주정 첨가 비율을 달리한 마늘 추출물의 함황화합물 및 항산화 활성 강민정

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주정 첨가 비율을 달리한 마늘 추출물의 함황화합물 및 항산화 활성

강민정․강재란․김동규․신정혜 (재)남해마늘연구소

Chemical Characteristics and Antioxidant Activity of Garlic Extract from Different Ethanol Solution

Min-Jung Kang, Jae-Ran Kang, Dong-Gyu Kim, and Jung-Hye Shin Namhae Garlic Research Institute

ABSTRACT In this study, the change in sulfur compounds in garlic extract and residual garlic were analyzed during the aging of fresh garlic for 35 days in ethanol solvents with different ratios, and antioxidant activity of the final aged extracts was investigated. Volume of 0% (E0), 25% (E25), 50% (E50), 75% (E75), and 100% (E100) ethanol were added to fresh garlic, respectively, then stored at 8°C for 35 days. Samples were collected at 7 day intervals and separated into extract solution and residual garlic (R0, R25, R50, R75, R100). Changes in the alliin content of garlic extract increased with the extraction time. Additionally, the content of allicin in residual garlic was higher than that of extract, with the highest levels being observed in the 28 day extracted E25 sample. The level of S-allyl cysteine was highest in the residual garlic (140.2 mg/kg) in the 35 day sample. Diallyl disulfide (DADS) and diallyl trisulfide (DATS) levels were higher in garlic extracts than residual garlic at 35 days of storage and DATS was higher than DADS. Measurement of the 2,2-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonate) radical scavenging activity in 35 day extract samples revealed that the activity of E75 in 1,250 μg/mL was highest (27.3%), and the activity increased as the extract concentration increased, with values of 46.91 to 87.52% being observed at 10,000 μg/mL.

Key words: alliin, allicin, S-ally cysteine, diallyl disulfide, diallyl trisulfide

Received 12 July 2018; Accepted 27 August 2018

Corresponding author: Jung-Hye Shin, Namhae Garlic Research In- stitute, Gyeongnam 52430, Korea

E-mail: [email protected], Phone: +82-55-860-8947

서 론

마늘은 오랜 역사 동안 식용과 약용으로 이용되어 왔고, 여러 가지 질병을 예방하고 치료하는 데 다양한 효과가 있는 것으로 알려지면서 최근에는 건강식품 및 의약품으로 인식 이 확대되고 관련한 연구가 활발히 진행 중이다(1).

마늘에는 탄수화물 20%, 단백질 3.3%, 지방 0.4%, 섬유 소 0.92%, 회분 13.4%, 비타민 C 5.5 mg%가 함유되어 있 고 glutamic acid를 포함하여 15종의 아미노산과 황화 아릴 (allyl)류로서 allicin의 모체인 alliin이 약 2.7% 함유되어 있으며, 이 밖에도 다양한 페놀 및 플라보노이드, 칼슘, 엽 산, 철, 마그네슘, 망간, 인, 칼륨, 셀렌, 아연 등의 미네랄과 비타민 B1, B2, B3 등이 함유되어 있다(2). 마늘의 주요 성 분인 alliin은 allicin의 전구물질로 마늘에 함유된 alliinase 효소에 의해서 allicin과 ammonium pyruvate로 분해되는 데, allicin은 화학적으로 매우 불안정하여(3) 산, 염기 및 열 등에 의해 쉽게 분해되어 allyl thiosulfinate, allyl methyl thiosulfinate, allyl propenyl thiosulfinate, diallyl di-

sulfide(DADS), allyl methyl sulfide, 2-vinyl-4H-1,3- dithin, E-ajoene 및 allyl methyl trisulfide 등으로 전환된 다(4,5). 마늘은 S-S(O)-기 분자구조를 가지고 있는 allicin 에 의해 항균작용, 항진균작용, 항바이러스작용 등을 나타내 며, 미생물의 RNA, DNA 및 단백질의 합성을 부분적으로 억 제함으로써 항균작용을 하고 염증을 일으키는 cytokine의 발현을 억제하여 항염 효과를 나타낸다고 보고되어 있다(3).

생마늘을 에탄올에 10~20개월간 장기간 숙성한 숙성 마 늘 추출액(aged garlic extract, AGE)은 생마늘 특유의 자 극성 화합물이 제거되고 불용성 화합물이 일부 용해되어 독 성 변화를 유발하지 않으며(6), 많은 약리학적 연구에서 항 산화, 항노화, 면역 조절, 심혈관 및 간 보호 특성을 가지고 있다고 알려져 있다(7). 특히 최근 연구에 의하면 에피네프 린, 콜라겐으로 유도된 혈소판 응집 현상은 AGE 추출물 처 리에 의해 감소하는데 비정상적인 혈소판 활성화를 억제함 으로써 심혈관 위험을 감소시켰다고 보고되고 있다(8,9). 또 한 알츠하이머 질환과 관련한 신경계 시냅스 퇴행 및 신경 염증 경로에 AGE 추출물이 긍정적인 효과가 있다고 보고된 바 있다(10).

장기간 숙성하여 제조한 AGE는 숙성 과정 중 일부 화합 물이 새로 생성되는데, 수용성 시스테인 부분이 풍부한 S-

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methyl-cysteine, S-allyl-cysteine(SAC), S-1-propenyl- cysteine(S1PC) 및 S-allylmercapto-cysteine 황화합물 (11,12)과 allicin이 thiosulfide 및 sulfide류로 변화된 형태 인 diallyl sulfide, DADS, diallyl trisulfide 화합물이 생성 된다고 보고되어 있다(13). 일반적인 생마늘 추출물보다 장 기간 숙성된 AGE에서 주요한 약리적 효능을 나타내는 화합 물 중 SAC는 γ-glutamyl-S-allyl cysteine으로부터 가수 분해 후 생성되는 마늘의 중요한 성분이다(14). SAC는 심장 질환 예방, 항산화 활성 및 혈중 콜레스테롤을 포함한 지질 개선 효과를 향상시키며(15), 대장암, 위암, 유방암, 자궁경 부암, 신경모세포종 및 비소세포성 폐암세포와 같은 다양한 유형의 암세포주에 대하여 항암효과가 있는 것으로 밝혀져 있다(16).

장기간 숙성한 마늘 추출물은 자극성이 감소하고 유용한 생리활성 물질이 증가한다고 보고되어 있으나(15), 숙성에 장시간이 소요되는 단점이 있고 숙성 기간이 연구자마다 일 정치 않으며 가공에 따른 주요 화합물의 변화에 대한 자료가 미흡한 실정이다. 또한 마늘 중의 주요 생리활성 성분인 함 황화합물의 추출조건에 따른 변화 추이에 대한 연구 결과도 부족한 실정이다. 본 연구에서는 숙성 마늘 추출물 제조 시 추출용매에 따라 주요 황화합물의 용출 또는 마늘 내의 잔류 정도를 확인함으로써 함황화합물의 변화에 대한 기초 자료 를 확보하고자 주정의 첨가 비율을 달리한 용매를 이용하여 생마늘을 35일간 숙성하면서 황화합물의 변화 추이를 분석 하였다.

재료 및 방법

시료의 제조

마늘은 경남 남해군에서 생산된 1등급 마늘을 새남해농 협으로부터 깐마늘 형태로 구입하여 세척 후 자연 건조해 물기를 제거하여 시료로 사용하였다.

250 mL의 용기에 마늘을 100 g씩 넣고 물과 발효주정 ((주)우리주정, 부산, 한국)의 혼합 비율을 달리한 용매를 각 각 100 mL씩 가하였다. 즉 물(0%), 25, 50, 75% 주정 혼합 액과 주정(100%)을 각각 가하여 8°C의 냉장온도에서 35일 간 보관하면서 7일 간격으로 시료를 취하였다. 각 시료는 전체를 모두 여과지로 여과한 후 여액인 마늘 추출액(E0, E25, E50, E75, E100)과 추출용매가 제거되고 남은 잔사마 늘(R0, R25, R50, R75, R100)로 분리하여 각각을 시료로 사용하였다.

Alliin의 함량 분석

마늘 추출액은 여과된 액을 시료로 사용하였고, 잔사마늘 은 일부를 취해 90°C의 water bath에서 10분간 증숙 처리 한 후 균질하게 마쇄하여 alliin 분석용 시료로 사용하였으며, 마쇄한 잔사마늘 1 g에 20% 에탄올 30 mL를 가하고 30분 간 진탕 추출하여 원심분리기(Combi-514R, Hanil, Seoul,

Korea)로 3,000 rpm에서 10분간 원심분리 하였다. 원심분 리 한 상징액과 마늘 추출액 각각을 0.45 μm syringe filter 로 여과하여 HPLC-DAD(Agilent 1260, Agilent Tech- nologies, Santa Clara, CA, USA)로 분석하였다. 이때 col- umn은 Zorbax SB-C18(4.6×250 mm, 5 μm, Agilent Tech- nologies, Baltimore, MD, USA)을 사용하였고, 이동상은 20 mM sodium phosphate monobasic dihydrate와 10 mM sodium 1-heptane-sulfonic acid를 85% orthophos- phoric acid로 pH 2.0으로 조정하여 A용매로 사용하였으며, A용매와 acetonitrile을 동등한 비율로 혼합한 용매를 B로 하여 시간에 따라 gradient로 용리하여 분석하였다. 이때 이동상의 속도는 1.0 mL/min, 시료 주입량은 10 μL, UV 검출기 파장은 210 nm로 하였다. Alliin(ChromaDex Inc., Irvine, CA, USA)을 표준물질로 하여 얻은 검량선으로부터 총 함량을 산출하였다.

Allicin의 함량 분석

마늘 추출액은 0.45 μm syringe filter로 여과하여 HPLC- DAD로 분석하였고, 잔사마늘은 마쇄한 시료 1 g에 3차 증 류수 30 mL를 가하여 30분간 충분히 교반･추출한 다음 filter paper로 여과한 후, 3,000 rpm에서 10분간 원심분리 하고 상징액을 취하여 0.22 μm syringe filter로 여과한 것 을 HPLC-DAD로 분석하였다. 분석에는 Zorbax SB-C₁₈ (4.6×250 mm, 5 μm, Agilent Technologies) column을 사용하였고, 이동상은 0.1% formic acid containing water(A)와 0.1% formic acid containing acetonitrile(B)을 시간에 따라 gradient로 용리하여 분석하였다. 이동상의 속 도는 0.7 mL/min, 시료 주입량은 20 μL, UV 검출기 파장은 254 nm로 하였으며 동일조건에서 allicin(ChromaDex Inc.) 을 표준물질로 하여 얻은 검량선으로부터 총 함량을 산출하 였다.

SAC 함량 분석

마늘 추출액과 allicin 분석 시와 동일한 전처리 과정을 거친 잔사마늘 각각을 0.22 μm syringe filter로 여과하여 HPLC-PDA-MS/MS(TSQ Quantum LC-MS/MS, Ther- mo Scientific, Waltham, MA, USA)로 분석하였다. 분석 column은 Zorbax SB-C₁₈(4.6 m×250 mm, 5 μm, Agilent Technologies)을 사용하였고, 이동상 용매는 positive mode 에서 0.1% formic acid containing water(A)와 0.1% formic acid containing acetonitrile(B)을 시간에 따라 혼합 비율을 달리하면서 분석하였다. 이동상의 속도는 0.7 mL/

min, 시료 주입량은 10 μL로 하여 SRM mode에서 분석을 실시하였다.

Diallyl disulfide(DADS), diallyl trisulfide(DATS)의 함량 분석

마늘 추출액은 10 mL, 균일하게 마쇄한 잔사마늘 10 g을

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Table 1. Changes of alliin content in garlic extract and residual with different ratio of ethanol solution during 35 days at 8°C

Sample code Extraction days

7 14 21 28 35

Extract (mg/L)

E0 E25 E50 E75 E100

0.47±0.03âAB 0.45±0.01âA 0.63±0.10^bC 0.54±0.02âABC 0.55±0.01âBC

0.52±0.06âA 0.54±0.08âA 0.47±0.08âA 0.53±0.02âA 0.69±0.05^bB

0.75±0.07^bB 0.76±0.04^bB 0.65±0.03^bA 0.64±0.06^bA 0.71±0.03^bAB

0.92±0.05^cBC 0.96±0.04^cC 0.81±0.07^cA 0.84±0.03^cAB 0.81±0.06^cA

0.82±0.07^bcA 0.97±0.09^cB 0.71±0.03^bcA 0.81±0.07^cA 0.96±0.07^dB

Residual (mg/100 g)

R0 R25 R50 R75 R100

15.36±1.62^cA 30.89±3.77^bB 28.59±3.12^bB 30.74±3.18^cB 31.89±3.29^cB

16.00±2.01^cA 22.32±2.75^aB 21.73±2.71^aB 29.12±2.90^cC 26.30±2.98^bBC

14.42±1.19^cA 22.14±3.17^aB 24.66±2.08^aC 28.53±3.03^bcC 25.79±1.69^bC

5.17±0.24^bA 23.42±0.52^aB 23.85±0.63^aB 26.02±1.16^bC 26.16±1.44^bC

0.57±0.05âA 20.22±1.68âB 20.55±0.68âB 21.56±0.24âB 20.56±0.98âB Values with different small letters (a-e) within a row differ significantly (P<0.05).

Values with different capital letters (A-C) within a column differ significantly (P<0.05).

Each value represents mean±SD (n=3).

E0: water extract, E25: extract with 25% ethanol contained water, E50: extract with 50% ethanol contained water, E75: extract with 75% ethanol contained water, E100: ethanol extract.

R0: residual garlic from water extract, R25: residual garlic removed E25 from same condition, R50: residual garlic removed E50 from same condition, R75: residual garlic removed E75 from same condition, R100: residual garlic removed E100 from same condition.

각각 취해 hexane 50 mL를 가하고 30분간 진탕 추출한 후 hexane 층을 회수하여 회전증발농축기로 완전 건고하였 다. 이것을 hexane 2 mL로 재용해하여 0.22 μm membrane filter로 여과 후 가스크로마토그래피(Clarus 600, PerkinElmer Co., Norwalk, CA, USA)로 분석하였으며 분 석용 column은 Elite-5(Crossbond 5% diphenyl-95%

dimethylpolysiloxane, 30 m×0.25 mm×0.25 μm, Perkin Elmer Co., Norwalk, CA, USA)를 사용하였다. 분석 시 주 입구 및 검출기 온도는 각각 220°C 및 250°C로 유지하였 고, 오븐 온도를 40°C에서 1분간 유지한 후 분당 3°C씩 상 승시키면서 70°C에서 3분간 유지하다가 다시 분당 5°C씩 상승시켜 160°C에서 5분간 유지하면서 분석하였다. DADS 및 DATS(Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA)는 표 준물질을 시료와 동일한 조건에서 분석하여 머무름 시간을 비교해 확인하였으며, 각각의 검량곡선으로부터 그 함량을 산출하였다.

마늘 추출액의 항산화 활성

2,2-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonate) (ABTS; Sigma-Aldrich Co.) 라디칼 소거 활성은 Re 등 (17)의 방법에 따라 7 mM의 ABTS 용액에 potassium per- sulfate를 2.4 mM이 되도록 용해시킨 다음 암실에서 12~

16시간 동안 반응시킨 후 415 nm에서 흡광도가 1.5가 되도 록 증류수로 조정하여 사용하였다. ABTS 용액에 동량의 시 료액을 혼합해 실온에서 10분간 반응시킨 후 415 nm에서 흡광도를 측정하여 시료 무첨가구에 대한 시료첨가구의 흡 광도비로 라디칼 소거 활성을 산출하였다.

β-Carotene-linoleic acid 반응계에서 항산화 활성 평가 를 위하여 β-carotene의 탈색 정도를 측정하였다. β-Car- otene(Sigma-Aldrich Co.) 10 mg을 chloroform 10 mL에 용해시킨 후 linoleic acid 40 mg 및 Tween-40 400 mg을

혼합하고 40°C에서 감압 농축하여 chloroform을 제거하였 다. 잔류 emulsion에 3차 증류수를 가하여 100 mL로 만든 다음 기질액으로 사용하였다. 시료 20 μL와 기질액 200 μL 를 반응시킨 다음 490 nm에서 흡광도를 측정하고, 37°C에 서 30분 반응시킨 후에 한 번 더 흡광도를 측정하였으며, 대조구는 시료 대신 증류수를 사용하였다. 계산식은 [1－

(반응 전 대조구의 흡광도－시료 첨가구의 흡광도)/ (반응 전 대조구의 흡광도－반응 후 대조구의 흡광도)]×100을 사 용하였다(18).

통계처리

각 실험은 3~5회 반복 실험한 결과에 대하여 SPSS pro- gram(ver. 18.0, IBM Co., Endicott, NY, USA)을 사용하여 통계처리 하였으며, 각각의 시료에 대해 평균±표준편차로 나타내었다. 각 시료군에 대한 유의차 검정은 분산분석을 한 후 P<0.05 수준에서 Duncan’s multiple range test에 따라 분석하였다.

결과 및 고찰

Alliin 함량

추출용매의 주정 비율을 달리하여 35일간 마늘을 침지하 면서 7일 간격으로 추출액과 잔사마늘의 alliin 함량을 측정 한 결과는 Table 1과 같다. 추출물의 alliin 함량은 저장 7일 에 0.45~0.63 mg/L의 범위로 E25에서 가장 낮았고 E50에 서 가장 높았다. 저장 기간에 따른 alliin 함량은 추출용매의 주정 비율에 따라 상이하였는데 E25는 저장 28일까지 유의 적으로 증가하다가 35일에는 저장 7일에 비해 약 2.1배 증 가한 0.97 mg/L로 저장 28일과 유의차가 없었고, E100에 서는 저장 기간 경과와 더불어 지속해서 증가하였는데 저장 35일에는 저장 7일에 비해 약 1.7배 증가한 0.96 mg/L였다.

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Table 2. Changes of allicin contents in garlic extract and residual with different ratio of ethanol solution during 35 days at 8°C

Sample code Extraction days

7 14 21 28 35

Extract (mg/L)

E0 E25 E50 E75 E100

11.15±0.19âA 12.52±0.20âB 13.70±0.12âC 13.20±0.43âC 15.40±0.33âD

19.00±0.89^bB 19.40±1.30^bB 17.10±1.30^bA 16.20±0.01^bA 16.90±1.10^bcA

25.30±1.09^dC 25.12±0.75^cC 19.90±0.70^cA 21.80±0.71^cB 22.70±0.17^dB

27.53±0.90^eD 26.32±1.14^cD 22.30±0.56^cdC 20.10±1.20^cB 17.99±0.73^cA

22.30±1.14^cB 23.90±3.11^cB 22.50±2.57^dB 21.00±2.20^cB 16.10±1.01^abA

Residual (mg/100 g)

R0 R25 R50 R75 R100

15.90±3.10^aA 28.26±5.58^cB 24.11±4.28^dB 22.20±2.80^bAB 22.54±3.49^cAB

16.55±2.09^aB 18.11±1.16^bC 18.69±1.25^cC 13.06±1.87^aAB 11.77±1.18^bA

28.75±2.58^bC 17.11±1.02^bB 16.86±0.00^cB 11.42±0.15^aA 12.31±0.19^bA

35.64±0.21^cE 17.72±0.83^bD 14.32±0.59^bC 12.61±0.59^aB 8.08±0.39^aA

26.05±1.19^bD 10.72±0.37âBC 11.70±0.64âC 10.33±0.25âAB 9.43±0.41âbA Values with different small letters (a-e) within a row differ significantly (P<0.05).

Values with different capital letters (A-E) within a column differ significantly (P<0.05).

R0: residual garlic from water extract, R25: residual garlic removed E25 from same condition, R50: residual garlic removed E50 from same condition, R75: residual garlic removed E75 from same condition, R100: residual garlic removed E100 from same condition.

잔사마늘의 alliin 함량은 저장 7일에 R0이 15.36 mg/

100 g으로 가장 낮았고 주정이 비율별로 첨가된 R25~

R100에서는 R0보다 약 2배 정도 더 높은 28.59~31.89 mg/100 g으로 이들 간에는 유의차가 없었다. 저장 기간에 따른 잔사마늘의 alliin 함량은 추출용매에 따라 경향이 상이 하였는데, R0에서는 저장 21일까지 유의적인 변화가 없었 으나 저장 28일에는 저장 21일에 비해 약 64%가 감소하여 5.17 mg/100 g이었고 저장 35일에 더 감소하여 잔존율은 저장 7일 대비 약 4%에 불과하였다. 반면 R25~R100의 alliin 함량은 저장 14일에 21.73~29.12 mg/100 g으로 저장 7일에 비해 감소하였으며 R25와 R50은 저장 35일까지 유 의적인 변화가 없었다. R75와 R100은 저장 28일까지 변화 가 없다가 저장 35일에 각각 21.56 mg/100 g과 20.56 mg/100 g으로 감소하였다.

잔사마늘에서 alliin 함량은 저장 7일에 가장 높았다가 저 장 기간이 경과할수록 감소하여 추출액의 alliin 함량과는 상반되는 경향이었는데, 이는 마늘 중에 함유되어 있던 al- liin이 추출액 중으로 용출되었기 때문으로 판단된다. 추출 용매로 물을 사용한(E0) 경우 마늘 추출액 중의 alliin 함량 은 저장 7일이 비해 저장 35일에 1.7배가 증가하지만 잔사 마늘 중의 alliin은 약 96%가 감소되었는데, 감소된 alliin의 일부는 용매 중으로 용출되고 다른 화합물로 변환 또는 휘발 등에 의해 소실된 것으로 추정된다. 100% 주정으로 추출하 였을 때 추출액 중의 alliin 증가율은 약 174%로 동일하지만 잔사마늘 중의 alliin 감소율은 약 36%로 큰 차이가 발생하 였다. 이는 마늘 자체에 함유되어 있던 효소의 작용이 주정 내에서보다는 수용액 상에서 보다 용이하게 진행되면서 al- liin이 다른 화합물로 변화되었거나 용출된 성분들의 상호반 응이나 산화에 의해 alliin이 안정된 상태를 유지하기 어려워 다른 화합물로 변화되었기 때문으로 추정된다. 반면 주정

추출물의 잔사마늘은 효소의 실활로 인해 마늘 조직 내 al- liin이 상대적으로 더 안정한 상태로 유지되었기 때문에 감 소율이 더 낮았던 것으로 추측된다.

마늘 중 alliin은 전체 sulfoxides의 85% 정도이며 재배된 기후 조건에 따라서 sulfoxide 성분의 함량에 차이가 발생한 다(19). Alliin은 생마늘 중에 존재하는 무취인 수용성 황 함유 아미노산으로 열에 비교적 안정하나 마늘의 인경 부위 에 존재하는 alliinase 효소의 분해 작용에 의해 allicin을 생성하며 이렇게 생성된 allicin은 부패나 마늘 구근의 보호 작용을 한다(20). 또한 마늘의 황 성분은 마늘이 파괴되면서 allicin으로 변하거나 시간이 지나면서 thiosulfinate 화합물 로 변화하는데, 가공방법에 따라 allyl sulfide, di 또는 tri- allyl sulfide 등 다양한 성분으로 변화된다(21).

Allicin의 함량

추출용매의 주정 비율을 달리하여 35일간 저장하면서 추 출액과 남은 잔사 중의 allicin 함량을 분석한 결과는 Table 2와 같다. 추출용매의 주정 함유비율에 따라 추출물 중의 allicin 함량은 상이하였는데 저장 7일에 E0는 11.15 mg/L 로 가장 낮았고, E100에서는 E0보다 1.38배 더 높은 15.40 mg/L가 함유되어 있었다. E0는 저장 28일에 27.53 mg/L로 저장 7일에 비해 2.5배가 증가하여 전 시료 중 함량이 가장 높다가 저장 35일에는 22.30 mg/L로 감소하였다.

잔사마늘에서 allicin 함량은 저장 7일에 R0는 15.90 mg/100 g으로 타 시료에 비해 가장 낮았고, R25~R100은 22.20~28.26 mg/100 g으로 서로 간에 유의적인 차이는 없었다. R0에서 allicin 함량은 저장 28일까지 증가하여 7일 에 비해 약 2.2배가 증가한 35.64 mg/100 g으로 전 저장 기간 중 가장 높은 함량이었고 저장 35일에는 유의적으로 감소하였다. 반면 혼합 비율이 다른 주정 추출물을 제조하고

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aCaD aBCaB aA

bC bBC bA aA bAB

bBCcC cD

cB cA

cC dBC

dB dA dB

dDeC

eB eAB cA

aD aC aC aB aA

cE bcD aC

cB bA

bcD cCD bBC eAB eA

abCbC bcB dA

dA

aB bB aB bAcA

A B

Fig. 1. Changes of SAC content in garlic extract (A) and residual (B) with different ratio of ethanol solution during 35 days at 8°C. Each value represents mean±SD (n=3). Values with different small letters (a-e) within the same treatment differ significantly (P<0.05). Values with different capital letters (A-E)within the same storage days differ significantly (P<0.05). E0, water extract;

E25, extract with 25% ethanol contained water; E50, extract with 50% ethanol contained water; E75, extract with 75% ethanol contained water; E100, ethanol extract. R0, residual garlic from water extract; R25, residual garlic removed E25 from same condition;

R50, residual garlic removed E50 from same condition; R75, residual garlic removed E75 from same condition; R100, residual garlic removed E100 from same condition.

남은 잔사마늘(R25~R100)에서 allicin의 함량은 저장 기간 이 경과할수록 감소하는 경향을 보여 저장 35일에는 9.43~

11.70 mg/100 g의 범위로 R0에 비해 약 36.2~44.9% 더 낮은 함량이었다. R0를 제외한 잔사마늘에서 allicin 함량이 저장 7일에 가장 높고 그 이후부터 점차 감소한 것은 저장 초기에는 추출용매 중으로 빠르게 용출되었기 때문이며, 그 이후부터는 추출액 중에 용출되었거나 마늘 중에 잔존하던 화합물들이 대기 중의 산소, 추출용매 또는 마늘의 타 성분 들에 의해 변화되었기 때문으로 추정된다.

Kim 등(22)은 마늘장아찌의 숙성 기간과 allicin 함량과 의 상관관계를 살펴본 결과 숙성 5~10일 사이에 급격히 감 소한 후 숙성 40일에는 신선한 마늘에 비해 약 5.9%가 남았 다고 하였는데, 본 연구 결과에서도 allicin이 저장 기간의 경과와 더불어 감소하여 유사한 경향이었다.

Allicin 생성의 주요 효소인 alliinase는 열에 불안정하므 로 100°C 부근에서 가열하거나 pH 3 이하의 용액상태에서 불가역적으로 효소가 실활되며(23), 또한 생성된 allicin은 다양한 의학적인 치료효과를 나타내지만 화학적으로 불안 정한 화합물로 온도, 용매, 빛 등의 외적인 요인에 의하여 다양한 성분으로 변화한다(24). Allicin의 분해에 의해 생성 된 thiosulfinate류는 항산화, 항암작용, 면역조절기능, 항심 혈관질환, 콜레스테롤 감소 및 혈소판 응고 등의 건강증진 작용이 있다고 알려져 있다(21).

SAC의 함량

추출용매의 주정 비율을 달리하여 저장한 마늘 추출물과 잔사마늘의 SAC 함량을 측정하였다. 마늘 추출물의 SAC 함량(Fig. 1A)은 저장 7일에 11.15~15.4 mg/L이던 것이 저장 기간에 따라 증가하여 저장 35일에는 23.3~32.1 mg/

L의 범위였다. E0는 저장 28일까지 SAC 함량이 증가하다

가 저장 35일에는 23.3 mg/L로 감소하였으나 유의적인 차 이는 없었다. 주정이 함유된 추출물(E25~E100)에서는 저 장 21일에 E25는 25.1 mg/L로 가장 높은 함량이었고 28일 이후부터는 E100에서 함량이 가장 높았다.

잔사마늘의 SAC 함량(Fig. 1B)은 추출물들에 비해 더 높 아 저장 7일에 96.4~142.28 mg/kg의 범위였고 추출용매의 주정 비율이 높을수록 잔사마늘 중의 SAC 함량도 높아 R100 에서 가장 높았는데, 이는 주정이 첨가되지 않은 R0에 비해 약 1.5배가 더 높은 함량이었다. R100을 제외한 시료들의 SAC 함량은 저장 21일까지 증가하다가 이후 서서히 감소하 여 저장 35일에 113.5~140.2 mg/kg이었으며, R100은 저 장 14일에 164.3 mg/kg으로 추출물 중 SAC 함량이 가장 높았고 이후 감소하여 저장 35일에는 139.4 mg/kg이었다.

SAC는 γ-glutamyl-S-allyl-L-cysteine이 transpep- tidation에 의해 생성되고 oxidation에 의해 전환되어 생성 되는 것으로 보고되어 있으며(25), transpeptidation과 ox- idation의 정도에 따라 SAC의 함량이 변화되는데, 온도가 높고 숙성 기간이 장기화할수록 transpeptidation이 감소하 거나 oxidation이 증가하여 SAC의 함량은 낮아진다(26).

SAC의 구조적 특성으로 녹는점은 223.7°C, 흡습성은 거의 없으며, C-S 결합의 절단으로 초래될 수 있는 화학적 변형 과 변질은 산성 저장 상태에서 나타나지 않고 경구투여 후 위산에 의한 분해나 파괴 없이 흡수되며, 혈장에서도 안정하 여 표적세포까지 효과적으로 전달되어 생리적 활성을 나타 낼 수 있다(27).

DADS의 함량

추출용매의 주정 비율을 달리하여 저장 7일마다 추출물 과 남은 잔사마늘 중의 DADS 함량 변화를 살펴본 결과(Fig.

2) 추출용매 중의 주정 비율이 높을수록, 저장 기간이 경과

(6)

aA bC aA

bA

cB

cB cD

dB

dE dB

eE

bA dD

aA

cD

bD

bA abA

cA

aB bB

bD bC aE

cD dC cB bA

dD

eC

bC dC

bB

bC

dB

eC cB

dA

cA abC

aB aD

aC aBaA

A B

Fig. 2. Changes of DADS content in garlic extract (A) and residual (B) with different ratio of ethanol solution during 35 days at 8°C. Each value represents mean±SD (n=3). Values with different small letters (a-e) within the same treatment differ significantly (P<0.05). Values with different capital letters (A-E) within the same storage days differ significantly (P<0.05). E0, water extract;

할수록 추출물 중에서 함량은 점차 증가하는 경향이었다.

저장 7일 차 추출물에서는 1.9~2.2 mg/L이던 것이 저장 14일에는 주정 농도가 높을수록 함량 증가가 더 컸는데, E75는 12.5 mg/L로 저장 7일에 비해 6.2배 증가하여 가장 높은 함량이었고, 다음으로 E100에서 10.5 mg/L로 함량이 높았다. E50에서 DADS 함량은 저장 21일에 13.4 mg/L로 14일에 비해 약 3배 증가하여 추출물 중 증가폭이 가장 컸 다. E75와 E100에서 DADS 함량은 저장 28일에 급속히 증 가하여 각각 35.1 mg/L 및 41.2 mg/L로 E0에 비해 약 9.6 배 및 11.3배 더 높은 함량이었고 저장 35일에는 E100에서 84.5 mg/L로 추출물 중 가장 함량이 높았다.

잔사마늘에서의 DADS 함량은 추출용매에 따라 불규칙 한 증감을 보이면서 점차 감소하는 경향이었는데, 저장 21 일에 R0(19.1 mg/kg), R25(44.6 mg/kg) 및 R50(56.7 mg/

kg)은 최대치로 증가하였고 여타 시료는 저장 14일에 최대 치로 증가한 이후 함량이 감소하였다. DADS 함량은 추출용 매 중의 주정 비율이 높을수록 잔사마늘 중에서 더 빠르게 감소하였고, 상대적으로 추출액 중에서는 빠르게 그 함량이 증가하여 잔사마늘에서 소실된 대부분이 추출액 중으로 이 행된 것으로 추정된다.

Wan 등(28)은 마늘 분말 중 DADS 함량을 추출용매를 달리하여 측정한 결과 메탄올로 추출 시에는 0.61 mg/g, 벤 젠으로 추출 시에는 0.33 mg/g, tetrahydrofuran으로 추출 시에는 0.19 mg/g으로 추출용매에 따라 DADS의 함량은 서 로 상이하다고 하였는데, 본 연구에서도 추출용매의 주정 비 율에 따라 DADS의 함량에 차이가 있어 유사한 경향이었다.

DATS의 함량

추출용매 중 주정 비율을 달리하여 35일간 저온 저장하면 서 저장 기간에 따른 마늘 추출물과 추출물을 제거한 잔사마

늘에 잔류하는 DATS의 함량을 분석한 결과는 Fig. 3과 같 다. 추출물의 DATS 함량은 추출용매의 주정 비율이 높을수 록 더 많이 용출되었는데, 7일간 저장된 E100은 59.1 mg/L 로 DATS 함량이 가장 높았고, E25는 5.3 mg/L로 가장 낮 은 함량이었다. 저장 기간이 경과함에 따라 추출물 중의 DATS 함량은 급격히 증가하였는데, E100에서는 저장 7일 에 비해 35일에 약 16배 증가한 988.9 mg/L였으며, 75%

주정 추출물인 E75는 저장 35일에 801.6 mg/L로 함량이 증가하였다. 반면 추출용매 중 주정의 함유 비율이 50% 이 하인 시료들에서는 저장 35일에 241.0 mg/L 이하로 낮은 함량이었는데 특히 물 추출물에서 가장 낮았다.

추출 후 잔사마늘에서 DATS 함량은 전체 숙성 기간 중 18.3~98.8 mg/kg의 범위로 추출물보다 낮았다. 추출물 중 의 DATS 함량이 가장 높았던 100% 주정 추출 잔사마늘 (R100)의 DATS 함량은 13.8~86.4 mg/kg의 범위로 저장 14일에 가장 낮았다가 이후부터는 증가하는 경향이었다. 저 장 초기에 함량이 가장 높았던 R50의 DATS 함량은 저장 28일까지 지속해서 증가하여 98.8 mg/kg으로 가장 높았고 이후 가장 큰 폭으로 감소하였다. R75의 DATS 함량은 저장 21일까지 유의적으로 증가하여 71.5 mg/kg이었고 이후에 도 완만히 그 함량이 증가하여 저장 35일에는 89.6 mg/kg 으로 가장 높은 함량이었다.

Lee(29)는 마늘을 20% 주정에 침지한 후 1주일 간격으 로 마늘을 분리하고 침출주의 휘발성 향기성분을 분석한 결 과 DADS와 DATS는 4주째에 가장 많다가 5주째 다소 감소 하는 경향이라고 하였는데, 본 연구 결과에서는 물 추출물이 나 주정의 첨가 비율이 낮은 시료에서는 유사한 경향이었지 만 주정의 첨가 비율이 높은 시료들에서는 5주째에도 그 함 량이 증가하여 차이가 있었다. 이는 추출용매 중의 주정 농 도에 따라 용출되는 DADS 및 DATS의 농도가 상이하고

(7)

Table 3. ABTS radical scavenging activity of garlic extract from different ratio of ethanol solution for 35 day (%) Sample code Sample concentration (μg/mL)

1,250 2,500 5,000 10,000

E0 E25 E50 E75 E100

7.47±0.76âA 17.23±0.24âB 20.99±1.18âBC 27.30±4.70âD 22.45±1.43âC

13.50±0.37^bA 26.73±1.02^bB 34.13±7.18^bBC 49.96±2.44^bC 39.96±0.68^bBC

25.56±0.15^cA 49.43±2.18^cB 54.38±6.94^cC 60.08±7.59^bD 56.20±5.77^cC

46.91±0.76^dA 75.62±5.73^dC 81.01±2.60^dCD 87.52±7.55^cD 64.27±2.92^dB Values with different small letters (a-d) within a row differ significantly (P<0.05).

Values with different capital letters (A-D) within a column differ significantly (P<0.05).

aA

aA bD

aA bA aA bA

cC cD cE

bB bC

dE

dC dD

cB dB

eD

eC eB eE

aC

cB

aA bB aB

bC

dE

cD

bB eD dD

bA bA

dB dC

bA cC

aBaC aDaA

bB

aA aA

aA

cC cB

bA

eC

A B

Fig. 3. Changes of DATS content in garlic extract (A) and residual (B) with different ratio of ethanol solution during 35 days at 8°C. Each value represents mean±SD (n=3). Values with different small letters (a-e)within the same treatment differ significantly (P<0.05). Values with different capital letters (A-E) within the same storage days differ significantly (P<0.05). E0, water extract;

용출된 마늘의 성분 간의 반응도 영향을 받기 때문으로 추정 되는데, 이와 관련해서는 좀 더 장기간의 추출 및 저장과 관련한 연구가 요구된다.

ABTS 라디칼 소거 활성

주정 농도를 달리하여 35일 동안 저장한 마늘 추출물의 ABTS 라디칼 소거 활성을 비교한 결과는 Table 3과 같다.

물 추출물인 E0의 활성은 전 농도에서 주정이 첨가된 추출 물보다 낮았고 10,000 μg/mL의 농도에서도 50% 미만으로 낮았다. 추출용매 중의 주정 비율이 75% 이하인 시료들에서 는 주정의 첨가 비율이 많아질수록 ABTS 라디칼 소거 활성 은 점차 높아지는 경향으로 E75는 5,000 μg/mL의 농도에 서는 60.08%, 10,000 μg/mL의 농도에서는 87.52%로 가장 활성이 높았다.

Kang 등(30)은 에탄올 혼합 비율을 달리한 황마늘 추출 물의 ABTS 라디칼 소거 활성이 10 mg/mL의 농도에서 50% 에탄올 추출물은 27.42%, 100% 에탄올 추출물에서는 91.46%로 추출용매 중의 에탄올 비율이 증가할수록 활성도 증가한다고 하였고, Shin 등(31)은 온도를 달리하여 숙성한

마늘의 물 및 에탄올 추출물의 항산화 활성은 물 추출물에 비해 에탄올 추출물이 더 높다고 하였는데 이는 본 연구 결 과와 유사한 경향이었다.

Shin 등(32)은 생마늘, 홍마늘 및 흑마늘 추출물의 ABTS 라디칼 소거 활성을 측정한 결과 총 페놀 함량이 높았던 시 료에서 라디칼 소거 활성도 높았다고 하였으며, Kang 등 (30)도 황마늘의 에탄올 비율별 추출물의 총 페놀 및 폴리페 놀 함량을 측정한 결과, 물 추출물보다 100% 에탄올 추출물 에서 총 페놀은 3배, 폴리페놀은 35배가 더 높은 함량이며 alliin 및 SAC 함량도 물 추출물에 비해 100% 에탄올 추출 물에서 각각 3.5 및 3.9배 더 높다고 보고한 바 있다. 본 연구 결과에서 추출액 중의 주정 비율이 높을수록 항산화 활성이 더 높은 것도 물보다는 에탄올에서 마늘 고유성분 중 항산화 활성을 지니는 총 페놀화합물, 플라보노이드 및 SAC와 sul- fide류의 추출이 보다 용이하기 때문으로 생각된다.

β-Carotene linoleic acid system을 이용한 항산화 활 성 측정

산화에 의해 β-carotene이 탈색되는 것을 방지하는 효과

(8)

Table 4. Decolorzation protect effect of garlic extract from different ratio of ethanol solution for 35 days in β-carotene linoleic

acid system (%)

Sample code Sample concentration (μg/mL)

1,250 2,500 5,000 10,000

E0 E25 E50 E75 E100

7.25±1.58âA 23.05±2.21âB 31.44±0.72âC 39.40±0.52^bD 31.90±1.43âCD

16.79±0.64^bA 25.16±2.82âB 32.65±0.73âC 34.40±1.60âC 34.44±1.07âC

21.23±0.09^cA 27.10±3.14^aB 35.52±4.38^aC 37.55±1.06^bC 39.46±1.50^bC

21.88±1.82^cA 32.60±3.15^bB 42.99±0.88^bC 47.86±0.90^cD 44.96±1.58^cC Values with different small letters (a-c) within a row differ significantly (P<0.05).

Values with different capital letters (A-D) within a column differ significantly (P<0.05).

를 통해 항산화 활성을 측정한 결과는 Table 4와 같다.

1,250 μg/mL 농도의 E0에서는 7.25%로 가장 낮은 활성을 나타냈으나, E75에서는 39.40%로 추출물 중에서 가장 활 성이 높았다. 추출물의 농도가 증가할수록 β-carotene linoleic acid의 색소 유지 활성은 증가하는 경향으로 10,000 μg/mL의 농도에서는 E75가 47.86%로 가장 활성이 높았고 다음으로 E100과 E50이 서로 유의적인 차이 없이 활성이 높아 물 추출물보다는 주정 비율이 높은 시료에서 활성이 더 높았다.

Wu 등(33)이 콩잎의 용매별 추출물을 제조하여 지질 과 산화 억제 활성을 측정한 결과 수용성 추출물보다 에탄올 추출물이 1.8배 더 활성이 높았는데, 이러한 결과는 항산화 활성에 기여하는 콩잎에 함유된 플라보노이드 성분이 에탄 올 추출물에서 용출이 용이하기 때문이라고 하였다. 이는 본 연구에서 물 추출물보다 에탄올 추출물이나 에탄올의 함 유 비율이 더 높은 추출물의 활성이 더 높은 것과 일치하는 결과였다. 본 연구 결과에서는 페놀화합물이나 플라보노이 드와 같은 식물체 내에 존재하는 항산화성 물질 이외에 마늘 의 황화합물인 SAC, DADS 및 DATS 함량도 주정 추출물에 서 더 높아 항산화 활성 증대에 기여한 것으로 판단된다.

요 약

본 연구에서는 추출용매와 저장 기간에 따라 마늘의 주요 성분이 추출액 중으로 용출 또는 마늘 내에 잔류하는 정도를 확인하고자 에탄올이 0, 25, 50, 70 및 100% 혼합된 용매를 마늘 무게 대비 동량으로 가하여 8°C에서 35일간 저장하면 서 7일 간격으로 시료를 취하여 추출물과 남은 잔사마늘에 서 황화합물의 변화를 분석하였다. Alliin의 함량은 저장 기 간이 경과할수록 마늘 추출물에서는 증가하였으며 잔사마 늘에서는 감소하였다. Allicin 함량은 alliin의 함량 변화와 동일한 경향이었으며, 물 추출물에서 저장 28일에 27.53 mg/L로 가장 높은 함량이었다. S-Allyl-cysteine 함량은 추출물에서는 저장 기간이 경과할수록 증가하는 경향이었 는데 저장 35일에는 100% 주정 추출물에서 32.1 mg/L로

가장 높은 함량이었다. 추출물 중의 diallyl disulfide(DADS) 함량은 저장 기간이 경과할수록 증가하여 저장 35일에 100

% 주정 추출물에 84.5 mg/L로 가장 높았고 잔사마늘보다는 추출물에서 함량이 더 높았다. Diallyl trisulfide 역시 DADS 와 유사한 경향으로 추출물에서 저장 기간에 따라 함량이 증가하였는데 저장 35일에 100% 주정 추출물은 988.9 mg/

L로 물 추출물보다 약 80배 더 높은 함량이었다. 35일간 저 장된 마늘 추출물의 항산화 활성을 측정한 결과 ABTS 라디 칼 소거 활성은 75% 주정 추출물에서 가장 높았고 β-carotene linoleic acid를 이용한 항산화 활성은 1,250 mg/L 농 도에서 100% 물 추출물이 7.25%로 활성이 가장 낮았으나, 75% 주정 추출물에서 39.40%로 가장 높았다.

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