분제거 봉독약침액의 신경보호 효과 연구

배광록¹, 두아름², 김승남², 박지연², 박히준², 이혜정², 권기록³

1경희대학교 동서의학대학원 동서의학과

2경희대학교 한의과대학 경혈학교실, 침구경락과학연구센터

3상지대학교 한의과대학

Neuroprotective Effects of Bee Venom, which Removes High Molecular Elements against MPP

⁺

-induced Human Neuroblastoma SH-SY5Y Cell Death

Kwang-rok Bae¹, Ah-reum Doo², Seung-nam Kim², Ji-yeon Park², Hi-joon Park², Hye-jung Lee², Ki-rok Kwon³

1Dept. of East-West Medical Science, Graduate School of East-West Medical Science

2Dept. of Meridian & Acupuncture, College of Korean Medicine, Kyung-Hee University, Acupuncture and Meridian Science Research Center

3Dept. of Acupuncture & Moxibustion, College of Korean Medicine, Sang-Ji University

ABSTRACT

Objectives :The neuroprotective effects of bee venom (BV) have been demonstrated in many studies, but bee venom has many side effects. So we used sweet bee venom (SBV), which has high molecular elements removed to reduce the side effects.

I examined the neuroprotective effect of sweet bee venom in 1-methyl-4-phenylpyridine (MPP⁺)-induced human neuroblastoma SH-SY5Y cells.

Methods :To observe the possible toxicity of SBV itself, SH-SY5Y cells were treated with SBV in various concentrations for 3 h and MPP⁺in concentrations (1 and 5mM) for 24h. To investigate the protective effect of SBV against MPP⁺toxicity, SH-SY5Y cells were pretreated with vehicle or nontoxic concentrations of SBV for 3h and the cells were not washed, followed by incubation with respective concentrations of SBV and 1 mM MPP⁺for 24h. To investigate the protective effect of SBV against MPP⁺toxicity, SH-SY5Y cells were pretreated with vehicle or nontoxic concentrations of SBV for 3h and the cells were not washed, followed by incubation with respective of SBV(0.5%), 1 mM MPP⁺, 5uM AKT inhibitor(LY984002) and 10uM ERK inhibitor(PD98059) for 24 h. The protective effect was measured by cell viability assay. To investigate the degree of apoptosis, caspase-3 enzyme activity was measured in control, MPP⁺, SBV+MPP⁺.

Results : SBV (0.5%) pretreatment protected the SH-SY5Y cells against MPP⁺-induced apoptotic cell death. The cell viability was higher in the SH-SY5Y cells that were pretreated with vehicle or nontoxic concentrations of SBV than those not pretreated. The caspase-3 activity was lower in the pretreated groups than these not pretreated. ERK and AKT enzymes have a role in the neuroprotective effects of the sweet bee venom.

Conclusions :The results demonstrate that SBV has a protective effect on dopaminergic neurons against MPP⁺toxicity.

This data suggest that SBV could be a potential therapeutic tool for neurodegenerative diseases such as Parkinson's disease(PD).

Key words :

Parkinson's disease(PD), MPTP, MPP+, SBV, Sweet bee venom, SH-SY5Y, caspase-3, ERK, AKT, Apoptosis

Ⅰ. 서 론

파킨슨병(parkinson's disease)은 뇌의 흑색질이

(2)

파괴되면서 신경전달물질 중의 하나인 도파민이 부족해져서 운동완서, 진전, 강직 등의 증상이 생 기는 신경계 퇴행성 질환이다. 파킨슨병은 1817년 James Parkinson이 흔들림성 마비 (shaking palsy) 를 처음으로 기술하였고 1912년 Kinnier wilson에 의하여 추체외로계 질환임을 알게 되었다

¹

. 파킨슨 병의 진단은 위의 세가지 증상 중에서 두가지가 있고 적절한 용량의 레보도파(levodopa)에 대하여 좋은 반응을 보이는 경우 할 수 있으며 병리학적 으로 흑색질의 신경세포의 파괴가 도파민부족으로 인하여 발병한다고 보고 있고 흑질과 일부 특정 뇌간 핵에서 루이체가 존재하는 것이 핵심이다

^2-4

. 이 때 여러가지 병리학적 요소가 중요한 역할을 하게 되는데 mitochondrial dysfunction, exitotoxicity, impaired protein degradation, inflammatory processes, oxidative stress 그리고 apoptosis가 그것이다

^5,6

.

파킨슨병에 관한 연구들은 신경독성을 이용하여 만든 모델에서 주로 수행되고 있는데 catecholamine 성 신경만을 선택적으로 파괴하는 것으로 알려진 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydrophridine(MPTP) 이 널리 사용되며, MPTP는 체내로 흡수되어 뇌혈관 장벽을 통과하고 성상세포에서 monoamin oxidase B(MAO-B)에 의해 1-methyl-4phenylpyrinium(MPP

⁺

) 로 대사되어 기저핵의 흑질에 미토콘드리아의 전 자전달계I (mitochondrial complex I)을 억제하여 세포독성을 통해 도파민신경세포를 손상시킨다

^7,8

.

Bee venom은 살아있는 꿀벌의 독낭 안에 들어 있는 것을 전기 자극 등으로 추출하여 건조한 후, 정제 가공하여 만든 것으로

⁹

면역계를 활성화시키 고 항염증, 세포용해, 신경독효과, 항세균 및 항진 균, 방사선 보호작용이 있는 것으로 알려졌으며 실 험적으로 항염, 진통, 해열, 항경련 등의 효과가 보

고되었다

^10,11

. 그러나 Bee venom에 노출되었을 때

과민한 면역반응이 나타날 수 있고, 특히 치명적인 아낙필락시스 반응은 Bee venom의 임상 사용에 큰 문제가 되고 있다

^12,13

. 그래서 Bee venom의 가 장 큰 allergen인 PLA

2

를 포함한 효소를 제거한 봉

독인 Sweet Bee venom을 개발하였으며 그 정제방 법은 gel filtration chromatography와 propionic acid/urea polyacrylamide gel electrophoresis를 이 용하여 분자량 10,000 이상의 성분을 제거하였다

14,15

. Sweet Bee venom에 관한 연구로는 김 등

¹⁶

의

동일 농도 0.1mg/ml의 Sweet Bee venom과 봉약침 의 퇴행성 슬관절염에 대한 임상연구, 김 등

¹⁷

의 만 성요통환자에 대한 Bee venom과 Sweet Bee venom 의 치료효능 비교연구, 육 등

¹⁸

의 Sweet Bee venom 과 Bee venom이 심박변이도에 미치는 영향, 안 등

19

의 봉독과 Sweet Bee venom의 항균 및 항산화능 비교연구 등이 보고되고 있으나 현재까지 신경세 포손상에 대한 방어효과와 관련된 연구는 거의 행 하여지고 있지 않다.

따라서 본 연구에서는 SBV의 MPP

⁺

로 유도된 신경독성에 미치는 영향과 사포사멸을 방어하는 기전에 대한 연구를 수행하였다.

Ⅱ. 실 험

1. 재 료

MPP+,3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-dipheny ltetrazolium bromide(MTT) assay, Caspase-3 activity assay kit는 Sigma사 (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다. 고분자 성분제거 봉독약침인 SBV는 상지대학교 침구학교실(Gangwon-do, South Korea) 에서 기증받아 사용하였다. Minimum essential medium 과 fetal bovine serum은 Biopharmaceuticals (Deagu, Korea)에서 구입하였다. SH-SY5Y cells는 Korean cell line bank (Seoul, South Korea)에서 구입하였다. AKT (LY984002), ERK (PD98059) inhibitors는 cell signaling (Technology, Inc)에서 구입하였다.

2. 방 법

1) Human neuroblastoma SH-SY5Y 세포 배양

Human neuroblastoma SH-SY5Y 세포는 10%

(3)

fetal bovine serum (FBS)과 100unit/mL penicillin/

streptomycin이 포함하는 minimal essential medium (MEM) 배지를 사용하여 한국세포주은행의 매뉴 얼에 따라 37℃, 95% air 그리고 5% CO

2

항온기에 서 배양하였다. 배지는 2일에 한번 교체하였고, 4-5 일에 한 번씩 계대 배양을 하였다. 그리고 SH-SY5Y cell은 6~12 passage를 사용하였다

2) Human SH-SY5Y neuroblastoma cells에 Sweet bee venom의 처치

SH-SY5Y 세포에서 Sweet bee venom(SBV)과 MPP

⁺

의 농도별 세포생존율(cell viability)을 측정 하기위해 MTT assay를 진행하였다. SBV 자체의 독성을 알아보기 위해 SH-SY5Y cell에 10% SBV 를 0, 0.1, 0.25, 0.5, 1, 2.5, 5%의 농도로 3시간동안 처치하였고 MPP

⁺

는 1, 5 mM의 농도로 24시간 동 안 처치하였다. MPP

⁺

독성에 대한 SBV의 세포 보 호효과를 알아보기 위하여, SH-SY5Y cell에 1mM MPP

⁺

를 처치하기 3시간 전에 SBV를 각각의 농도 로 (10% SBV를 0, 0.1, 0.25, 0.5, 1, 2.5, 5%로 희석 하여) 사전 처치하고, 24시간 동안 배양하였다.

3) 세포생존율 측정

SH-SY5Y에서 MPP

⁺

의 독성에 대한 SBV의 신 경세포보호효과를 확인하기 위하여 MTT assay를 통해 분석하였다. 분화된 SH-SY5Y cell을 96-well plate에 1 × 10

⁴

cells/well의 농도로 24시간 배양했 다. SH-SY5Y cell에 vehicle, SBV 또는 MPP

⁺

를 각각의 농도와 시간으로 처치하였다. MTT 용액은 0.05mg/mL 농도로 각각의 well plate에 추가하였 고, 4시간 동안 배양한 후 ELISA plate reader를 이용하여 파장 570 nm에서 흡광도를 측정하였다.

세포생존은 시약을 처치하지 않은 대조군에 비교 하여 percentage로 표시하였다.

4) caspase-3 enzyme activity의 측정

분화된 SH-SY5Y cell을 6-well plate에 3 × 10

⁶

cells/well의 농도로 24시간 배양했다. SH-SY5Y cell에 1mM MPP

⁺

를 처치하기 3시간 전에 SBV를 각각의 농도로 (10% SBV를 0, 0.1, 0.25, 0.5, 1, 2.5,

5%로 희석하여) 사전 처치하고, 24시간 동안 배양 하였다. caspase-3 활성은 Caspase 3 Assay Kit, Colorimetric의 매뉴얼에 따라 측정하였다. 용해된 세포를 10,000×g, 4℃에서 원심분리하여 얻은 상청 액을 caspase-3 기질(Ac-Asp-Glu-Val-Asp-pNA (Ac -DEVD-pNA))의 혼합액에 넣고 37℃에서 2시간 반응시켰다. Caspase-3 activity는 ELISA plate reader를 이용하여 파장 405 nm에서 흡광도를 측 정하였다.

5) SBV 신경세포보호효과의 AKT, ERK와 관 련된 기전 관찰

SH-SY5Y에서 AKT와 ERK와 관련하여 SBV의 신경세포보호효과를 관찰하기 위하여 MTT assay 를 통해 분석하였다. 분화된 SH-SY5Y cell을 96-well plate에 1 × 10

⁴

cells/well의 농도로 24시간 배양했다. MPP

⁺

독성에 대한 SBV의 세포 보호효 과 기전을 알아보기 위하여, SH-SY5Y cell에 1mM MPP

⁺

와 AKT (LY984002), ERK (PD98059) 억제 제를 처치하기 3시간 전에 SBV를 각각의 농도로 (10% SBV를 0, 0.1, 0.25, 0.5, 1, 2.5, 5%로 희석하 여) 사전 처치하고, 24시간 동안 배양하였다. MTT 용액은 0.05mg/mL 농도로 각각의 well plate에 추 가하였고, 4시간 동안 배양한 후 ELISA plate reader를 이용하여 파장 570 nm에서 흡광도를 측 정하였다. 세포생존은 시약을 처치하지 않은 대조 군에 비교하여percentage로 표시하였다.

6) 통계학적 분석

모든 실험 결과는 3개 또는 그 이상의 그룹를 비교하여 평균±표준오차(standard error of mean;

SEM)로 나타내었으며, 통계학적 분석은 One-Way ANOVA 방법을 사용하였고 Duncan 방법으로 사 후검정하여 p값이 ≤0.05인 경우 유의성이 있는 것 으로 판정하였다.

Ⅲ. 결 과

1. SBV의 SH-SY5Y에 대한 신경독성

(4)

SBV 자체의 가능한 독성을 알아보기위해 SH- SY5Y cell에 SBV를 여러 농도로(10% SBV를 0, 0.1, 0.25, 0.5, 1, 2.5, 5%로 희석하여) 3시간동안 처 치하였다. SBV의 cell viability을 측정한 결과 0%

에서 viability를 1±0.03%로 하였을 때 0.1%에서는 1.00±0.03%, 0.25%에서는 1.00±0.02%, 0.5%에서는 1.02±0.05%, 1%에서는 0.96±0.05%, 2.5%에서는 0.81

±0.03%, 5%에서는 0.51±0.04%를 보여 높은 농도인 2.5%, 5%에서 세포 독성을 보이는 것을 확인하였다.

Fig. 1. Effects of SBV on human neuroblastoma SH-SY5Y cells

The cell culture was treated with the SBV at different concentrations and viability was measured by MTT assay. For statistical evaluations, One -Way ANOVA anaylsis followed by Duncan test was performed(*p<0.05 compared to the control group)

2. MPP

⁺

의 SH-SY5Y에 대한 신경독성

세포에 (독성)질환을 유발하기 위한 실험으로 1mM, 5mM MPP

⁺

를 24시간의 적정 농도와 시간 을 선택하여 실험을 진행하였다. 그 결과 0mM에 서 viability를 1±0.03%로 하고 1mM에서 0.62±

0.04%, 5mM에서 0.57±0.03%가 나와 1mM의 농도 가 실험을 하기에 적정한 농도임을 알 수 있었다.

Fig. 2. Toxicity of MPP

⁺

at various times and concentrations measured by MTT assay

The cell culture was treated with vehicle, 1mM MPP⁺ or 5mM MPP⁺(control, 1mM MPP⁺, 5mM MPP⁺group). The control group was treated with only saline. 1 and 5mM MPP⁺treatments caused, at 24h, a significant decrease in cell viability compared to the control group. For statistical evaluations, One-Way ANOVA analysis followed by Duncan test was performed(***p<0.001)

3. SBV의 MPP

⁺

에 의한 세포독성 유발 모델에 대

한 신경보호효과

농도별로 3시간 전에 사전 처치 하고 MPP

⁺

를 처치한후 24시간 후에 cell viability를 측정 하였다.

그 결과 control군에서의 결과를 1±0.05%로 하고 MPP

⁺

만 처치한 군에서는 0.57±0.04%, MPP

⁺

+SBV 0.1%군은 0.80±0.01%, MPP

⁺

+SBV0.25%군은 0.94±

0.09%, MPP

⁺

+SBV0.5%군은 1.07±0.03%, MPP

⁺

+ SBV1%군은 1.05±0.04%, MPP

⁺

+SBV2.5%군은 1.00±

0.01%, MPP

⁺

+SBV 5%군은 0.53±0.02%을 나타내

었다. 이것은 Control에 비해서 MPP

⁺

는 독성을 나

타내었고, SBV와 MPP

⁺

를 처치한 군에서는 0.1,

0.25, 0.5, 1, 2.5%에서 MPP

⁺

와 유의성있는 결과를

보였음을 의미한다. 그러나 SBV 5%를 전처리한

후 MPP+를 처치한 군에서는 독성이 나타나는 것

으로 보인다.

(5)

Fig. 3. Effects of pretreatment with SBV on MPP

⁺

- induced cell death

Human neuroblastoma SH-SY5Y cells were treated without or with 1mM MPP⁺for 24h in the absence or presence of various concentrations SBV. The control group was treated with only saline. Cell survival was measured by MTT assay. Data are expressed as relative value of control(1.0) For statistical evaluations One-way ANOVA analysis followed by Duncan test was performed.(***p<0.001 compared to the control group, #p<0.05 compared to the 1mM MPP⁺)

4. SBV의 신경보호효과의 형태학적 연구

사전연구에서 신경세포 보호에 효과가 있는 0.5%

SBV를 처치하여 cell의 morphology를 비교하였다.

그 결과 MPP

⁺

만 처치한 군보다 SBV를 사전처치 하고 MPP

⁺

를 처치한 군에서 세포위축, 세포형태 의 불균형, 세포분리가 덜 보여 신경보호효과가 있 음을 형태학적으로 확인할 수 있었다.

Fig. 4. Effects of SBV on the morphology of human neuroblastoma SH-SY5Y cells.

The SH-SY5Y cells were treated without or with 1mM MPP⁺ for 24h in the absence or presence of various concentrations of SBV. The control group was treated with only saline. Photomicrograph from phase-contrast microscopy. Cell shrinkage, irregularity in cellular shape, cellular detachment

were seen in the MPP⁺ treated cells more than SBV(0.5%) + MPP⁺. Scale bar is 100.0 μm.

5. Caspase-3 활성화 정도의 비교

Apoptosis 기전에 관여한다고 알려져 있는 enzyme 인 caspase-3의 활성화정도를 비교한 결과 control 군에서는 1±0.01%, MPP

⁺

군은 1.54±0.02%, SBV 전처리한 군은 1.14±0.01%을 나타내었다. MPP

⁺

는 control에 비해 caspase-3의 활성이 증가한것을 확 인 할 수 있었고 0.5% SBV + MPP

⁺

를 처치한 군 에서는 MPP

⁺

군과 비교하여 caspase-3의 활성이 감소한것으로 보아 cell을 보호 하는 것으로 보인다.

Fig. 5. Relative caspase-3 activity of control, MPP

⁺

, SBV + MPP

⁺

.

Human neuroblastoma SH-SY5Y cells were treated without or with 1mM MPP⁺+ for 24h in the absence or presence of SBV(0.5%). The control group was treated with only saline. The relative capase-3 activity in the SBV + MPP⁺group was lower than 1mM MPP⁺ group. For statistical evaluations, One-Way ANOVA anaylsis followed by Duncan test was performed.(***p<0.001 compared to the control group, ###p<0.001 compared to the 1mM MPP⁺)

6. SBV 신경보호효과의 기전

MPP

⁺

독성에 대한 SBV의 세포 보호효과를 알

아보기 위하여, SH-SY5Y cell에 1mM MPP

⁺

와

5uM AKT 억제제(LY984002), 10uM ERK 억제제

(PD98059)

²⁰

를 처치하기 3시간 전에 SBV를 각각

의 농도로 (10% SBV를 0, 0.1, 0.25, 0.5, 1, 2.5, 5%

(6)

로 희석하여) 사전 처치하고, 24시간 동안 배양한 결과 control군에서 1±0.016149%, SBV0.5%군에서 1.02±0.03%, MPP

⁺

군에서 0.57±0.04%, SBV0.5%+

MPP

⁺

군에서 0.92±0.02%, SBV0.5%+LY+MPP

⁺

군 에서 0.72±0.04%, SBV0.5%+PD+MPP

⁺

군에서 0.74

±0.02%를 보였다. AKT와 ERK의 Inhibitor 처리 시 SBV+MPP

⁺

의 처치한 군과의 비교했을때 신경 보호효과가 적어지는 것으로 보아 SBV의 효과에 AKT와 ERK pathway가 관련되어 있음을 알 수 있었다.

Fig. 6. assesment of cell viability of control, SBV 0.5%, MPP

⁺

, SBV + MPP

⁺

, SBV + LY + MPP

⁺

, SBV + PD + MPP

⁺

.

SH-SY5Y cells were pretreated with vehicle or nontoxic concentrations of SBV for 3h and the cells were not washed, followed by incubation with respective of SBV(0.5%) and 1 mM MPP⁺and 5uM AKT inhibitor(LY984002) and 10uM ERK inhibitor(PD98059) for 24 h. The control group was treated with only saline. Cell survival was measured by MTT assay. Data are expressed as the relative value of control. For statistical evaluations One-way ANOVA analysis followed by Duncan test was performed.(***p<0.001 compared to the control group, #p<0.05 compared to the 1mM MPP⁺)

Ⅳ. 고 찰

파킨슨병은 진전, 경직, 운동완서, 비정상적 자 세, 운동불능 등을 주증상으로 하는 대표적인 진행

성 신경계 질환으로 발생률은 매년 10만명당 20명 정도이고 유병율은 10만 명당 190명 정도이다. 발 병연령은 50세 이상으로 70대 중반에서 가장 많고 그 이상의 연령에서는 점점 감소한다

¹

. 파킨슨병의 현재까지 치료 방법은 주로 도파민 전구물질인 L-dopa를 투여하여 도파민을 보충하는 방법을 사 용하였으나, 많은 임상 연구에서 지속적 인 L-dopa 의 사용이 약물효과 시간이 점점 짧아지거나(wearing -off 현상), 약물의 효과에 대한 운동조절 기능의 변동이 심해지는 현상(on-off 현상), 이상운동증 (dyskinesia) 등의 심각한 부작용을 초래하는 것으 로 알려져

^21,22

,최근에는 파킨슨병의 발병원인과 도 파민신경 세포의 사멸기전에 관련된 인자들에 대 한 연구를 통하여 파킨슨병을 예방하고 병의 진행 을 완화시킬 수 있는 새로운 치료법 개발에 대한 연구가 많이 이루어지고 있다

^22,23

.

한방 치료 연구로는 약물 치료에서 인삼의 파킨 슨병 동물에서의 신경보호효과

²⁴

, 은행잎의 파킨슨 병 동물에서 levodopa에 의한 신경손상으로부터의 보호효과

²⁵

, 다양한 폴리페놀류의 항산화활성을 통 한 신경보호효과

²⁶

등이 보고되고 있으며 침구치료 에서는 MPTP 유발 파킨슨 병 동물 모델에서의 신수혈(BL23) 봉독약침의 항염증 효과

²⁷

가 보고되 고 있다.

봉독약침요법은 大熱有毒辛甘鹹

²⁸

하며 補益精氣除中益氣하고, 通經活絡消腫排膿淸熱凉血의 효능

²⁹

이 있다. 봉독의 주요 성분은 약 40가지로, peptide, enzymes, physioligically active amines, carbohydrates, Lipids, amino acids 등으로 나누어 볼 수 있으며 이 중 중요한 역할을 하는 것은 Mellitin, Apamin, Adolapin 그리고 Mast cell Degranulating peptide(MCD)를 들 수 있다

³⁰

. 그러나 Bee venom 에 노출되었을 때 발생하는 아낙필락시스 반응은 Bee venom의 임상 사용에 큰 문제가 되고 있다

10,11

. 그래서 아낙필락시스 반응의 주요 원인 물질

인 PLA

2

는 없애고 Bee venom의 항염, 진통, 면역

기능의 주요 성분인 Mellitin은 증가시킨 SBV이

(7)

개발되었다

³⁰

.

SBV의 그 구성성분을 HPLC로 분석한 결과 melittin의 함량이 동일한 농도에 봉약침에 비하여 약 34.9%의 melittin을 더 함유하고 있음을 알 수 있었으며 임상적 관찰에서 3000회의 시술동안 1례 도 전신 즉시형 과민반응이 발생하지 않음을 알 수 있었다

¹⁴

. 또한 벌의 독에 대한 전신 즉시형 과 민반응의 과거력이 있는 6명의 환자를 대상으로 SBV을 시술한 결과 1례도 부작용을 일으키지 않 아 anaphylatic shock의 예방효과가 큼을 알 수 있 었다

¹⁴

. 이처럼 SBV은 Bee venom의 부작용을 현저 하게 낮추어 임상적으로 더욱 유용성이 있으나 아 직 파킨슨병에 대한 치료효과 연구는 거의 전무하 여 연구를 행하게 되었다.

파킨슨병에 관한 연구는 신경독성 물질들을 사 용하여 만든 모델에서 주로 시행되고 있는데 특히 catecholamine성 신경만을 선택적으로 파괴하는 것 으로 알려진 6-OHDA와 MPTP가 널리 사용되고 있다. 이 중 파킨슨병 연구 모델로 널리 사용되는 신경 독소인 MPTP는 체내로 흡수되어 뇌혈관 장 벽(brain-blood barrier)을 통과한 다음 성상세포 (astrocyte)에서 monoamine oxidase B(MAO-B)에 의해 1-methyl-4-phenylpyridi-nium(MPP

⁺

)로 대 사되어 기저핵의 흑질에 있는 도파민성 신경 세포 에만 선택적으로 작용하는데 특히 미토콘드리아의 전자전달계 I(mitochondrial complex I)을 억제함 으로써 세포 독성을 통해 도파민 신경 세포에 손 상을 주게 되어, 파킨슨병과 유사한 특징적인 소견 들을 유발하게 된다

³¹

.

본 실험에서는 apoptosis의 측정에 있어 caspase-3 enzyme을 사용하였다. 비정상적인 신경 세포의 사 멸은 파킨슨 병의 중요한 기전으로 알려져 있으며, 생화학적으로 caspase 계열의 효소 활성을 필요로 한다. Caspase의 활성은 소위 mitochondrial pathway 와 cytosolic pathway에 의해 매개될 수 있으나, 신 경 세포 사멸의 과정은 전형적인 mitochondrial pathway에 의하여 매개되는 것으로 생각된다

^32,33

.

bcl-2 family에서 bax와 bcl-2는 미토콘드리아 막의 투과성에 영향을 미치는데, 특히 bax는 세포질에 존재하는 공극 형성 단백질로 미토콘드리아 막 바 깥 면으로 이동한 후 막의 투과성에 영향을 미쳐 미토콘드리아 안에 있는 cytochrome c가 세포질로 분비되도록 한다. 따라서, 신경 세포 사멸의 실행 단계(execution)는 bax 단백질의 활성화 및 미토콘 드리아 유입으로 전자 전달계의 조효소로 작용하 고 있는 cytochrome c와 같은 세포사멸 촉진 인자 를 방출하는 것으로 연결된다

³⁴

.

Cytochrome c는 생체 내에서 전자 전달에 관계 하는 단백질로서 아미노산 약 100여개 잔기로 구성 되는 polypeptide와 보결분자족으로 구성되며, 이것 과 공유 결합한 c형 heme 한 개를 갖는 heme 단백 질이다. 일단 미토콘드리아로부터 방출된 cytochrome c는 세포질 내에 존재하는 Apaf1, procaspase-9 등 과 결합하여 apoptosome이라고 불리는 단백질 복 합체를 형성하고 이 복합체에 의하여 실행 caspase의 하나인 caspase-3가 활성화된다. 활성화된 caspase-3 에 의하여 DNA cleavage, nuclear condensation, cytoplasmic bleb 등 세포 사멸의 전형적인 과정이 진행되게 된다

^34,35

. 이러한 기전으로 보아 caspase-3 의 활성도를 측정하였을 때 apoptosis의 정도를 알 수 있다.

본 실험에서는 세포의 신경보호효과의 기전을 알아보기 위해서 AKT, ERK enzyme을 측정하였 는데 그 이유에 관해 알기 위해서 cell survival pathway에 대한 이해가 있어야 한다. PI3K-AKT kinase pathway가 그 핵심인데 AKT가 그 central player가 된다. AKT는 forkhead transcription factor를 인산화시켜 death-promoting genes을 전사 (transcription)시키는 것을 억제하고, Bad를 인산화 시켜 14-3-3 protein과 결합하게 하여 Bcl2/Bcl-X

L

가 미토콘드리아에서 Bax와 Bak의 death-promoting action을 하는 것을 억제하게하며, p53의 apoptotic action을 억제하고, caspase-9 activity도 억제한다.

AKT는 또한 IκB의 degradation를 촉진하여 NF-κ

(8)

B-mediated transcriptional activation이 잘 일어나 게 해서 apoptosis를 억제한다. 그리고 ERK는 AKT와 함께 Bad를 인산화시켜 14-3-3 protein과 결합하게 하여 Bcl2/Bcl-X

L

가 미토콘드리아에서 Bax와 Bak의 death-promoting action을 하는 것을 억제하게 한다. 이러한 기전으로 AKT와 ERK가 cell survival pathway의 중요한 enzyme이 된다

^36,37

. 본 실험에서는 SBV의 전처치 이후 MPP+를 처 리한 실험에서 MPP+만 처리한 군과의 비료를 통 해 유의성 있는 세포활성도를 얻어 일정 농도 범 위 내에서 신경보호효과가 있었음을 알 수 있었으 며 그 기전에서도 아무것도 처리하지 않은 대조군, sweet bee venom 0.5%군, MPP

⁺

군, SBV + MPP

⁺

군, AKT inhibitor 처치군(SBV+LY+MPP

⁺

군), ERK inhibitor 처치군(SBV+PD+MPP

⁺

군)을 비 교하여 SBV의 신경보호효과가 ERK, AKT와 일 정 부분 관계가 있음을 밝혀내었다.

Ⅴ. 결 론

본 연구에서는 파킨슨 병 치료제로서의 SBV의 효 과에 대한 기본연구로서 MPP

⁺

로 유발된 SH-SY5Y cell에 대한 신경보호효과를 알아보기 위해 실험한 결과 다음과 같은 결론을 얻었다.

1. SBV이 MPP

⁺

로 유도된 신경독성에 대해 일정 농도에서 신경보호효과가 있음을 알 수 있었다.

2. AKT와 ERK의 Inhibitor 처리시 SBV의 신경보 호효과가 적어지는 것으로 보아 SBV의 효과에 AKT와 ERK pathway가 관련되어 있음을 알 수 있었다.

3. ERK와 AKT는 세포의 괴사를 막는 survival pathway에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려 져 있다. 따라서 SBV의 신경보호효과가 ERK 와 AKT의 신호전달을 통해 일어남을 알 수 있 었다.

그리고 이 실험의 한계와 앞으로의 연구방향은 SBV의 신경보호효과에 AKT와 ERK가 관련된다 는 것을 in vitro 실험으로 관찰하였으므로, 향후 in vivo 에서 효과가 있는지 연구가 시행되어야 하며 SBV의 임상적 가치를 확인하기 위하여 잘 디자인 된 임상연구를 통해 임상적 효과를 확인할 필요가 있다.

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