주조된 매크로 다공성 Poly(glycidyl methacrylate-co-ethylene glycol dimethacrylate) 막대를 이용한 카페인과 트립토판의 분리
김룡매·염홍원·노경호†
인하대학교화학공학과, 초정밀생물분리기술연구센터
402-751 인천시남구용현동 253 (2005년 6월 20일접수, 2005년 9월 8일채택)
Separation of Caffeine and Tryptophan Using Molded Macroporous Poly(glycidyl methacrylate-co-ethylene glycol dimethacrylate) Rods
Longmei Jin, Hongyuan Yan and Kyung Ho Row
†Center for Advanced Bioseperation Technology and Department of Chemical Engineering, Inha University, 253, Younghyun-dong, Nam-gu, Incheon 402-751, Korea
(Received 20 June 2005; accepted 8 September 2005)
요 약
주조된매크로다공성 poly(glycidyl methacrylate-co-ethylene glycol dimethacrylate) 막대를간단한주형과정을거 쳐서실험실내튜브모양의주형인크로마토그래피칼럼(4.6×100 mm)을사용하여자유라디칼중합에의해만들었다.
이는에폭시그룹이유도된일체형칼럼과황산을이용한에폭시드그룹의화학적인변형과정을이용하였다. 단량체 및포로겐(세공을생성하는물질)의비율, 온도등중합반응의조건을변화시켜서세공크기를조절하여물질의체류시 간에영향을미쳤다. 본연구에서는주조된일체형칼럼을이용하여카페인과트립토판을분리하였으며, 중합원료조성 이일체형칼럼의효율과선택도그리고분리도에미치는영향을고찰하였다.
Abstract −The molded macroporous poly (glycidyl methacrylate-co-ethylene glycol dimethacrylate) rods produced by a facile molding process were polymerized in situ within a tubular mold, chromatographic column (4.6×100 mm) by free radical polymerization. It was complemented by epoxy derivatized monolithic column and chemical modification of the epoxide groups with the sulphuric acid. By variation of the polymerization conditions, such as the ratio of the mono- mers, the porogen(pore generating material), and the temperature, the pore size could be varied, so the retention time of the samples may be adjusted. For the mixture of caffeine and tryptophan in the prepared monolithic column, the influ- ences of polymerization material compositions to the efficiency, selectivity, and resolution of the monolithic column were investigated.
Key words: Separation, Macroporous Monolithic Column, Polymerization, Modification
1. 서 론
1990년대초, 단량체와포로겐의혼합물을닫힌튜브또는다른
용기안에서자유중합시키는아주간단한 ‘조형’ 과정에의해형성 한, 다른종류의경직된매크로다공성일체형칼럼의발전을보였
다[1]. 다공성무기재료가촉매작용과크로마토그래피영역에서널
리쓰이는아주대중적인지지체이기때문에 [2], 실리카로부터만 들어진일체형칼럼은유기중합체와거의동시에발전하였다[1].
현재일체형크로마토그래피지지체는마이크로칩에서부터제조용
정제까지아주많은영역에사용되고있다[3]. 이것은그들의가장
중요한장점인편리한일체형태의크로마토그래피지지체의특징 을 갖고 있기때문이다. 비더로 채워진형태의 칼럼은 용액의
channeling을겪어야하므로지지체의효율이떨어진다. 하지만, 일
체형칼럼은고도의다공성재료로만들어진하나의일체이기에이 런문제점이없다. 대류에의한전달과높은동적공극률은일체형
칼럼의아주뛰어난성질이다[4].
일체형칼럼은아주다양한단량체를사용할수있으며높은외 부공극률의구조로되어있음으로준비과정이입자로채워진칼럼 보다더욱좋은융통성이있다. 또한, 높은공극률은높은투과성과 낮은압력강하를가져올수있다[5]. 실리카일체형칼럼은 80％이 상의아주높은공극률을보여주며작은분자의역상분리와정제
에주로사용된다. 반면에 methacrylate 일체형칼럼은단백질과핵
†To whom correspondence should be addressed.
E-mail: [email protected]
산, 바이러스등과같은고분자의정제를위한분리에사용된다[6].
Styrene, methacrylate, acrylate, acrylamide 또는환상의단량체로부 터만들어진중합체일체형칼럼은이미보고되었다[1]. 중합체입 자에의해만들어진칼럼의효율은일반적으로실리카입자로채워 진재래식칼럼보다는더낮지만, 몇몇고성능중합체일체형칼럼 은생물학고분자를위한일체형칼럼시장의상당한부분을차지 할것이다[5].
Methacrylate, acrylate, acrylamide 일체형칼럼가운데어느종류 의일체형칼럼도일정용매조성의 HPLC 조건하에서넓은범위의 물질들에대해높은칼럼효율을제공하지못하였다. 때문에최적 화는각자의준비과정에서필수적이다. 중합체일체형칼럼, 특히 친수성중합체일체형칼럼은실리카재료보다더욱높은단백질 친화성을보이고있으며생체고분자의기울기용매조성의분리에 유용하다[5].
몇개의시스템변수는넓은범위에서일체형칼럼의다공성성 질을조절할수있으며, 일체형장치의유체역학적성질을조절하 는데이용될수있다. 기능적인단량체의직접적인혼성중합, 활성 그룹의화학적인변형및선택된중합체사슬의세공표면의접붙이 기와같은다양한방법은표면의화학적인성질을조절하는데이용 될수있다[1].
주조된 poly(glycidyl methacrylate-co-ethylene glycol dimethacrylate)
일체형칼럼의에폭시드(epoxide) 그룹은많은물질과반응하여이
온교환체를형성한다[7-13]. 본연구에서는황산을이용하여 poly (glycidyl methacrylate-co-ethylene glycol dimethacrylate) 일체형연 속막대를변형하여친수성의칼럼표면을형성하였다. 이를통해 카페인과트립토판의분리를하였으며두물질의선택도, 분리도등 을분석하였고, 아울러중합반응의조건이일체형칼럼의효율과선 택도등에미치는영향을분석하였다.
2. 이 론
일체형칼럼의질량과부피등을측정하고, 칼럼의공극률은아 래와같은식 (1)에의해계산하였다.
(1) (2)
위식에서ε은공극률(/)을말하며∆m은만들어진초기일체형 칼럼과건조된일체형칼럼의질량차이(g)를말하며ρ는액상중합 혼합물질의밀도(g/ml)를말한다. 또한, Vw는초기일체형칼럼의 부피(ml), Vd는건조된일체형칼럼의부피(ml)를각기말한다[4].
시료의체류인자(k)는다음식으로표시할수있다.
(3)
이식에서 t0은무용시간(dead time)이고, tR는시료의체류시간이 다. 피크의너비는칼럼의효율과관계되며, 이동상과고정상의특 성에따라서칼럼의분리도는영향을받게된다. 또한, 용출시간은 체류인자와관계된다. 칼럼의효율은칼럼의이론단수(N)에의해표
시되며아래식에의해구하였다[8].
(4)
여기서 w1/2는피크높이를기준으로 1/2지점에서의시료의피크
폭이다[14]. 칼럼의선택도(α)는피크의상대적인분리에의해측정
되며아래식으로표현할수있다.
(5)
여기서 tR1과 tR2는선후로용출되는두피크의체류시간을말한 다. 분리도(R)는두피크의차이(∆t)와피크의평균폭(w)으로정의 되며아래식으로표현할수있다. 분리도는체류시간과피크폭의 단위가시간과길이로표시되기에무차원이된다.
(6)
여기서 w1, w2는각기두물질의피크폭을말한다.
3. 실 험
3-1. 시약및 기기
단량체 glycidyl methacrylate(GMA)는 TCI organic chemicals(Tokyo, Japan)에서, 가교제인 ethylene glycol dimethacrylate(EGDMA)는
Fluka(Buchs, Switzerland)에서구입하였다. 개시제인 azobisisobutyronitrile (AIBN) 그리고포로겐인 dodecyl alcohol과 cyclohexanol은각기
Junsei Chemical(Tokyo, Japan), Ducksan Pharmaceutical(Kyungki- Do, Korea), Kanto Chemical(Kyungki-Do, Korea)에서구입하였다.
황산과메탄올은모두Ducksan Pure Chemical(Kyungki-Do, Korea)
에서 구입하였고 L-tryptophan과 caffeine은 Sigma(St. Louis, MO, U.S.A.)에서구입하였다. 물은 2차증류수를감압펌프(Division of Millipore, Waters)와여과지(FH-0.45µm)로여과하여사용하였다.
본 연구에서사용된 HPLC장치로는 M930 펌프(solvent delivery pump, Young Lin Co.)와 M720 UV detector(Absorbance Detector, Young-In Scientific Co.) 그리고 10 ml 샘플루프를연결한 Rheodyne
주입밸브로구성되었으며데이터출력장치로는 Autochrowin(Ver.
1.42, Young Lin Co.)을사용하였다.
3-2. 실험방법
메탄올을 100％또는 2차증류수와혼합하여 90:10 vol％의혼합 용액을만들어서이동상으로사용하였고시료는모두메탄올에녹 여준비하였다. 이동상저장용기안에헬륨가스를넣어탈기처리를 진행하였다. UV 검출기의파장은 280 nm로고정하였고 HPLC 실 험은상온에서진행하였다.
3-3. 중합체일체형칼럼의준비
간단한조형과정에의해만들어지는경직된매크로다공성유기 중합체일체형칼럼의준비는아주간단하고직접적이다. 주형인
100×4.6 mm 크기의스테인리스스틸크로마토그래픽칼럼의한쪽
끝을폴리에틸렌필름으로막고고무밴드로밀봉하고, 반대편주입 구부터진공처리를한중합혼합물을천천히채우고역시같은방
법으로밀봉한다. Table 1과같이중합혼합물은단량체 glycidyl
methacrylate(GMA), 가교제인 ethylene glycol dimethacrylate(EGDMA),
그리고포로겐인 cyclohexanol 과 dodecyl alcohol을포함한다. 개시 ε (∆ ρm⁄ )–∆V
Vd
---
= V
∆ =Vw–Vd
k tR–t0
t0
---
=
N 5.54 t= ⎝⎛w---1 2R⁄ ⎠⎞2
α=tR2⁄tR1
R 2 t= (R2–tR1)⁄(w1+w2)
제인 AIBN을상술한네가지중합혼합물에넣고초음파처리를
15분간하고다음에헬륨가스로 10분동안반복진공처리를해서 칼럼에천천히채워넣는다. 그다음에 55oC 항온수조에넣어서 24
시간유지하여중합반응을유도한다. 중합반응이끝나면밀봉처리 를제거하고펌프에연결하여메탄올, 물로일체형칼럼을 2시간정 도세척하여칼럼내에존재하는포로겐과기타가용성물질을제 거한다. 여기서중합혼합물의양은여러가지비의조성으로실험 을하였다. 이를테면단량체와가교제의혼합비를 1:1로하거나혹 은 2:1로하였을때얻어지는칼럼의압력이많은차이가있었다.
단량체의비가클수록칼럼의압력은증가하였으며구조가유사한 물질을칼럼에주입하였을때시료의체류시간에큰차이가없어 물질분리가잘이루어지지않았다. 하여본실험에서는단량체
(GMA) 1.1 ml, 가교제(EGDMA) 0.65 ml, 포로겐인 cyclohexanol 0.4 ml, dodecyl alcohol 3.5 ml 그리고개시제인 AIBN은 0.045 g으 로혼합한것을사용하였다.
Fig. 2에서는만들어진 poly(glycidyl methacrylate-co-ethylene glycol
dimethacrylate) 막대를황산과반응시켜친수성의화학표면을갖는
과정을보여준다. 우선 0.25 mol/ml 황산을 0.5 ml/min으로펌프에 연결하여칼럼에통과시킨다. 마지막으로황산으로처리된일체형 칼럼을메탄올, 물로세척한다. 이렇게하여세공표면에친수성의 화학구조를얻을수있다.
4. 결과 및 토론 4-1. 유체역학성질
만들어진 poly(glycidyl methacrylate-co-ethylene glycol dimethacrylate)
일체형칼럼은에폭시드(epoxide) 그룹이있으며이는소수성이기
때문에생체고분자등을분리하기어렵다. 친수성물질을이용하여 구조표면의에폭시드그룹을화학적으로변형하여친수성의표면으
로만들었다. Fig. 2와같이황산과반응함으로써두개의히드록실
기(-OH)를갖는친수성의표면구조의일체형칼럼이얻어진다.
4-2. 압력강하
Fig. 3에서는만들어진친수성 poly(glycidyl methacrylate-co-ethylene
glycol dimethacrylate) 일체형칼럼에서는압력과이동상의유속간
의선형관계를보여주고있다. 단량체와가교제의혼합비를각기약
1:1, 2:1, 3:1로변화시켰을때얻어지는일체형칼럼의압력은크게
변하였다. 혼합물가운데단량체의함량이클수록칼럼의압력은커 졌다. 또한, 이동상의유속이커질수록일체형칼럼의압력도점차 커졌다. 본실험에서단량체와가교제의함량비가약 2:1로만들어 진일체형칼럼의압력은유속을증가하여도매우낮았다. 이것은 일체형칼럼의아주중요한장점의하나로서일체형칼럼의구조에 관계된다. 일체형칼럼은내부가서로연결된골격의고체상및유 체흐름통로의단일체로구성되었다. 골격이작고또한유체흐름통
로(through-pore)가크면확산통로길이와유체저항이채워진입자
칼럼에비해현저하게감소한다. 일체형칼럼의낮은압력강하는긴 칼럼과높은유속을이용하여빠르고효율적인분리를할수있다 는것을의미한다.
4-3. 일체형칼럼을이용한물질분리
Fig. 1에서는카페인과 (L)-트립토판의화학적인구조식을보여주
고있으며 Fig. 4에서는황산으로변형된 poly(glycidyl methacrylate- co-ethylene glycol dimethacrylate) 일체형칼럼을이용한경우에서 카페인(0.5 mg/ml)과 L-트립토판(1 mg/ml)의분리크로마토그램을
Table 1. Conditions for preparing the polymerization mixture
Substance Volume (ml)
Initiator AIBN 0.045-0.064 (g)
Monomer GMA 0.7-1.2
Crosslinker EDMA 0.4-0.9
Porogen Cyclohexanol 0.4
Dodecyl alcohol 3.4-4.4
*Polymerization temperature, 55oC; polymerization time, 24 h.
Fig. 1. Chemical structure of caffeine and L-tryptophan.
Fig. 2. Chemical modification scheme for preparation of the hydro- philic monolithic column.
Fig. 3. Relationship between flow rate and column pressure. (Column:
100×0.46 cm I.D.; Mobile phase: methanol; I: GMA 0.7 ml, EGDMA 0.9 ml, II: GMA 1.1 ml, EGDMA 0.65III: GMA 1.2, EGDMA 0.4 ml).
보여주고있다. 이동상(메탄올)의유속을 0.2에서 1 ml/min로점차 증가시켜서실험을한결과에의하여유속이낮은경우, 두가지혼 합시료의용출피크는아주넓은피크넓이를보여주고있다. 반면 에유속이커짐에따라피크넓이는점차줄어들고피크모양이뾰 족하게변하여서더욱좋은분리효과를보여주었다. 또한, 유속을 증가함으로써물질의분석시간을줄일수있었다. 위와동일한실 험조건하에서칼럼의공극률(ε)은식 (1)에의해구하였다. 만들어 진초기일체형칼럼의무게와 50oC 드라이오븐에서건조한건조 된일체형칼럼의무게를각기측정하였으며, 이두상태에서의부 피도각각측정하였다. 또한, 반응전중합혼합물의밀도도측정하
였다. 이렇게구해진일체형칼럼의공극률은 0.54이었다[4].
Fig. 5에는 Fig. 4에서사용한동일한칼럼을사용하였으며, 이동상으 로메탄올과물의혼합용액(90:10 vol％)을사용하였다. 유속이 0.6에서
0.8ml/min로증가함에따라서용출되는 (L)-트립토판피크넓이가커진
것을볼수있다. 이것은이동상에극성인물을첨가함으로써같은극
성인 (L)-트립토판이칼럼에서의체류가적어진다는것을알수있다.
Table 2에서는 Fig. 4와 5의분리크로마토그램에서얻어진두가 지물질의체류시간을보여주고있으며, 식 (4)-(6)에의해구해진 칼럼의이론단수, 선택도와분리도를보여주고있다. 식 (4)에의해 구해진칼럼의이론단수는이동상이메탄올일경우, 유속이높을때
비교적컸으며각기 98, 187이었으며반면에이동상이메탄올과물
의혼합물일경우, 유속이낮을때비교적큰값인 133, 60을얻었다.
Table 2에서보는바와같이이동상이메탄올일때, 유속이 1 ml/min
일때의칼럼의선택도(1.55)와분리도(1.10)가가장좋았으며, 이동
상이메탄올과물의혼합물일때유속이 0.8 ml/min 일때의칼럼의
선택도(2.28)와분리도(1.17)가더좋았다.
본실험에서카페인과 (L)-트립토판두가지물질에대해비교
적 낮은선택도를얻었다. 이것은만들어진칼럼의다공성성질 에관계되며 포로겐의성질및단량체와포로겐의비율등에관 계될것이다. 일체형칼럼은유체투과성이우수하며이는그들의 세공크기에 의존한다. 다공성중합체구조에는보편적으로미세 공을갖고 있는데이는칼럼의효율과 피크의 대칭성에부정적 으로작용한다.
칼럼내에서균일한다공성구조를갖는원통모양의일체형칼럼 의준비는단순한중합반응단계로이루어지는데, 이런큰크기의 일체형칼럼은수동적인조작과정가운데여러가지오차가발생할 수있으므로준비하기가어렵다. 하지만, 중합일체형칼럼은우수 한생체적합성을보여주고, 넓은 pH 범위를갖고있으며부식성 이동상으로도세척할수있다.
중합반응의조건을조절하는등 일체형칼럼의준비단계를발 전시키는실험이진행되고있으며더욱효율적인매크로다공성
poly(glycidyl methacrylate-co-ethylene glycol dimethacrylate)
일체형 칼럼을만들기 위해아직도많은실험이 진행되어야할 것이다.
Fig. 4. Chromatogram of caffeine and L-tryptophan using sulphuric acid modified poly(glycidyl methacrylate-co-ethylene glycol dimethacrylate) monolith.
(Mobile phase: methanol; Inj. Conc.: caffeine 1mg/ml, L-tryptophan 0.5 mg/ml; inj. Vol.: 20µl; a: 0.2, b: 0.4, c: 0.5, d: 0.8, e: 1.0 ml/min).
5. 결 론
자유라디칼 중합반응에 의하여매크로 다공성 poly(glycidyl methacrylate-co-ethylene glycol dimethacrylate) 일체형칼럼을만 들었으며황산을이용하여친수성의구조표면을얻었다. 이일체
형칼럼을이용하여카페인과 (L)-트립토판을분리하는데성공하
였다. 본연구에서만들어진일체형칼럼은 0.57의공극률이있으
며아주낮은압력강하를보였다. 또한, 메탄올과물의혼합이동 상을이용하였을때보다이상적인선택도(2.28)와분리도(1.17)
를얻을수있었다. 하지만, 칼럼효율(N, 98과 187)이비교적낮 았으므로칼럼효율을향상하기위한더욱많은실험이진행되어 야할것이다.
감 사
본 연구는인하대학교 고순도분리연구실에서 수행하였으며,
인하대학교와초정밀생물분리기술연구센터의 지원에감사드립 니다.
참고문헌
1. Švec, F., “Preparation and HPLC Applications of Rigid Macroporous Organic Polymer Monoliths,”J. Sep. Sci., 27(10), 747-766(2004).
2. Unger, K. K., Packings and Stationary Phases in Chromato- graphic Techniques, M. Dekker, NY, USA(1990).
3. Švec, F., Tennikova, T. B. and Deyl, Z., “Monolithic Materials:
Preparation, Properties, and Applications,” Elsevier, Amsterdam, 173(2003).
4. Krajnc, P., Leber, N., Štefanec, D., Kontrec, S. and Podgornik, A., “Preparation and Characterization of Poly(high internal phase emulsion) Methacrylate Monoliths and Their Application as Sep- aration Media,”J. Chromatogr. A, 1065(1), 69-73(2005).
5. Ikegami, T. and Tanaka, N., “Monolithic Columns for High-effi- ciency HPLC Separations,”Current Opinion in Chemical Biol- ogy., 8(1), 1-7(2004).
6. Štrancar, A., Podgornik, A., Barut, M. and Necina, R., in: R. Fre- itag (Ed.), Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology (Modern Advances Chromatography), vol. 76, Springer, Heidel- berg, 49(2002).
Table 2. Retention times and the calculated values of caffeine(1) and L-tryptophan(2) Flow rate(ml/min)
Mobile phase tR1(min) tR2(min) k1 k2 N1 N2 α R
Methanol 0.2 14.14 18.44 10.07 13.43 17.92 35.36 1.30 0.28
0.4 6.88 9.91 4.39 6.75 27.05 56.05 1.44 0.49
0.5 5.57 8.27 3.35 5.47 34.33 87.39 1.49 0.63
0.8 3.35 4.83 1.62 2.78 50.38 88.94 1.44 0.64
1 2.65 4.12 1.07 2.22 98.10 187.47 1.55 1.10
Methanol+water
(90:10 vol％) 0.6 4.61 5.99 2.61 3.69 133.17 60.50 1.30 0.40
0.8 2.91 6.65 1.27 4.20 42.34 36.35 2.28 1.17
Fig. 5. Chromatogram of caffeine and L-tryptophan using sulphuric acid modified poly(glycidyl methacrylate-co-ethylene glycol dimethacrylate) monolith at different flow rate. (Mobile phase: methanol:water (90:10 vol%); Inj. Conc.: caffeine 1mg/ml, L-tryptophan 0.5 mg/ml; inj. Vol.:
20µl; a: 0.6, b: 0.8 ml/min).
7. Azanova, V. V., Hradil, J., Svec, F., Pelzbauer, Z. and Panarin, E.
F., “Reactive Polymers. 60. Glycidyl Methacrylate-styrene-ethyl- ene Dimethacrylate Terpolymers Modified with Strong-acid Groups,”React. Polym.,12(3), 247-260(1990).
8. Azanova, V. V., Hradil, J., Sytov, G., Panarin, E. F. and Svec, F.,
“Macroporous Membranes: Part 2. 2,3-Epoxypropyl Methacry- late-styrene-ethylene Dimethacrylate Macroporous Membranes Bearing Strong Acid Groups,”React. Polym.,16(1), 1-8(1991).
9. Hradil, J. and Svec, F., “Reactive Polymers. 61. Synthesis of Strongly Basic Anion Exchange Mathacrylate Resins,”React. Polym.,
13(1), 43-53(1998).
10. Luo, Q., Zou, H., Xiao, X., Guo, Z., Kong, L. and Mao, X.,
“Chromatographic Separation of Proteins on Metal Immobilized Iminodiacetic Acid-bound Molded Monolithic Rods of Macroporous Poly(glycidyl methacrylate-co-ethylene dimethacrylate),”J. Chro- matogr. A,926(2), 255-264(2001).
11. Gong, B., Ke, C. and Geng, X., “Synthesis of Monodisperse Poly (glycidylmethacrylate-co-ethylene dimethacrylate) Beads and Their Application in Separation of Biopolymers,”Chinese J. Chem., 22(3), 283-289(2004).
12. Calleri, E., Massolini, G., Lubda, D., Temporini, C., Loiodice, F.
and Caccialanza, G., “Evaluation of a Monolithic Epoxy Silica Support for Penicillin G Acylase Immobilization,”J. Chromatogr. A,
1031(1), 93-100(2004).
13. Wu, N., Dempsey, J., Yehl, P. M., Dovletoglou, A., Ellison, D.
and Wyvratt, J., “Practical Aspects of Fast HPLC Separations for Pharmaceutical Process Development Using Monolithic Col- umns,”Analytica. Chimica. Acta., 523(2), 149-156(2004).
14. Gritti, F., Piatkowski, W. and Guiochon, G., “Study of the Mass Transfer Kinetics in a Monolithic Column,”J. Chromatogr. A, 983(1), 51-71(2003).
