The Effects of a Dietary Edwardsiella tarda Specific Bacteriophage and Bacillus subtilis Mixture on Innate Immune Responses and Antibacterial Activity of Nile tilapia Oreochromis niloticus

(1)

23

서 론

에드와드병의원인균인

Edwardsiella tarda (E. tarda)

^는^수중 및정상어의장내에상재해있지만고밀도양식에의한물리적 스트레스를비롯하여사육환경악화

,

^먹이경쟁

,

^{생활공간의}^협 소

,

^{수산약제의}^사용

,

^저수온^및^고수온^등에^의해^많은^스트레 스조건하에서기회성감염균으로서각종양식어류에감염되 어경제적으로많은손실을초래하고있다

(Kanai et al., 1988;

Bang et al., 1992).

특히넙치양식에서가장많은피해를주는 에드와드병의발병증상으로는복부팽창및탈장등의증상이 있으며주로고수온기에많이나타나는질병이다

(Kusuda and

Kawai, 1998).

^현재^본^질병은^화학적^치료와^관련된^오염^및 다양한항생제내성균의출현때문에어류양식에있어서예방 및치료가더욱어려워지고있다

(Chinabut and Puttinaowarat,

2005).

따라서기존의질병예방및치료의문제점에대한대책

으로친환경적인

bacteriophage (phage)

^나

Bacillus subtilis (B.

subtilis)

^와^같은

probiotics

^에^대한^관심과^연구가^점차^증가되 고있는실정이다

(Salminen et al., 1999; Park et al., 2000).

Phage

^는 ^{숙주세포인} ^세균에^감염하여 ^{숙주세포의} ^생체 ^기

능을 이용하여 증식하는 바이러스로서 자연계에 널리 분포 하고 있다

(Carlton, 1999). Phage

^는

1915

^년

Twort

^와

1917

^년

d’Herelle

^에^의해서^최초로^{발견되었으며}

(Sulakvelidze et al.,

Article history;

Received 4 October 2013; Revised 19 December 2013; Accepted 4 February 2014

*Corresponding author: Tel: +82. 63. 469. 1886 Fax: +82. 63. 463. 9493 E-mail address: [email protected]

Kor J Fish Aquat Sci 47(1) 023-030, February 2014 http://dx.doi.org/10.5657/KFAS.2014.0023 pISSN:0374-8111, eISSN:2287-8815

ⓒ The Korean Society of Fishereis and Aquatic Science. All rights reserved

Edwardsiella tarda의 특이 Bacteriophage와 Bacillus subtilis가 혼합된 사료급이가 나일 틸라피아( Oreochromis niloticus)의

선천적 면역반응과 항균효과에 미치는 영향

백민석ㆍ황요셉ㆍ최상훈*

군산대학교 수산생명의학과

The Effects of a Dietary Edwardsiella tarda Specific Bacteriophage and Bacillus subtilis Mixture on Innate Immune Responses and Antibacterial

Activity of Nile tilapia Oreochromis niloticus

Min Suk Baek, Yo Sep Hwang and Sanghoon Choi^*

Department of Aquatic Life Medicine, Kunsan National University, Gunsan 573-701, Korea

The present study investigated the effects of dietary Edwardsiella tarda ( E. tarda ) specific bacteriophage (phage) and Bacillus subtilis ( B. subtilis ) mixture on innate immune responses and antibacterial activity of Nile tilapia, Oreo- chromis niloticus . In a dietary experiment, tilapia were fed the control diet (C), a phage-only supplemented diet (P), a B. subtilis only supplemented diet (B), or a B. subtilis and phage mixed diet (B+P). A respiratory burst and significant increase in lysozyme activity ( P <0.05) were noted in the B+P group, as compared to other groups after 4 days of feed- ing. The B group showed a significant ( P <0.05) increase in respiratory burst and lysozyme activity versus the C and P groups, whereas no significant increases ( P <0.05) were observed in the P and C groups. ACH

₅₀

was significantly up-regulated in the B+P group versus other groups after 8 days of feeding ( P <0.05). In vivo antibacterial activity was significantly enhanced in the B+P fed group, as compared to other groups ( P <0.05) after 7 days of E. tarda challenge.

A significant ( P <0.05) increase in antibacterial activity was seen in the B group, as compared to C or P groups after 14 days of feeding. These results suggest that a B. subtilis and phage mixture could be utilized as an alternative to antibiotics in the control of fish diseases caused by E. tarda .

Key words: Edwardsiella tarda , Innate immune responses, Lysozyme, Bacteriophage

(2)

백민석

ㆍ

황요셉

ㆍ

최상훈

24 2001) 1980

^년도에는

phage

^의^{임상실험이} ^{성공하였다}

(Smith and Huggins, 1980; Smith and Huggins, 1982).

이후동물의

세균성질병에대한

phage

^치료가^{가능하다는}^연구가^많이^보

고되었으며

(Soothill, 1992; Soothill, 1994; Merril et al., 1996;

Barrow et al., 1998)

^또한^어류의^세균성^질병에^대한

phage

^치 료연구도상당수보고되었다

(Rodgers et al., 1981; Stevenson and Airdrie, 1984; Park et al., 2000).

Probiotics

^는^숙주의^건강에^유익한^효과를^나타내는^살아있

는미생물로서다양한종류의정상장내세균총에서병원성세 균에대해증식을억제하는항균력이있는것으로알려져있으 므로정상장내세균총의균형을유지하고병원성세균의증 식을억제하는데중요한역할을담당한다

(Shahani and Ayebo, 1980; Fuller, 1989).

^이러한

probiotics

^의^유용한^효과는^주로 사람과가축에대한실험보고내용이대부분을차지하고있으 나

(Tournut, 1989)

^어류와^다른^{수생생물에서도}^선천적^면역반 응향상과병원성미생물을억제시키는것으로연구보고되고 있다

(Burr et al., 2005; Wang et al., 2008; Nayak, 2010; Cha et al., 2012).

^{수산양식에서}^사용되는

probiotics

^로는

Lactobacil- lus sp., Bacillus sp., Saccharomyces sp.

및

Enterococcus sp.

등 이있다

(Kumar et al., 2008). Probiotics

^가^첨가된^사료공급^시 장내해로운균의번식을억제하고

(Perdigon et al., 1990),

^장 내미생물형성에영향을미쳐

(Shahani and Ayebo, 1980)

장 내독소제거에의해장질환을억제할뿐만아니라비특이적면 역기능강화

(Shida et al., 1980)

등여러가지다양하고도유익 한효과들이나타난다는연구결과가보고되었다

(Nayak et al., 2007; Kumar et al., 2008; Aly et al., 2008; Cutting, 2011; Cha et al., 2012).

그러므로본연구에서는항생제대체제를개발하기위한기 초적인자료로서

E. tarda

에대한

phage

를자체적으로분리하 여

phage

^의^{항균효과를}^확인한^후

probiotics

^와의^{혼합투여가} 어류의모델로서나일틸라피아

(Oreochromis niloticus)

^의^선 천적면역반응과항균효과에미치는영향을조사함으로써에 드와드병에대한예방및치료대책의가능성을확보하고자하 였다

.

재료 및 방법

Bacillus subtilis 분리 및 동정

숙성된김치를

Luria Bertani (LB) broth

에넣고

37℃

에서

24

^시간^배양한^후^멸균된^{생리식염수}

(Phosphate Buffered Sa- line, pH 9.2, PBS)

^로

1:10

^{단계희석하고}

LB agar

^에^도말하여

B. subtilis

와유사한형태집락

5

가지를분리하였다

.

분리된균 들은

E. tarda

에대한항균효과를측정한후가장효과가좋은균 주를

16S rRNA gene

을이용하여

B. subtilis

임을입증하였다

. DNA sequencing

^에^사용된

B. subtilis

의

16S rRNA gene

^에^대 한

universal primer

^는

Table 1

^에^{나타내었다}

.

병원성 균주

본연구에서사용한

E. tarda (KCTC 12267)

는

Korean Col- lection for Type Culture (KCTC)

^에서^분리^보존하고^있던^균 주를분양받았다

.

분양받은균주는

brain heart infusion (BHI) broth

^와

Salmonella shigella (SS) agar

를이용하여

2

^차^계대배 양한후사용하였다

.

Phage

우리나라의서해안및남해안에위치한

100

^여^군데의^양식장 에서수집된물

sample

로부터본연구실에서분리된

E. tarda

의 특이

phage

^를^{사용하였다}

(Lee et al., 2011).

실험 사료

본연구에서는기초사료로

(

주

)

카길애그리퓨리나양어용부 상사료를 사용하였다

.

^{기초사료의} ^{영양성분은}

34%,

^조지방

6%,

조회분

15%,

조섬유

5%,

칼슘

0.8%

및인

0.8%

로서실험 에사용된사료는기초사료를포함하여총

4

^가지로^제조하여^사 용하였다

.

^첫^번째^사료는

B. subtilis (2×10

⁸

CFU/g)

^와

phage (3×10

⁷

PFU/g)

를혼합하여첨가하고호기성조건으로

37℃

incubator

^에서

2

^일^간^발효시킨^후^건조하여^{사용하였다}

.

^두^번 째사료는

B. subtilis (2×10

⁸

CFU/g)

를첨가하여호기성조건 으로

37℃ incubator

^에서

2

^일간^발효시킨^후^건조하여^사용하 였다

.

^세^번째^사료는

phage (3×10

⁷

PFU/g)

^만^첨가하여^건조 시킨후사용하였다

.

네번째사료는대조군으로서기초사료에

B. subtilis

와

phage

^를^{첨가하였을}^때^{사용되었던}^{동일부피의}

BHI

를첨가한후동일조건에서건조시킨후사용하였다

.

모든 사료는발효와동시에자연건조된상태로플라스틱지퍼백에 넣어사료공급전까지

4℃

^에서^보관한^후^실험에^{사용하였다}

. 실험어

군산대학교부속양식장으로부터평균체중이

100±12 g

^의^나 일틸라피아

(Oreochromis niloticus) 200

마리를분양받았다

.

분양받은틸라피아를

1 ton

^의^{원형수조에}^수온

23-25℃

^에서

1

주일간순치시킨후실험에사용하였다

.

선천적 면역반응

B. subtilis

와

phage

^가^나일^{틸라피아의}^선천적^{면역반응에}^미 치는영향을조사하기위해

2

가지방법으로실험을수행하였 다

. 1

^차^실험은

B. subtilis

와

phage

^가^혼합된^첨가사료

(B+P)

^를 Table 1. Universal primers for B. subtilis KM-1 16S rRNA

Primer

Name Object Primer Sequence 5′ to 3′

16S-27F 16S rRNA sequence amplification AGAGTTTGATCMTGGCTCAG 16S-1492R 16S rRNA sequence amplification TACGGYTACCTTGTTACGAC

(3)

급이하는

group, B. subtilis

^첨가사료

(B)

^만^급이^하는

group, phage

^첨가사료

(P)

^만^급이^하는

group

^및^기초사료

(C)

^만^급이 하는대조군의

4

^개

group

^으로^나누어

80 L

^수조에

group

^당^각 각

13

^마리씩^{수용하였다}

.

^각각^제조된^사료는

14

^일간^공급^하였 으며

sample

은사료공급

7

일및

14

일째에수집하였다

. 2

차실 험은

B+P

^공급^시^나일^{틸라피아의}^선천적^{면역반응이}^어느^정 도의기간동안유지되는지알아보기위해수행되었다

.

총

4

개 의

group

^으로^나누어

80 L

^수조에^각각

13 .

첫번째

group

은

B+P

를

14

일간공급하였으며두번째

group

은

B+P

^를

4

^일간만^공급하고^실험종료^시까지^사료를^공급하지^않

았다

.

^두^개의^대조군

group

^도

BHI

^만^처리한

C

^를^같은^방법으 로공급하였다

. Sample

^은^사료공급

4, 8, 10

^일^및

14

^일째에^각 각수집하였다

.

Sample 수집

혈청수집을위해틸라피아의 미병부에서혈액을채취하였 다

.

혈액은

4℃

에서

24

시간동안응고시킨후

1,000×g

에서

3

분간원심분리 하여혈청을분리하였다

.

^분리된^혈청은

lyso- zyme

활성과

alternative complement pathway (ACH

₅₀

)

활성 분석에사용하였다

.

^백혈구^수집을^위해^{틸라피아를}^개복하여 지방층과막을제거한후 순수한두신만을 적출하였다

.

적출 한두신을

nylon mesh

^위에서^눌러^백혈구를^{유출하였고}

His- topaque-1077 (Sigma)

^을^이용하여

2,500×g

^에서

30

^분간^원심 분리하여분리된

buffy-coat

^부근에서^{백혈구만을}^순수^분리하 였다

.

^분리된^백혈구는^{혈구계산판을}^이용하여^{계수하였다}

.

^백 혈구의세포수는

10

⁶

cell/mL

로

Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM, Gibco)

^용액에 ^부유시켜

respiratory burst

활성분석에사용하였다

.

Respiratory burst 활성

백혈구 식세포 작용의

respiratory burst

활성은

Secombes (1990)

^의^방법에^따라

nitroblue tetrazolium (NBT, Sigma)

^을 사용하여분석하였다

.

^백혈구를

96 well plate

^에

200 μL

^씩^분주 한후

120×g

^에서

5

^분간^원심분리^하였다

. PBS

^로

2

^회

wash- ing

^한^후

phorbol myristate acetate (PMA, 1 μg/mL)

^를^첨가 한

NBT (1 mg/mL)

^를^각각

100 μL

^씩^첨가하여

25℃

^에서

1

^시 간동안배양하였다

.

^배양^후

70% methanol

^로^고정하고

PBS

로

2

회

washing

한후

2 M KOH 120 μL

와

dimethyl sulfoxide (DMSO, Sigma)

^를^{첨가하였다}

.

^첨가^후

Microplate reader

^기

(Sunrise, TECAN) 620 nm

에서흡광도를측정하였다

.

Lysozyme

^활성

혈청의

lysozyme

활성은

Sheikhzadeh et al. (2012)

의방법을 응용하여분석하였다

. 96 well plate

^에

0.2 M citrate phosphate buffer (pH 5.8)

^에

2 mg/mL

^의

Micrococcus lysodeikticus (Sig- ma)

^를^부유시킨^용액을

well

^당

75 μL

^와^혈청

25 μL

^를^분주하 여반응시켜

30

^초^후부터

4

^분

30

^초까지^감소하는^흡광도의^양

을

Microplate reader

^기

405 nm

^에서^{측정하였다}

.

^이때

1 unit

^은

분당

0.001

^의^흡광도가^감소하는^양으로^{표현하였다}

.

Alternative complement pathway 활성(ACH

₅₀

) ACH

₅₀^은

Yano (1992)

^의^방법을^이용하여^{분석하였다}

.

^토끼 의혈액을귀의정맥혈관에서채취하여

Histopaque-1077

을이 용하여적혈구만을분리하였다

.

^분리된^토끼의^적혈구를

PBS

로

2

회

washing

한후

0.01 M EGTA-Mg-Gelatin veronal buf- fer (EGTA-Mg-GVB)

^로^희석하여

1×10

⁸

cell/mL

^의^농도로 조절하여사용하였다

.

틸라피아의혈청을

EGTA-Mg-GVB

로

1:20

^의^농도로^희석한^후

96well plate

^에

well

^당

200, 150, 125, 100, 75 μL

^씩^분주하고

EGTA-Mg-GVB

^로^각각의

well

^의^총 량이

200 μL

^가^되도록^{맞추어주었다}

.

^그^다음^분리된^토끼^적혈 구

(1×10

⁸

cell/mL)

^를^각각의

well

^에

100 μL

^씩^분주하여

25℃

incubator

^에서

1

^시간^동안^반응시킨^후

120×g

^에서

5

^분간^원 심분리한다음각각의

well

^에서^상청액

100 μL

^씩을^채취하여

Micro plate reader 405 nm

에서분석하였다

.

ACH

₅₀

value (Unit/mL) = 1/K ×

^혈청^희석^배수

× 0.5 In vivo 항균효과

나일틸라피아의

E. tarda

^인위적^감염^시

B. subtilis

^와

phage

가생체내에서미치는항균효과를알아보기위해

2

가지방법 으로실험을수행하였다

. 1

^차^실험은

4

^개의

group

^으로^나누어

80 L

^수조에^각각

13 . B+P, B, P

^및

C

^를^각각 의

group

^에

4

^일간^공급한^후

1

^일간^절식시켜

E. tarda (1×10

⁷

CFU/mL)

^를^{틸라피아의}^복강에^{주사하였다}

.

^주사^이후

14

^일 동안각각의사료를공급하였다

.

주사후

0, 7, 14

일째에각각

group

^에서

4

^마리씩 ^모든^장기를 ^{적출하였다}

.

^적출된^장기에

멸균된

PBS 1 mL

을혼합해서 균질화한후거즈를이용해서

1,000×g

^로^원심분리^하여^착즙^하였다

.

^그^후^{착즙부유액을}^멸 균된

PBS

로

1:10

단계희석하여

SS agar

에평판도말법으로

E. tarda

^의^생균수를^{측정하였다}

.

2

^차^실험은

1

^차^실험과^{마찬가지로}

4

^개의

group

^으로^나누어

80 L

^수조에^{틸라피아를}^각각

13

^마리씩^수용한^후

2

^개의

group

은

B+P

^와

C

^를^각각

4

^일간^공급하여

1

^일간^절식시킨^후

E. tarda

(1×10

⁷

CFU/mL)

^를^복강에^주사하고 ^사료를^공급하지^않았

다

.

^나머지

2

^개의

group

^은^이전

group

^과^동일한^조건에서

10

일동안각각의사료를공급하였다

. C

를공급하고

E. tarda

주 사후

10

^일간^사료를^{공급하거나}^하지^않은

2

^개의

group

^을^대 조군으로설정하였다

.

모든

group

에서주사후

4, 6

일및

10

일 째에각각

3

^마리씩^모든^장기를^적출하여

1

^차^실험과^같은^방법 으로측정하였다

.

통계 분석

데이터를평균과표준편차

(Mean±S.D.)

^로^표현하여

PRIM-

ER (Mc Graw-Hill, Inc., ver. 1.5)

^의

one way analysis of vari-

(4)

백민석

ㆍ

황요셉

ㆍ

최상훈

26 ance

^를 ^이용하여^{측정하였다}

. Student-Newman-Keuls test

^로 각

group

^사이의^유의성을^{검정하였으며}

P<0.05

일경우유의성 이있는것으로간주하였다

.

결과 및 고찰

본연구에서는다양한항생제내성균의출현과같은기존의 질병예방및치료의문제점에대한대책으로관심이높아진친 환경적인

phage

^와

probiotics

^의^일종인

B. subtilis

가혼합된첨 가사료를이용하여나일틸라피아의선천적면역반응과에드와

드증의원인균인

E. tarda

에대한항균효과가증강되는지에대

한조사를수행하였다

. B. subtilis 동정

김치에서 분리된 균주를

16S rRNA universal primer

^로

F, 5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG–3′, R, 5′-TACGGY- TACCTTGTTACGAC–3′

^을^이용한^염기^서열^분석^결과

Gen- bank

^에^등록된

accession number JF496383.1

^인

B. subtilis

^의

16S ribosomal RNA gene

과

100%

상동성을나타내었다

(Baek et al., 2013).

선천적 면역반응

식세포작용에의해서생기는중간대사산물인활성산소

(O

₂^-

)

와같은

reactive oxygen species (ROS)

^는^강력한^살균^효과가 있는것으로알려져있으며

(Ellis, 1999) lysozyme

은

peptido-

glycan

^이라는^세균의^세포벽^성분을^분해하는^작용을^가지고

있으며이외에도옵소닌

,

항바이러스항암작용등에도관여를 하는것으로서보고되어있다

(Jolles and Jolles, 1984).

^그리고 보체의

alternative pathways

^는^세균

,

^진균

,

^바이러스^및^기생충 등에대한어류의강력한선천적방어기작으로보고되어있다

(Müller-Eberhard, 1988).

B+P, B, P

및

C

를

4

개의

group

에각각

14

일간공급한후선천 적면역반응

1

^차^실험의

respiratory burst, lysozyme

^및

ACH

₅₀ 활성결과는

Fig. 1 A, B

^및

C

^에^각각^{나타내었으며}^모두^유사 한결과들을보였다

. B+P

를공급한

group

이

C, P

및

B

를공급 한

group

^에^비해^사료공급^후

7

^일^및

14

^일^째^모두

respiratory burst, lysozyme

및

ACH

₅₀활성이유의성있게증가

(P<0.05)

되 었다

. B

^를^공급한

group

^은^대조군^및

P

^를^공급한

group

^에^비해

7

^일^및

14

^일^째^모두^{유의적으로}^높은

(P<0.05)

^수치를^보였으나

B+P

를공급한

group

보다는낮은수치를나타내었다

. P

만급여 한

group

^은^대조군

group

^과^유의적인^차이가^없었다

(P>0.05).

B+P

공급시나일틸라피아의선천적면역반응이어느정도 의기간동안유지되는지알아보기위해수행한선천적면역의 활성결과는

Fig. 2 A, B

^및

C

^에서^{나타내었으며}^모두^유사한 결과들을보였다

. B+P

를

14

일간지속적으로공급한

group

이 다른

group

^들에^비해

8

^일째부터

14

^일째까지

respiratory burst, lysozyme

및

ACH

₅₀활성이유의성있게높게증가

(P<0.05)

되 Fig. 1. Respiratory burst activity (A), lysozyme activity (B) and

ACH50 (C) of Nile tilapia Oreochromis niloticus fed the control diet, phage (3×10⁷ PFU/g) supplemented diet, B. subtilis (2×10⁸ CFU/g) supplemented diet and phage and B. subtilis mixed diet for 14 days. Data represent the mean±S.D. (n=4). Different letters above the bars indicate significant differences (P<0.05).

Administration time (days)

7 14

Respiratory burst (OD 620 nm)

0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5

Control diet Phage diet B. subtilis diet B. subtilis+phage diet

a a b

c

a b

a c

Administration time (days)

⁷ ¹⁴

ACH

50

activity (Unit/mL)

0 20 40 60

a a b

c

a a b

c

Administration time (days)

7 14

Lysozyme activity (Unit/mL)

0 5 10 15 20 25

a b

c

a a

b c

a

Fig. 1A

Fig. 1C Fig. 1B

Post injection (days)

0 7 14

Viable cells (log10

n

CFU/mL) Viable cells (log10

n

CFU/mL)

0 2 4 6 8

d a

c

a a a

b c a a a a

d

Lysozyme activity (Unit/mL)

Administration time (days)

4 8 10 14

0 5 10 15 20 25

a a

b b aa

b

aa

c c c

b b

aa

Fig. 2B

Administration time (days)

4 8 10 14

Respiratory burst (OD 620 nm)

0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7

Control diet administered 4 days Control diet sustained administration B.s+phage diet administered 4 days B.s+phage diet sustained administration

a a

b b b

c

a a aa

b c

aa b

c

Fig. 2A

Administration time (days)

4 8 10 14

ACH

50

activity (Unit/mL)

0 20 40 60

aa b

c

a a a a aa

c

a aa

c

a

Fig. 2C

Post injection (days)

0 4 6 10

0 2 4 6 8 10

a bc a

a b

c a

a b

c a a a a a

Control diet Phage diet B. subtilis diet B. subtilis+phage diet Control diet administered 4 days

Control diet sustained administration B.s+phage diet administered 4 days B.s+phage diet sustained administration

(5)

B. subtilis와 파아지가 첨가된 사료급이가 틸라피아의 선천성 면역과 항균 효과에 미치는 영향

27

었다

. B+P

를

4

일간만공급한

group

의

respiratory burst, lyso- zyme

^활성은

8

^{일째까지는}^대조군

group

^들에^비해^높은^값을 보였으나

10

일째부터는점차적으로수치가떨어지는것이확 인되었으며

ACH

₅₀^활성은

8

^일째에만^대조군

group

^들에^비해 유의성있게높은

(P<0.05)

^수치를^보였다

.

^{기초사료를}^공급한

2

개의대조군

group

간의유의적인차이는없었다

(P>0.05).

이와 같은결과는이전의연구들에서도

B. subtilis

첨가사료를공급 하였을때도미

(Salinas et al., 2005),

나일틸라피아

(Aly et al., 2008),

^{무지개송어}

(Panigrahi et al., 2007),

^잉어과^어류

(Kumar et al., 2008)

^등에서

respiratory burst, lysozyme

^및

ACH

₅₀^활 성이향상되었다고보고된내용과일치하였다

.

그러나어류에 서

probiotics

^가^어떠한^{메커니즘에}^의해^선천적^{면역반응을}^향 상시키는지에대한정확한메커니즘은보고되어있지않다

. Abraham et al. (2007)

^도^생균제가^어류의^{생존능력과}^면역력 을향상시킬수있다고보고하였지만그메커니즘에대한정확 한해답은제시하지못하였다

.

이전의연구에서는

B. subtilis

와

prebiotics

^인

inulin, chitosan

^및

fructooligosaccharide

^등이^혼 합된첨가사료를공급하여어류의선천적면역반응이향상되었 다는보고

(Zhang et al., 2010; Geng et al., 2011; Cerezuela et al., 2012)

^는^되어^있지만

B. subtilis

^와

phage

^를^혼합투여^했을 시선천적면역반응에미치는영향등에관련된연구는아직까 지보고되지않았다

.

^본^연구의^결과

phage

^자체로는^틸라피아 의선천적면역기능을증가시키지는못하였지만생균제와혼합 투여되었을시생균제만투여되었을때보다유의적상승효과

(P<0.05)

^가^나타났다

.

^그러나^어떻게

B. subtilis

^와

phage

^가^혼 합투여되었을때단독으로처리되었을때보다선천적면역기 능이상승되는지에대한추가적인연구가요구된다

.

Fig. 3. Antibacterial effect of phage and B. subtilis supplemented diet fed for 14 days after E. tarda injection. Data represent the mean±S.D. (n=4). Different letters above the bars indicate significant differences (P<0.05).

Fig. 2. Respiratory burst activity (A), lysozyme activity (B) and (C) ACH50 of Nile tilapia Oreochromis niloticus fed the control diet for 4 and 14 days, respectively and phage (3×10⁷ PFU/

g) and B. subtilis (2×10⁸ CFU/g) mixed diet for 4 and 14 days, respectively. Data represent the mean±S.D. (n=5). Different letters above the bars indicate significant differences (P<0.05).

Administration time (days)

⁷ ¹⁴

Respiratory burst (OD 620 nm)

0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5

a a b

c

a b

a c

Administration time (days)

7 14

ACH

50

activity (Unit/mL)

0 20 40 60

a a b

c

a a b

c

Administration time (days)

7 14

Lysozyme activity (Unit/mL)

0 5 10 15 20 25

a b

c

a a

b c

a

Fig. 1A

Fig. 1C Fig. 1B

Post injection (days)

0 7 14

Viable cells (log10

n

CFU/mL) Viable cells (log10

n

CFU/mL)

0 2 4 6 8

d a

c

a a a

b c a a a a

d

Lysozyme activity (Unit/mL)

Administration time (days)

4 8 10 14

0 5 10 15 20 25

a a

b b aa

b

aa

c c c

b b

aa

Fig. 2B

Administration time (days)

4 8 10 14

Respiratory burst (OD 620 nm)

0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7

a a

b b b

c

a a aa

b c

aa b

c

Fig. 2A

Administration time (days)

4 8 10 14

ACH

50

activity (Unit/mL)

0 20 40 60

aa b

c

a a a a aa

c

a aa

c

a

Fig. 2C

Post injection (days)

0 4 6 10

0 2 4 6 8 10

a bc a

a b

c a

a b

c a a a a a

Administration time (days)

7 14

Respiratory burst (OD 620 nm)

0.0 0.1 0.2 0.3

0.4 B. subtilis diet B. subtilis+phage diet

a a b

c

a b

a c

Administration time (days)

⁷ ¹⁴

ACH

50

activity (Unit/mL)

0 20 40 60

a a b

c

a a b

c

Administration time (days)

7 14

Lysozyme activity (Unit/mL)

0 5 10 15 20 25

a b

c

a a

b c

a

Fig. 1C Fig. 1B

Post injection (days)

0 7 14

Viable cells (log10

n

CFU/mL) Viable cells (log10

n

CFU/mL)

0 2 4 6 8

d a

c

a a a

b c a a a a

d

Lysozyme activity (Unit/mL)

Administration time (days)

4 8 10 14

0 5 10 15 20 25

a a

b b aa

b

aa

c c c

b b

aa

Fig. 2B

Administration time (days)

4 8 10 14

Respiratory burst (OD 620 nm)

0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7

a a

b b b

c

a a aa

b c

aa b

c

Fig. 2A

Administration time (days)

4 8 10 14

ACH

50

activity (Unit/mL)

0 20 40 60

aa b

c

a a a a aa

c

a aa

c

a

Fig. 2C

Post injection (days)

0 4 6 10

0 2 4 6 8 10

a bc a

a b

c a

a b

c a a a a a