Antioxidant Activity of Fruits of Ligustrum japonicum

Article

http://dx.doi.org/10.4217/OPR.2017.39.2.115

여정실의 항산화 활성

서영완^1,2* · 김호준¹

1한국해양대학교 해양생명과학부

2한국해양대학교 해양과학기술전문대학원 (49112) 부산광역시 영도구 동삼동 1

Antioxidant Activity of Fruits of Ligustrum japonicum

Youngwan Seo^1,2* and Hojun Kim¹

1Division of Marine Bioscience, Korea Maritime and Ocean University

2Ocean Science and Technology School, Korea Maritime and Ocean University Busan 49112, Korea

Abstract : The objective of this study is to evaluate the antioxidant activity of the fruits of Ligustrum japonicum. The crude extract was successively fractionated into n-hexane, 85% aqueous methanol (85%

aq.MeOH), n-butanol (n-BuOH), and water fractions by means of solvent polarity. The crude extract and its solvent fractions were evaluated for their antioxidant effect by four different assay systems: scavenging power on peroxynitrite and intralcellular ROS produced in HT-1080 cells; DNA oxidation inhibition; ferric reducing antioxidant power (FRAP). The n-BuOH fraction exhibiting potent antioxidant activity was further purified by C18 silica gel column chromatography and RP-HPLC to give tyrosol (1) and salidroside (2).

The structure of isolated compounds was determined by extensive 2 D NMR experiments such as

H COSY, NOESY, HSQC and HMBC as well as by comparison with the published spectral data.

Key words : Ligustrum japonicum, antioxidant, reactive oxygen species (ROS), reactive nitrogen species (RNS)

1. 서 론

생체내에서는 내인성 혹은 외인성 자극에 의해서 활성 산소종(reactive oxygen species, ROS)과 활성질소종 (reactive nitrogen species) 이 생성되고 생체내 항산화방어 시스템은 이들이 과다하게 생성되는 것을 억제함으로써 산화환원 반응의 평형을 유지하고 생체 손상을 막는다 (Ziech et al. 2010; Persson et al. 2014). 활성산소종이나 활성질소종은 산소호흡에 의해서 생성되거나 산화환경에 노출되면 생성되기 때문에 원천적으로 이것들의 생성을

차단하기는 어렵다. 낮은 농도로 존재하는 활성산소종은 세포증식, 아폽토시스, 유전자 발현등과 밀접하게 관련되 어 있으며 대식세포내에서 생성되는 활성산소종은 박테리 아, 곰팡이와 같은 외부에서 침입하는 병원성 미생물을 죽 이는데 필수적이다(Poljsak et al. 2013). 하지만 이러한 평 형이 깨어지고 활성산소종이나 활성질소종이 과다생성될 때 산화스트레스가 발생된다(Lopez-Alarcona and Denicola 2013; Pisoschi and Pop 2015). 산화스트레스의 심각성은 심혈관질환, 신경퇴행성 질환, 알츠하이머, 파킨슨, 루게 릭, 폐기종, 심혈관 질환, 염증성 질환, 백내장, 암, 노화등 과 같은 많은 만성적인 건강문제의 발병에 관여하며 100가지 이상의 질병과 연관성이 있다는 것으로 알려져

*Corresponding author. E-mail : [email protected]

있다(Persson et al. 2014). 19세기 후반과 20세기 초반에 는 산업적인 관점에서 항산화제에 대한 연구가 이루어졌 으나 항산화제에 대한 생물학적인 연구는 비타민의 항산 화작용이 밝혀지면서 생체에서 항산화제가 중요하다는 것 이 인식되어 여러 가지 질병과 관련된 항산화제 활성에 대한 연구가 본격적으로 시도되었다.

염분이 있는 토양에서 자라는 식물을 염생식물이라고 부르는데 염생식물에 대한 정의는 연구자에 따라 다르지 만 일반적으로 내염성이 있으며 염분을 배출하거나 축적 하는 기작을 가지고 있는 식물이라고 할 수 있다(Kim 2006). 염생식물은 다른 육상식물들에 비하여 높은 염분함 량을 가지는데 이와 같이 높은 고염 스트레스는 식물조직 에 높은 산화스트레스를 유도한다. 문헌에 의하면 고염 스 트레스는 기체 교환을 감소시켜 잎 조직에 이산화탄소 공 급을 제한하고, 결국에는 광합성 전자 전달을 급감시키기 때문에 superoxide 음이온, 과산화수소 및 히드록실 라디 칼(hydroxyl radical)과 같은 다앙한 활성산소종의 생성을 유도한다고 알려져 있다(Ozgur et al. 2013; Bose et al.

2014; Canalejo et al. 2014). 따라서 염생식물들은 높은 염 분함량에 의한 산화스트레스를 해소하기 위하여 효소체계 를 비롯한 독특한 항산화기작을 발전시켜 왔으므로 특이 한 비효소 항산화물질 또한 함유할 가능성이 높을 것으로 여겨져 왔다(Bose et al. 2014).

우리 나라 남해안 바닷가에 주로 서식하는 광나무 (Ligustrum japonicum) 는 물푸레과에 속하는 아열대성 상 록수로서 내염성이 뛰어 나고 나무속에 많은 소금 성분을 함유하고 있어서 이 나무는 죽은 뒤에도 잘 썩지 않는다 고 한다(Ryu 2007). 이 광나무의 열매는 여정실 또는 여 정자라고 부르는데 이전부터 간과 신장을 튼튼하게 하는 보약으로 잘 알려져 있다. 여정자의 주요 성분으로는 mannitol, glucose, palmitic acid, stearic acid, oleic acid, linolenic acid 등과 파이토케미칼인 catechin, quercetin, acteoside, aucubin, betulinic acid, oleanolic acid, ursolic acid 가 있으며, 주요 기능으로는 대식세포의 TNF-α의 분 비 유도, 혈관이완 효과 및 골 형성 자극 효과 등이 있는 것으로 보고되었다(Han et al. 2010; Yun et al. 2014).

본 연구팀에서는 염생식물 자원이 항산화제의 원천으로 서의 가능성을 탐색하기 위하여 염생식물 추출물들에 대 한 항산화 활성을 스크리닝하는 과정속에 광나무의 열매 인 여정실 추출물이 유의적인 항산화 활성을 나타내었다.

따라서 본 연구에서는 여정실 추출물과 유기용매 분획을 제조하고 이들에 대한 peroxynitrite 소거능, 세포내 ROS 의 소거효과, DNA 산화 억제 등 항산화 활성을 검색하고 항산화 활성이 우수한 n-BuOH 분획으로부터 항산화 활 성성분을 분리하고자 하였다.

2. 재료 및 실험 방법

기기 및 시약

사용된 모든 유기용매는 사용하기 전 정제하여 실험에 사용하였으며, 성분분석은 Dionex P580 pump(Dionex, corporation, Sunnyvale, CA, USA) 와 Varian 350 refractive index detector (Varian Analytical Instruments, Walnut Creek, CA, USA) 로 구성된 high performance liquid chromatography (HPLC)를 사용하여 수행하였다. L-ascorbic acid, 2,2- diphenyl-1-picrylhydrazyl(DPPH), DL-2-amino-3-mercapto- 3-methylbutanoic acid(DL-penicillamine), dihydrorhodamine 123(DHR 123), 3-morpholinosydnonimine(SIN-1) 과 2',7'- dichloro-dihydrofluorescein diacetate(DCFH-DA)는 Sigma- Aldrich Co.(St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다. 그리 고 peroxynitrite(ONOO

) 은 Santa-Cruz Biotechnology Inc (Dallas, TX, USA) 에서 구입하였다.

시료의 추출, 분획 및 물질 분리

광나무의 열매인 여정실을 dichloromathane(CH

Cl

) 용 매에 24시간 동안 침지 후 여과하여 dichloromathane 추 출물을 얻었으며, 이 과정을 2회 실시하였다. 남은 잔사에 동량의 methanol(MeOH) 용매를 침지 후 여과하는 방식 을 사용하였으며, 이 과정을 2회 반복하였다. 이렇게 얻어 진 추출물을 감압회전증발기(rotavapor)를 이용하여 용매 제거를 한 후, CH

Cl

(9.12 g) 추출물과 MeOH(9.57 g) 추출물을 얻었다. 각각의 추출물을 합한 후에 용매분획을 실시하였다. 먼저 동량의 CH

Cl

와 H

O 의 혼합액을 만들 어 층을 분리한 후, 분리된 CH

Cl

층을 2차 분획하여 n- hexane(5.61 g) 층과 85% 메탄올 수용액(85% aq.MeOH, 4.63 g) 층을 얻었고, H

O 층도 2차 분획하여 n-butanol(n- BuOH, 3.30 g) 층과 H

O(5.15 g) 층을 얻었다.

n-BuOH 분획물을 MeOH과 H

O 의 혼합용매를 사용하 여 C

reversed-phase vacuum flash chromatography를 실시하였으며 모두 6개의 분획(50%, 60%, 70%, 80%, 90% aq.MeOH, 100% MeOH) 을 얻었다. 그 중 100%

MeOH 분획에 대한 reverse-phase HPLC(ODS-A, 20%

aq.MeOH)를 실시하여 tyrosol (1)과 salidroside (2)를 각 각 6.3, 3.3 mg 얻었다.

Tyrosol (1): an amorphous solid; ESI-MS M/z 139.0

[M+1];

H NMR (300 MHz, CD

OD) δ 7.00 (2H, d, J =

8.5 Hz, H-2, -6), 6.67 (2H, d, J = 8.5 Hz, H-3, -5), 3.67

(2H, t, J = 7.1 Hz, H-8), 2.70 (2H, t, H-7);

C NMR

(75 MHz, CD

OD) δ 156.1 (C, C-4), 130.8 (C, C-4),

130.7 (CH x 2, C-3, -5), 116.0 (CH x 2, C-2, -6), 64.6

(CH

, C-8), 39.4 (CH

, C-9).

Salidroside (2): a colorless material; ESI-MS M/z 301.1 [M+1];

H NMR (300 MHz, CD

OD) δ 7.04 (2H, d, J = 8.4 MHz, H-2, -6), 6.67 (2H, d, J = 8.4 Hz, H-3, -5), 4.28 (1H, d, J = 7.8 Hz, H-1’), 4.02 (1H, m, H-8), 3.85 (1H, dd, J = 11.7, 2.0 Hz, H-6’), 3.66 (1H, m, H-8), 3.64 (1H, m, H-6’), 3.32 (1H, m, H-3’), 3.28 (1H, m, H- 4’), 3.26 (1H, m, H-5’), 3.17 (1H, dd, J = 8.3, 8.3 Hz, H-2’), 2.82 (2H, t, J = 7.1 Hz, H-7);

C NMR (75 MHz, CD

OD) δ 156.6 (C, C-4), 130.8 (CH x 2, C-2, - 6), 130.5 (C, C-4), 116.0 (CH x 2, C-3, -5), 104.3 (CH, C-1’), 78.0 (CH, C-5’), 77.9 (CH, C-3’), 75.1 (CH, C- 2’), 72.1 (CH

, C-8), 71.6 (CH, C-4’), 62.7 (CH

, C-6’), 36.4 (CH

, C-7).

세포배양

인간섬유육종 세포주인 HT-1080 세포는 한국세포주 은 행(KCLB, Korean cell line Bank)에서 분양받아 실험에 사용하였다. 100 unit/mL의 penicillin-streptomycin과 10%

FBS(fetal bovine serum)가 함유된 DMEM(Dulbecco’s modified Eagle medium) 을 사용하여 37

C, 5% CO

배양 기(Forma scientific, Japan)에서 배양하였다. 배양된 세포 는 일주일에 2−3회 배지를 교환하고 6−7일 간격으로 계 대배양하여 실험에 사용하였다.

세포생존율 측정

HT-1080 세포를 MTT-assay를 이용하여 생존율을 측정 하였다. 배양된 세포가 well 당 1 × 10

cells/mL 가 되도록 96-well plate 에 분주하여 37

C, 5% CO

incubator 에서 24 시간 동안 배양한 후, 실험에 사용하였다. 각각 농도별 로 준비한 시료를 세포주에 처리하고, 대조군으로 시료대 신에 PBS를 처리하였다. 처리 후 37

C, 5% CO

incubator 에서 1시간 동안 배양한 후, 100 μL의 MTT용액(1 mg/

mL)을 첨가하여 37

C, 5% CO

incubator 에서 4시간 동안 배양하였다. 이때 formazan이 생성되는데, 이를 100 μL의 DMSO 에 녹여 ELISA reader(Bio-Tek instruments, Winooski, VT)로 540 nm에서 흡광도를 측정하였다(Hansen et al.

1989).

세포내 활성산소종(ROS) 소거능 실험

세포내 활성산소종 소거효과는 섬유육종 세포인 HT- 1080을 사용하였으며, 형광물질인 DCF-DA가 세포내 생 성된 자유 라디칼과 반응하여 형광물질인 DCF로 산화되 는 원리를 이용하여 측정하였다(Okimoto et al. 2000). 각 추출물과 용매 분획물은 200, 100, 50, 10, 1 μg/mL의 농 도로 희석하여 실험에 사용하였다. 대조군으로는 시료를 처리하지 않고 500 µM의 H

O

로 처리한 control과 시료

와 H

O

로 모두 처리하지 않은 blank를 실험에 사용하였 고, DCF fluorescence 값은 0분부터 120분까지 30분 간격 으로 측정하였다.

세포 내 자유라디칼 생성 정도는 DCF-DA assay로 측 정하였다. 섬유 육종 세포 HT 1080은 96 well plate에 5 × 10

cells/well로 분주하여 24시간 동안 37

C, 5% CO

배양기에서 배양한 후, Hank’s balanced salt solution(HBSS) 으로 희석한 20 μM의 2’,7’-dichlorodihydro fluorescein diacetate(DCF-DA, fluorescence probe)를 첨가하여 20분 간 배양하였다. 각각의 well에 농도별로 준비한 시료를 처 리하여 37

C, 5% CO

배양기에서 1시간 배양한 후, DCFH-DA 를 제거하고 PBS로 씻은 후 2시간 동안 500 μM 의 H

O

를 처리하였다. 세포 내 자유라디칼 생성 정도는 Victor3 multilabel plate reader 를 이용하여 λ

485 nm, λ

528 nm 에서 DCF(2’,7’-dichlorodihydrofluorescein) 형광강도를 측정하였다.

Peroxynitrite 소거능 실험

ONOO

소거 활성은 Kooy 등의 방법에 따라 dihydrorhodamine 123(DHR 123)의 산화되는 정도를 측 정함으로써 검색하였다(Kooy et al. 1994). ONOO

는 DHR13 과 반응하여 형광성 물질인 rhodamine 123으로 바 뀌게 되므로, dihydrorhodamine 123에 ONOO

와 SIN-1 을 처리하고 그 반응 생성물의 흡광도를 측정하여 시료의 peroxynitrite 소거능을 검토하였으며 대조군으로는 L- ascorbic acid와 penicillamine을 사용하였다.

DHR 123 은 dimethylformamide에 녹여 질소로 퍼지시 켜 −80

C에 보관하였고, DHR 123 용액의 희석은 암실의 얼음 위에서 조제하여 사용하였다. 완충용액은 90 mM sodium phosphate, 90 mM sodium chloride, 5 mM potassium chloride 를 혼합하여 pH를 7.4로 조절하여 100 µM DTPA (diethylentriaminepenta acetic acid) 를 혼합하여 냉장보관 하였고, buffer로 DHR 123을 5 µM로 희석하여 실험에 사용하였다. DHR 123 완충용액에 시료와 peroxynitrite를 첨가하고 실온에서 5분간 방치 후, Victor3 multilabel plate reader(PerkinElmer, Waltham, MA, USA) 를 이용하 여 λ

485 nm, λ

530 nm에서 측정하였다.

Authentic peroxynitrite 대신에 SIN-1을 첨가하는 경우는

동일한 방법으로 실시하여 1시간동안 방치한 후 측정하였

다. 이는 SIN-1이 NO•와 O

•

를 동시에 발생시켜 ONOO

를 생성시키는 화합물이기 때문에, DHR 123를 급속하게

산화시키는 authentic peroxynitrite와 다르게 DHR 123를

점진적으로 산화시키기 때문이다. Blank는 0.3 N NaOH

를 사용하였고, 실험은 3회 반복하여 실시하였으며, 결과

는 blank를 차감한 값을 평균하여 대조군에 대한 백분율

로 계산하였다.

Genomic DNA 추출 및 산화 생성물 측정

HT-1080 세포로부터 AccuPrepGenomic DNA Extraction kit(USA Bioneer, Inc.) 를 이용하여 genomic DNA를 추출 하였다. 추출되어진 genomic DNA에 각각 농도별로 준비 한 시료를 처리한 후, FeSO

, H

O

로 실온에서 산화시키 고, 30분 후 10 mM EDTA를 첨가하여 반응을 중지시켰 다. 이를 1% agarose gel을 이용하여 100 V에서 30분간 전기영동시켰다. 전기영동한 gel은 1 mg/mL ethidium bromide 로 염색하고, AlphaEase gel image analysis software (Alpha Innotech, San Leandro, CA, USA) 를 이용하여 UV 로 관찰하였다(Miline et al. 1993).

환원력(ferric reducing antioxidant power, FRAP) 측정 각각 농도별로 준비한 시료 0.2 mL, 200 mM sodium phosphate(pH 6.6) 0.2 mL 와 1% potassium ferricyanide 0.2 mL를 혼합하고, 이를 50

C에서 20분간 반응시켰다.

여기에 10% trichloroacetic acid 0.2 mL를 첨가한 후, 10,000 rpm 에서 10분 동안 원심분리하였다. 이후 상등액 0.5 mL와 0.1% ferric chloride 0.5 mL를 혼합하고, 700 nm에서 UV-Vis spectrophotometer로 흡광도를 측정하였 다. 대조군으로 vitamin C(L-ascorbic acid)를 사용하였으 며 환원력은 시료 용액 첨가군의 흡광도와 무첨가군의 흡 광도 차이로 나타내었다(Hong et al. 2007).

통계처리

대조군과 각 시료로부터 얻은 실험 결과들의 유의성을 검정하기 위하여 분산분석(ANOVA)을 행한 후 P < 0.05 수준에서 Duncan’s multiple range test를 실시하였으며, 그 결과는 평균(mean) ± 표준오차(standard error of mean, SEM)로 표시하였다. 모든 통계 분석은 statistic analysis system v9.1(SAS Institute Inc., Cary, NC, USA) 통계프 로그램을 이용하여 처리하였다.

3. 결 과

세포생존율 측정

여정실의 추출물과 추출물의 유기용매 분획층(n-hexane, 85% aq.MeOH, n-BuOH, water) 의 항산화 활성을 측정하 기 위해 섬유육종 세포인 HT-1080 세포의 생존율에 미치 는 시료의 영향을 확인하기 위해 MTT assay를 이용하여 세포생존율을 측정하였다. 이때 시료는 200, 100, 50, 10, 1 μg/mL의 농도로 희석하여 사용하였다. MTT assay를 이용한 세포생존율 측정 결과 HT-1080 세포에 대해서 n- hexane 분획층을 제외하고는 시료를 처리하지 않은 대조 군과 비교하였을 때 각 시료의 200 μg/mL 농도에서 모두 80% 이상의 생존율을 보였다. 하지만 n-hexane 분획층의 경우에는 100 μg/mL 이상의 농도에서는 60.3% 이하로 세포 성장을 억제 시키는 것으로 나타났으며 50 μg/mL의 농도에서 75.7%의 세포생존율을 보였다(Fig. 1). 따라서 n-hexane 분획층을 제외한 모든 시료에서는 200, 100, 50, 10, 1 μg/mL 의 농도에서, n-hexane 분획층의 경우에는 50, 10, 1 μg/mL의 농도에서 항산화 활성을 검토하였다.

세포내 ROS(reactive oxygen species) 소거능

Fig. 2 는 여정실 추출물 및 유기 용매분획층의 농도에 대한 세포내 ROS 소거효과를 2시간 후에 측정한 것이 다. 이 항산화 활성 측정법은 비극성분자인 DCFH-DA가 세포내로 용이하게 들어 간 후에 세포내 esterase 효소에 의해 acetate기가 떨어져 나가고 비형광성 물질인 DCFH 로 되고 이 물질이 활성산소에 의해 산화되어 형광물질인 DCF 로 바뀌는 원리를 이용하여 세포내에 존재하는 활성 산소종을 측정하는 것이다. 대조군으로는 시료를 제외하 고 500 μM H

O

만 처리한 control과 시료와 H

O

둘다 처리하지 않은 blank를 사용하여 비교하였으며 0, 30, 60, 90, 120 분 간격으로 DCF fluorescence 값을 측정하였다.

Fig. 1. Effects of crude extract and its solvent fractions from fruits of Ligustrum japonicum on viability in HT-

1080.

Means with the different letters at the same concentration are significantly different (P < 0.05) by

Duncan’s multiple range test. 85% aq.MeOH: 85% aqueous methanol, n-BuOH: n-butanol

대조군으로 사용한 control은 시간이 경과함에 따라 급격 히 증가하나 blank는 그 값의 변화가 거의 없었다. 200 μg/

mL 의 농도에서 2시간 후에 ROS 소거효과를 측정하였을 때 추출물, 85% aq.MeOH, n-BuOH, water 분획층은 각 각 61.3%, 68.9%, 75.8%, 70.3%의 소거능을 보였으며 n- hexane 분획층은 50 μg/mL의 농도에서 38.0%의 소거율 을 보였다.

Peroxynitrite 소거능

생체내에서 면역반응의 결과로 생성되는 NO는

superoxide 라디칼 이온과 반응하여 peroxynitrite를 생성 한다. Nitric oxide와 superoxide radical anion이 결합하여 생성된 peroxynitrite는 매우 반응성이 높고 생체에 손상을 가하는 강력한 산화제로서 염증성 감염 등과 같이 특정한 상태에서 대량 생성되는 것으로 알려져 있다. 또한 peroxynitrite는 전이금속의 존재하에서 활성산소종인 hydroxy radical 을 생성하기도 하고 수소이온이 첨가되어 강력한 산화제인 ONOOH를 형성하는데 이 ONOOH는 여러 생체분자에 존재하는 sulfhydryl group을 변형시켜 DNA, 단백질등에 심각한 손상을 가한다.

Fig. 2. Scavenging effect of crude extract and its solvent fractions from fruit of Ligustrum japonicum on intracellular ROS induced by hydrogen peroxide in HT-1080 cells.

Means with the different letters at the same concentration are significantly different (P < 0.05) by Duncan’s multiple range test. 85% aq.MeOH: 85%

aqueous methanol, n-BuOH: n-butanol

Fig. 3. Peroxynitrite scavenging activity of crude extract and its solvent fractions from fruits of Ligustrum japonicum:

(a) authentic peroxynitrite; (b) peroxynitrite induced from SIN-1.

Means with the different letters at the same concentration are significantly different (P < 0.05) by Duncan’s multiple range test. 85% aq.MeOH: 85%

aqueous methanol, n-BuOH: n-butanol, PA: penicillamine

Fig. 3 은 시료의 농도에 따른 authentic peroxynitrite와 SIN-1 에서 유도된 peroxynitrite에 대한 소거능을 나타낸 것이다. 각 추출물과 분획물, 대조군의 농도는 200, 100, 50, 10, 1 μg/mL 로 희석하여 사용하였으며 ONOO

소거 효과는 시료를 첨가하지 않은 대조군과 비교하여 백분율 (%) 로 나타내었다. 이때, SIN-1은 NO와 O

를 동시에 발 생시켜 ONOO

를 생성시키는 화합물로, ONOO

의 급속 한 DHR 123의 산화와는 달리 점진적으로 산화를 일으 킨다.

위의 실험 결과, n-hexane 분획층을 제외한 모든 시료 들이 200 μg/mL 농도에서 authentic peroxynitrite에 대해 서 80% 이상의 소거율을 나타내었고 n-hexane 분획층도 76.7% 의 소거율을 나타내었다. 또 n-BuOH과 water 분획 층은 10 μg/mL 농도에서도 각각 58.8, 62.9%의 소거 활 성을 나타내었다(Fig. 3a). SIN-1에서 유도된 peroxynitrite 에 대한 소거 활성 역시 authentic peroxynitrite 소거 활성 과 유사한 경향을 나타내어 n-hexane 분획층을 제외한 모 든 시료들이 200 μg/mL 농도에서 약 90% 이상의 소거 활성을 보였으며 10 μg/mL 농도에서도 85% aq.MeOH, n-BuOH, water 분획층은 각각 59.9, 80.6, 68.8%의 소거 활성을 나타내었다(Fig. 3b).

genomic DNA 의 산화억제능

섬유육종세포인 HT-1080 세포로부터 genomic DNA를 추출하여 시료로 처리한 후, 0.1 mM H

O

와 0.1 M FeSO

로 산화시켜, DNA의 산화정도를 측정하였다. 대조 군으로는 시료를 처리하지 않고 H

O

와 FeSO

로 산화시 킨 control과, 시료를 처리하지 않고 산화도 시키지 않은 blank를 사용하여 비교하였다. 모든 시료에서 농도의존적 인 산화 억제가 나타났으며 control과 비교하였을 때

10 μg/mL 의 농도에서도 추출물, n-hexane, 85% aq.MeOH, n-BuOH, water층 분획물은 각각 62.9%, 42.7%, 71.0%, 71.8%, 62.9% 의 산화 억제율을 보였다(Fig. 4).

환원력(ferric reducing antioxidant power, FRAP)의 측정

환원력의 측정은 항산화물질이 노란색의 ferricyanide 복합체(potassium ferricyanide)에 존재하는 Fe

이온을 Fe

이온의 형태로 환원시켜 나타난 파란색의 Perl's Prussian blue(분자식, Fe

[Fe(CN)

]

·xH

O)가 생성되는 정도를 700 nm에서 측정한 것인데 흡광도 수치 그 자체가 환원력을 나타내므로 환원력이 우수할수록 흡광도 수치가 크게 나타난다. 대조군으로는 시료를 처리하지 않은 control 을 100%로 두고 각각의 시료들의 환원력을 상대적 인 % 값으로 표시하였으며 비교하기 위하여 비타민 C의 환원력도 같이 측정하였다. Fig. 5에서 보여진 바와 같이 모든 시료들이 농도가 높아 질수록 환원력은 유의적으로 증가하였다. 용매 분획층들중에 n-BuOH 분획층이 다른 용매 분획층에 비하여 가장 높은 환원력을 나타내었으며 그 다음으로 85% aq.MeOH 분획물과 물 분획물이 거의 유사한 환원력을 보였고 n-hexane 분획물이 가장 낮은 환 원력을 보여 주었다. n-BuOH 분획층은 1 μg/mL의 농도 에서도 약 60%의 환원력을 보여 주었다(Fig. 5).

4. 고 찰

염분 스트레스는 식물의 기공이 닫히게 만들어 잎조직 내에 이산화탄소/산소 비율을 감소시켜 이산화탄소의 고 정이 억제되며 결과적으로 이것은 광합성의 전자수송에 문제를 야기시키게 되어 활성산소종(ROS)의 증가가 일어

Fig. 4. Inhibitory effect of crude extract and its solvent fractions from fruits of Ligustrum japonicum on DNA

oxidation.

Means with the different letters at the same concentration are significantly different (P < 0.05) by

Duncan’s multiple range test. 85% aq.MeOH: 85% aqueous methanol, n-BuOH: n-butanol

난다. 이 뿐만 아니라 Na

나 Cl

이온이 축적되어 발생하 는 이온독성 또한 식물의 엽록소나 미토콘드리아의 산화 환원 상태를 교란시켜 ROS의 생성을 야기시킨다(Bose et al. 2014). 이것은 산화스트레스를 야기시켜 막지질 과산 화, 단백질 산화, 효소 억제, DNA와 RNA의 구조변형등 을 통하여 세포를 손상시키고 결국 세포를 죽음에 이르게 한다(Gratão et al. 2005; Møller et al. 2007). 많은 연구에 의해서 항산화 방어능력이 증가하면 염분에 의한 산화적 손상이 완화되고 결국 염분내성이 증가된다는 것이 실제 로 많은 염생식물들에서 사실로 확인되었다. 이와 같이 염 분에 노출된 식물에서 발생되는 생화학적인 교란은 세포 내 ROS의 증가를 포함하는 복잡한 대사과정의 네트워크 를 통하여 일차 및 이차 대사과정과 연관되어 진다 (Boestfleisch et al. 2014). 이러한 염분 스트레스에 적응하 기 위하여 내염성 식물인 염생식물은 독특한 항산화 기작 을 발전시켜 왔다. 문헌에 의하면 내염성식물들이 중성식 물에 비해서 비타민 E, 폴리페놀 등과 같은 항산화물질들 을 더 높은 함량으로 보유하고 있음이 확인되었으며 실제 로 염생식물의 항산화 능력이 증가하는 것은 식물조직내 의 폴리페놀 축적과 밀접한 관련이 있다는 사실이 알려졌 다. 지금까지 발표된 문헌에 의하면 염생식물의 전체 폴리 페놀 함량이 중성식물(glycophyte)보다 2배 정도 높은 것 으로 보고되었다(Ksouri et al. 2012a,b; Bose et al. 2014).

이러한 연구결과는 내염성식물이 또 다른 독특한 항산화 물질을 함유할 가능성이 매우 높다는 것을 보여 주며 이 미 열대 염생식물인 맹그로브에서 다양한 골격의 많은 항 산화물질들이 분리된 바 있어 내염성 식물인 염생식물이 흥미있는 이차 대사물질의 원천으로서의 높은 잠재적 가 능성이 확인되었다.

본 연구에서 사용된 여정실의 유기용매 추출물은 HT- 1080 세포내에서 발생된 ROS에 대해서 좋은 소거활성을 나타내었을 뿐만 아니라 nitric oxide와 그리고 authentic peroxynitrite 및 SIN-1에서 유도된 peroxynitrite에 대해서 도 우수한 억제효과를 나타내었다. 또한 Fe

이온에 대해

서도 우수한 환원력을 나타내었으며 DNA 산화에 대해서 도 유의적인 억제효과를 나타내었다. 유기 추출물의 활성 성분을 추적하기 위하여 추출물을 용매극성에 따라 n- hexane, 85% aq.MeOH, n-BuOH, water 용매층으로 분획 하였고 각각의 분획층에 대해서도 항산화 활성을 검색하 였다. 이미 결과부분에서 언급된 것처럼 n-hexane 분획층 을 제외하고는 모든 용매분획층이 모든 항산화 활성검색 에서 좋은 효과를 나타내었으며 n-hexane 분획층도 nitric oxide 및 peroxynitrite 억제효과와 환원력 측정에 있어서 는 다른 용매분획층들 보다는 못해도 비교적 좋은 활성을 보였다. 또 다른 특이한 점은 추출물의 water 분획층이 상 당히 좋은 항산화 활성을 나타내었다는 점이다. 일반적으 로 유기 추출물을 용매분획하여 항산화 활성을 측정하면 water 분획층이 항산화 활성을 보이는 경우는 흔하지 않 다. 여정실 열수추출물의 항산화 활성은 이미 보고된 바 있는데 여정실의 유기용매 추출물의 water 분획층이 우수 한 활성을 보인 것도 문헌에 보고된 항산화 활성과 잘 일 치한다고 할 수 있다(Kang et al. 2007; Yun et al. 2014).

모든 용매분획의 항산화 활성결과를 고려할 때 n- BuOH 분획층이 가장 좋은 항산화 활성을 나타내었기 때 문에 n-BuOH 분획층으로부터 항산화 성분 분리를 시도 하여 n-BuOH 분획층으로부터 알려진 폴리페놀 성분인 tyrosol(1) 과 salidroside(2)를 분리하였다(Fig. 7). 여기서 salidroside 는 여정실에서는 처음으로 분리되었다. 문헌에 보고된 바에 의하면 tyrosol은 아미노산인 타이로신으로부 터 카복실기가 제거되어 생성된 물질이며 지중해 식단을 구성하는 올리브 오일의 주요한 페놀 구성성분들중에 하 나로서 과거 수 십년 동안 항미생물, 항트롬빈, 항염증, 심 장보호 등과 같은 다양한 생리활성으로 주목을 받았다 (Gris et al. 2011; Choe et al. 2012; Vlachogianni et al.

2015; Antenucci et al. 2016). Phenylpropanoid glycoside 인 salidroside는 이전에 참돌꽃(Rhodiola sachalinensis), 산청목(Acer tegmentosum) 등으로부터 분리되었으며(Kim et al. 2004; Lee et al. 2014), 항암, 항염증, 항저산소증, Fig. 5. Ferric reducing antioxidant power assay of crude extract and its solvent fractions from fruits of Ligustrum

japonicum.

Means with the different letters at the same concentration are significantly different (P < 0.05) by

Duncan’s multiple range test. 85% aq.MeOH: 85% aqueous methanol, n-BuOH: n-butanol

신경보호, 간보호, 심장보호 그리고 치매에도 좋은 효과가 있음이 보고되었다. 이 뿐만 아니라 salidroside는 과도한 산화스트레스에 의한 조직의 손상과 기능장애를 저지하여 항산화, 항노화 작용을 하는 것도 알려 졌지만 활성질소종 이나 세포내에 발생된 활성산소종에 대한 소거효과에 대 해서는 아직까지 보고된 적이 없다(Wang et al. 2010, 2015;

Yuan et al. 2013; Chang et al. 2015; Zhao et al. 2015; Si et al. 2016). 분리된 화합물 tyrosol(1)과 salidroside(2)에 대한 세포내 ROS와 peroxynitrite에 대한 소거효과를 측 정한 결과 Fig. 6에 보여진 것처럼 유의적인 항산화 활성 이 관측되었다. Tyrosol(1)과 salidroside(2)는 100 μM 농도에서 세포내 ROS에 대해서 각각 59.6과 71.0% 소 거율을 나타내었다(Fig. 6a). 또 활성질소종인 authentic

peroxynitrite와 SIN-1에서 유도된 peroxynitrite에 대해서 는 화합물 1과 2가 100 μM 농도에서 각각 66.7과 76.6%

Fig. 6. Scavenging effect of compounds 1 and 2 on intracellular ROS in HT-1080 cells (a), authentic peroxide (b), and peroxynitrite induced from SIN-1 (c).

Means with the different letters at the same concentration are significantly different (P < 0.05) by Duncan’s multiple range test

Fig. 7. Chemical structure of compounds 1 and 3

그리고 49.9와 58.7.1%의 소거율을 보여 주었다(Fig. 6b, c).

이상의 결과들로부터 여정실 유기용매 추출물과 극성에 따른 유기용매 분획물은 산화스트레스로 인해 생성되는 산소 및 질소활성종에 의한 산화적 손상을 억제하는 효과 가 있는 것으로 확인되었다. 특히 분리된 2개의 폴리페놀 계열의 화합물들은 활성산소종과 활성질소종에 대해 유의 적인 소거효과를 가지는 것으로 나타나 n-BuOH 분획층 의 항산화활성에 부분적으로라도 기여한다는 사실이 확인 되었으며, 추후 지속적인 연구를 통하여 이 분획층으로부 터 유사한 계열의 화합물들을 추가로 분리할 수 있을 것 으로 기대된다.

사 사

본 연구는 2015년 한국해양대학교의 재원으로 지원을 받아 수행된 연구결과입니다.

참고문헌

Antenucci S, Panzella L, Farina H, Ortenzi MA, Caneva E, Martinotti S, Ranzato E, Burlando BM, Napolitano A, Verotta L (2016) Powering tyrosol antioxidant capacity and osteogenic activity by biocatalytic polymerization.

RSC Adv 6:2993−3002

Boestfleisch C, Wagenseil NB, Buhmann AK, Seal CE, Wade EM, Muscolo A, Papenbrock J (2014) Manipulating the antioxidant capacity of halophytes to increase their cultural and economic value through saline cultivation.

AoB Plants 6:plu046:1−16

Bose J, Rodrigo-Moreno A, Shabala S (2014) ROS homeostasis in halophytes in the context of salinity stress tolerance. J Exp Bot 65:1241−1257

Canalejo A, Martínez-Domínguez D, Cordoba F, Torronteras R (2014) Salt tolerance is related to a specific antioxidant response in the halophyte cordgrass, Spartina densiflora. Estuar Coast Shelf S 146:68 −75

Chang X, Luo F, Jiang W, Zhu L, Gao J, He H, Wei T, Gong S, Yan T (2015) Protective activity of salidroside against ethanol-induced gastric ulcer via the MAPK/NF- κB pathway in vivo and in vitro. Int Immunopharmacol 28:604 −615

Choe KI, Kwon JH, Park KH, Oh MH, Kim MH, Kim HH, Cho SH, Chung EK, Ha SY, Lee MW (2012) The antioxidant and anti-inflammatory effects of phenolic compounds isolated from the root of Rhodiola sachalinensis A. BOR. Molecules 17:11484 −11494

Gratão PL, Polle A, Lea PJ, Azevedo RA (2005) Making the life of heavy metal stressed plants a little easier.

Funct Plant Biol 32:481 −494

Gris EF, Mattivi F, Ferreira EA, Vrhovsek U, Filho DW, Pedrosa RC, Bordignon-Luiz MT (2011) Stilbenes and tyrosol as target compounds in the assessment of antioxidant and hypolipidemic activity of Vitis vinifera red wines from Southern Brazil. J Agr Food Chem 59:7954 −7957

Han GS, Kim DS, Woo WH, Mun YJ (2010) Inhibitory effect of fructus Ligustri Lucidi on tyrosinase and MITF expressions. Korean J Orient Physiol Pathol 24:296−301 Hansen MB, Nielsen SE, Berg K (1989) Re-examination

and further development of a precise and rapid dye method for measuring cell growth/cell kill. J Immunol Methods 119:203−21

Hong J-H, Jeon J-L, Lee J-H, Lee I-S (2007) Antioxidant properties of Artemisia princeps Pamp. J Korean Soc Food Sci Nutr 36:657 −662

Kang S-H, Kim E-Y, Rhyu M-R, Kim D-I (2007) A study on effects of Ligustri Lucidi Fructus, Ecliptae Herba and Yijihwan on antioxidant activity and blood pressure. J Orient Obstet G 20:83 −96

Kim E-K (2006) Flora and soil characteristics on the reclaimed tidal flats in the west coast of Korea. Ph.D.

Thesis, Yonsei National University, 274 p

Kim SJ, Kim KS, Hwang SJ, Chon SU, Kim YH, Ahn JC, Hwang B (2004) Identification of salidroside from Rhodiola sachalinensis A. Bor. and its production through cell suspension culture. Korean J Med Crop Sci 12:203−

208

Kooy NW, Royall JA, Ischiropoulos H, Beckman JS (1994) Peroxynitrite-mediated oxidation of dihydrorhodamine 123. Free Radical Biol Med 16:149 −156

Ksouri R, Ksouri WM, Jallali I, Debez A, Magne C, Hiroko I, Abdelly C (2012a) Medicinal halophytes: potent source of health promoting biomolecules with medical, nutraceutical and food applications. Crc Cr Rev Biotechn 32:289 −326

Ksouri R, Smaoui A, Isoda H, Abdelly C (2012b) Utilization of halophyte species as new sources of bioactive substances. J Arid Land 22:41−44

Lee KJ, Song N-Y, Ma JY (2014) Isolation and bioactivity analysis of salidroside from Acer tegmentosum using on- line screening HPLC-ABTS

assay. KSBB J 29:24−130 Lopez-Alarcona C, Denicola A (2013) Evaluating the

antioxidant capacity of natural products: a review on chemical and cellular-based assays. Anal Chim Acta 763:1 −10

Miline L, Nicotera P, Orrenius S, Burkitt M (1993) Effects

of glutathione and chelating agents on copper-mediated

DNA oxidation: prooxidant and antioxidant properties of glutathione. Arch Biochem Biophys 304:102 −109 Møller IM, Jensen PE, Hansson A (2007) Oxidative

modifications to cellular components in plants. Annu Rev Plant Biol 58:459−481

Okimoto Y, Watanabe A, Niki E, Yamashita T, Noguchi N (2000) A novel fluorescent probe diphenyl-1- pyrenylphosphine to follow lipid peroxidation in cell membranes. FEBS Lett 474:137−140

Ozgur R, Uzilday B, Sekmen AH, Turkan I (2013) Reactive oxygen species regulation and antioxidant defence in halophytes. Funct Plant Biol 40:832 −847

Persson T, Popescu BO, Cedazo-Minguez A (2014) Oxidative stress in Alzheimer's disease: why did antioxidant therapy fail. Oxid Med Cell Longev 2014:427318

Pisoschi AM, Pop A (2015) The role of antioxidants in the chemistry of oxidative stress: a review. Eur J Med Chem 97:55 −74

Poljsak B, Suput D, Milisav I (2013) Achieving the balance between ROS and antioxidants: when to use the synthetic antioxidants. Oxid Med Cell Longev 2013:956792 Ryu JB (2007) Ligustrum japonicum. Korea Beekeep Bull

321:41 −42

Si P-P, Zhen J-L, Cai Y-L, Wang W-J, Wang W-P (2016) Salidroside protects against kainic acid-induced status epilepticus via suppressing oxidative stress. Neurosci Lett 618:19 −24

Vlachogianni IC, Fragopoulou E, Kostakis IK, Antonopoulou S (2015) In vitro assessment of antioxidant activity of tyrosol, resveratrol and their acetylated derivatives. Food Chem 177:165 −173

Wang H, Gan D, Zhang X, Pan Y (2010) Antioxidant capacity of the extracts from pulp of Osmanthus fragrans and its components. J Food Sci Technol 43:319−325 Wang S, He H, Chen L, Zhang W, Zhang X, Chen J (2015)

Protective effects of salidroside in the MPTP/MPP+- induced model of Parkinson's disease through ROS-NO- related mitochondrion pathway. Mol Neurobiol 51:718 − 728

Yuan Y, Wu S-J, Liu X, Zhang L-L (2013) Antioxidant effect of salidroside and its protective effect against furan-induced hepatocyte damage in mice. Food Funct 4:763 −769

Yun S-B, Lee Y, Lee NK, Jeong E-J, Jeong Y-S (2014) Optimization of microwave extraction conditions for antioxidant phenolic compounds from Ligustrum lucidum Aiton using response surface methodology. J Korean Soc Food Sci Nutr 43:570 −576

Zhao G, Shi A, Fan Z, Du Y (2015) Salidroside inhibits the growth of human breast cancer in vitro and in vivo.

Oncol Rep 33:2553−2560

Ziech D, Franco R, Georgkalikas AG, Georgakila S, Malamou-Mitsi V, Schoneveld O, Pappa A, Panayiotidis MI (2010) The role of reactive oxygen species and oxidative stress in environmental carcinogenesis and biomarker development. Chem Biol Interact 188:334−

339

Received Mar. 21, 2017

Revised Apr. 13, 2017

Accepted Apr. 15, 2017