111 책임저자：김영민, 305-811, 대전시 유성구 전민동 461-6
한남대학교 생명나노과학대학 생명과학과 Tel: 042-629-8753, Fax: 042-629-8751 E-mail: [email protected]
접수일：2009년 5월 6일, 게재승인일：2009년 5월 29일
Correspondence to：Young-Min Kim
Department of Biological Sciences, College of Life Science and Nano Technology, Hannam University of Daejeon, 461-6, Jeonmin-dong, Yuseong-gu, Daejeon 306-791, Korea
Tel: +82-42-629-8753, Fax: +82-42-629-8751 E-mail: [email protected]
HT-29 대장암 세포에서 5-fluorouracil과 Lactic Acid Bacteria를 복합 처리하였을 때 나타나는 Apoptosis 시너지 효과에 관한 연구
1천양테크 학술부, 한남대학교 생명나노과학대학 2생명과학과,
한남대학교 생명나노과학대학 3식품영양학과, 4(주)비타바이오
김혜민1ㆍ박송이2ㆍ이윤경3ㆍ김홍익4ㆍ김윤이2ㆍ박옥진3ㆍ김영민2
Combination of 5-fluorouracil and Lactic Acid Bacteria Induces Apoptosis Synergistically in HT-29 Colon Cancer Cells
Hye-Min Kim1, Song-Yi Park2, Yun-Kyung Lee3, Hong-Ik Kim4, Yun-Yi Kim2, Ock-Jin Park3 and Young-Min Kim2
1Department of Technology & Marketing Chunyangtech, Bucheon 305-811, Departments of 2Biological Sciences,
3Food and Nutrition, College of Life Science and Nano Technology, Hannam University of Daejeon,
4Vitabio, Inc. Chongkundang BD, Daejeon 306-791, Korea
5-fluorouracil (5-FU) is one of the widely used chemo-therapeutic drugs targeting various cancer cells.
A successful chemotreatment requires overcoming several obstacles including intrinsically drug- chemoreisitant cancer malignancy. In the present study, HT-29 colon cancer cells were markedly sensitized to apoptosis by both 5-FU and lactic acid bacteria (LAB), compared to the LAB treatment alone. The precise mechanism by which LAB may inhibit the growth of colon cancer are presently unknown. It has been reported that treatment of HT-29 colon cancer cells with combined 5-FU and LAB markedly reduced tumor cell viability, in contrast to the results for LAB alone. Consequently, combination of 5-FU and LAB increased significantly activation of AMP-activated protein kinase (AMPK) that has been implicated in cancer development and control. These results suggest that the combination of 5-FU and LAB exert a novel chemotherapeutic effect in colon cancer cells. (Cancer Prev Res 14, 111-117, 2009) Key Words: 5-fluorouracil (5-FU), Lactic acid bacteria (LAB), Apoptosis, AMPK
서 론
생활수준의 향상과 의학의 발달로 고령화된 현대사회 에서 암으로 인한 사망률의 증가는 여전히 의학계의 최 대 과제로 남게 되었는데, 본 연구에서는 전 세계를 통틀 어 세 번째로 발병률이 높은 대장암에1) 관하여 보고하고
자 한다. 현재 널리 사용되는 항암제의 하나로 대장암과 다른 고형암의 치료에도 사용되는 5-Flurouracil (5-FU)은 thymidyl의 합성을 방해하여 암세포에서 apoptosis를 유발 하는 것으로 알려져 있다.2) 그리하여 최근 수년 동안 5-FU의 수요가 크게 증가하였음에도 불구하고, 선천적 혹은 후천적으로 약제내성이 생기기 때문에 항암제로 사용함에 있어서 심각한 문제점으로 보고되고 있다.3)
이와 같은 문제점을 해결하기 위하여 Hwang 등4)은 5-FU와 genistein을 혼합하여 HT-29 대장암세포에 처리한 후, AMPK (Adenosine monophosphate activated protein ki- nase)의 신호경로를 통하여 항암효과를 관찰한 결과, genistein을 단독처리 했을 때보다, 5-FU와 genistein을 혼 합하여 처리했을 때, 항암효과가 더욱 뛰어난 것을 확인 하였다. AMPK는 세포 내에서 주요한 에너지 대사의 센 서로 작용하는데, 최근까지 발표된 연구 보고에 따르면 당뇨와 비만에 있어서 중요한 역할을 한다는 것이 밝혀 졌으며,5,6) 암세포에서는 apoptosis와 관련이 있어 암의 발 달과 조절에 영향을 미치는 것으로 알려져 있다.7) 본 연구는 화학적 항암요법인 5-FU를 장기간 사용했 을 때 나타날 수 있는 약제내성을 감소시키기 위하여, 발효식품의 주 생산원인 lactic acid bacteria (LAB)와 5-FU 를 혼합하여 HT-29에 처리했을 때의 항암효과를 관찰하 기 위하여 시도되었다. LAB는 장내에서 정장작용, 유해 세균 억제로 장암예방과 인체의 면역계에 시너지 효과 를 일으켜 대장암 세포의 apoptosis를 유도하는 역할을 하 는 것으로 알려져 있지만, 그에 대한 정확한 기작은 아직 밝혀지지 않았다.8,9) 따라서 본 연구에서는 생물요법제 의 하나로서 대두되고 있는 LAB를 통하여, LAB를 단독 처리 했을 때와, 5-FU와 LAB를 복합 처리했을 때의 암세 포 증식억제 효과를 관찰함으로써, 암세포 내에서 apop- tosis가 일어나는 시너지 효과를 규명하고자 하였다.
재료 및 방법 1. HT-29 세포주의 배양
ATCC (American Type Culture Collection, Gaithersburg, MD)로부터 HT-29 세포주를 구입하였으며, 배양배지는 10%의 우태아혈청(Fetal Bovine Serum, FBS, Gibco BRL, Grand Island, NY, USA), 1%의 streptomycin 및 penicillin (Biofluids, Rockville, MD, USA)을 RPMI 1640 (Gibco BRL)에 혼합하여, 37°C, 5% CO2 조건에서 confluence 70∼80% 정 도로 배양되었을 때, 실험에 사용하였다.
2. 시약 및 세포처리
실험에 사용한 LAB인 Lactobacillus sp.는 MRS broth에서 37°C, 24시간 배양하여 생균수 1×108 cfu/ml에 도달했을 때 균체를 회수하여 phosphate buffered saline (PBS)로 세척 하였다. LAB를 PBS와 함께 100°C에서 1시간 정도 열처 리하여 균주를 완전히 사멸시킨 후, 1 ml씩 1.5 ml tube에 담아 −76°C에서 냉동 보관하여 실험에 사용하였다. 5- U는 Sigma (St. Louis, Mo, USA)에서 구입하여 dimethzl sul-
foxide (DMSO, Amresco, Solon, OH, USA)에 녹여 100 mM stock solution으로 제작하여 −20°C에서 냉동 보관하여 실험에 사용하였다. 3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl) 2, 5-diphe- nyltetra zolium bromide (MTT) 용액과 Hoechst 33342 염색 약, 그리고 reactive oxygen species (ROS) 측정을 위한 2', 7’-dichlorofluorescein diacetate (DCFH-DA)는 Sigma에서 구 입하여 사용하였다.
3. 세포처리 물질
사균 처리된 LAB는 적정 배지인 RPMI 1640 (Gibco BRL, Grand Island, NZ, USA) media에 희석하여 사용하였 다. 세포 처리 시 5-FU의 농도는 50μM로 처리하여 37°C, 5% CO2 조건에서 배양하여 수행하였고, LAB는 다양한 농도로 처리, 배양하여 실험하였다. 5-FU와 LAB를 복합 처리하였을 때는 5-FU을 처리하기 전에 LAB를 30분 동 안 37°C, 5% CO2 조건에서 전처리 하였다. 모든 세포 처 리는 control (아무것도 처리하지 않은 것, None으로 표 시)을 제외하고 적정 배지인 RPMI 1640 media에 LAB를 혼합하여 실험하였다.
4. MTT assay에 의한 암세포의 생존율 측정
세포 처리가 끝난 HT-29 세포를 12-well culture plate의 각 well에 MTT 용액(5 mg/ml in PBS)을 30μl씩 첨가하여 37°C, 5% CO2 조건에서 3시간 반응시킨 후, 세포의 색 변화를 관찰하고 PBS로 조심스럽게 세척하였다. DMSO 150μl를 12-well culture plate에 첨가하고 천천히 교반하 여 세포를 떨어뜨린 다음, 각 plate에서 100μl씩을 취해 ELISA-reader용 96-well multi plate에 순서대로 분주하고 microplate reader (BIO-RAD Laboratories, Inc. USA)를 사용 하여 595 nm에서 흡광도를 측정하였다. 측정은 모두 세 번을 하였으며, 그에 따르는 평균값과 표준오차는 Micro- soft Exel program을 이용하여 분석하였다.
5. Hoechst 33342 염색을 이용한 chromatin stai- ning
100 mm 배양용기에서 배양된 HT-29 세포의 confluence 가 80% 정도 되었을 때 현미경으로 확인하고 12-well culture plate의 각 well에 culture cover glass를 넣고 100 mm culture dish에서 배양한 HT-29 세포를 1 ml의 Trypsin･
EDTA 용액을 사용하여 떨어뜨린 후, culture cover glass 위에 조심스럽게 분주하여 37°C, 5% CO2 조건에서 24시 간 동안 배양하였다. 배양이 끝난 후, plate에 직접 Ho- echst 33342 dye (32μg/μl)를 10μM로 처리하여 실온에서 1 시간 방치하여 반응시킨 후, 조심스럽게 media를 제거
Fig. 1. Anti-prolieratory effect of 5-FU in HT-29 colon cancer cells. These cells were exposed to 5-FU for 24 h. The growth inhibition was measured by the metabolic-dye-based MTT assay. The data shown are means±SD of three independent experiments.
하였다. 세포의 상태를 고정시키기 위해 3.5% formalde- hyde가 포함된 PBS 500μl를 각 well에 직접 첨가하여 실 온에서 30분간 방치 시켰다. Slide glass 위에 50% glycerol 을 1∼2방울 떨어뜨리고 멸균된 핀셋을 사용하여 culture cover glass 위에 배양된 세포가 바닥을 향하도록 한 다음, 실온에서 충분히 건조시킨 후에 형광현미경(Olympus Optical, Tokyo, Japan)으로 저배율에서 고배율로 관찰하 면서, HT-29 세포에서 apoptotic cells을 확인하고, 디지털 카메라(Olympus SP-6600, Japan)로 사진 촬영하였다.
6. Reactive oxygen species (ROS) 측정
100 mm culture plate에서 배양된 HT-29 세포의 con- fluence가 80% 정도 되었을 때 현미경으로 확인하고, 12-well culture plate의 각 well에 cover glass를 넣고, 24시간 정도 배양한 후, LAB를 적정배지인 RPMI 1640 media와 혼합하여 희석시킨 후 여러 가지 농도로 나누어 각 well 당 첨가하고 24시간 동안 37°C, 5% CO2 조건에서 배양하 였다. ROS의 생성 확인을 위해 각 well에 DCFH-DA를 10 μM씩 처리하여 30분 동안 37°C, 5% CO2 조건에서 배양 하여, cover glass 위에서 배양된 세포가 떨어지지 않도록 조심스럽게 2회 세척한 후, 형광현미경을 통하여 관찰하 였다.
7. Western blot에 의한 단백질 발현의 분석
HT-29 세포를 6-well culture plate에서 배양하여 한편으 로 LAB를 각기 다른 농도로 단독 처리하였고, 다른 편으 로는 5-FU와 복합 처리하여 37°C, 5% CO2 조건에서 24 시간 동안 배양하였다. 단백질을 추출하기 위하여 triton lysis buffer [25 mM Tris-Cl (pH 7.4), 150 mM NaCl, 1%
Triton (100×), 5 mM EDTA]를 각 well에 150μl 씩 첨가하 여 반응시킨 후, 14,000 rpm, 4°C에서 10분 동안 원심분 리 하였다. Bradford assay method를 이용하여 standard cur- ve를 얻었으며, 이를 이용하여 ELISA-reader 595 nm에서 흡광도를 측정하여, 각 시료의 단백질 농도를 결정하였 다. Sodium dodecyl sulfate (SDS)-polyacrylamide gel을 하기 위해 5×Laemmi sample buffer (loading dye; 250 mM Tris-cl (pH 6.8), 40% glycerol, 4% β-mercaptoethanol, 0.08% bro- mophenol blue, 8% SDS)와 HT-29 세포에서 추출한 단백질 을 혼합하여 표본을 제작하였다. SDS-PAGE에서 단백질 밴드를 확인하고 Nitrocellulose (NC, Schicher & Schuell, Dassel, Germany) membrane에 separating gel 상의 단백질들 을 transfer kit (BIO-RAD, USA)를 사용하여 100 볼트에서 1시간 동안 transfer하였다. Transfer된 NC membrane을 Ponceau S. 용액(0.1% Ponceau S. in 5% acetic acid)으로 5
분간 염색하여 단백질 밴드를 확인하였다. 1차 항체인 ACC, AMPK, β-actin을 Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA)로부터 구입하여 각각 희석한 후, 반응시켰다.
2차 항체(Cell Signaling Technology)를 희석하여 1시간 반 응시킨 다음, Blue X-ray film에 나타나는 밴드로 단백질 의 활성을 관찰하였다.
결 과
1. 5-FU 단독처리 시 MTT 분석을 통한 암세포 증식억 제 효과
5-FU를 단독으로 처리했을 때, HT-29 세포의 증식억 제 효과를 관찰하기 위하여 MTT 분석을 실시하였다.
Fig. 1에서 나타난 바와 같이, 5-FU를 25μM, 50μM, 100 μM, 200μM의 농도로 각각 처리했을 때, 50μM에서는 10%, 200μM에서는 20% 정도로 HT-29 세포의 증식이 억제되는 것을 알 수 있었다.
2. 5-FU와 LAB의 복합처리에 따른 MTT 분석
HT-29 세포에 5-FU와 LAB를 복합 처리했을 경우, 5- FU를 단독으로 처리했을 경우보다 암세포의 증식이 현 저하게 억제된 것을 관찰할 수 있었다. Fig. 2에서와 같이 LAB를 108 cfu/ml 농도로 단독으로 처리했을 경우에는 HT-29 세포의 증식이 20% 정도 억제되었지만, 동일한 농도에서 5-FU를 50μM을 복합 처리했을 때에는 암세포 의 증식이 40%까지 감소되었다. 마찬가지로 LAB를 107 cfu/ml 농도로 낮추고 5-FU를 50μM을 복합 처리했을 경
Fig. 4. AMPK activity is critical for the combination with 5-FU and heat-treated cells (LAB)-induced apoptosis in HT-29 cancer cell. (A) The cells were treated to different concentrations of heat-treated cells for 30 min. (B) These cells were exposed to 5-FU (50μM) for 12 h. And then AMPK activation was measured by Western blot analysis with P-ACC, β-actin.
Fig. 2. Synergistic cell death of combined with 5-FU and LAB in HT-29 colon cancer cells. Cells were treated to different concentration of LAB for 24 h. Also the another cells were exposed to combination with 5-FU (50μM) and LAB. Then cell viability was measured by MTT assay. The data shown are means±SD of three independent experiments.
Fig. 3. The effect of LAB induced apoptosis through Hoechst 33342 staining in HT-29 colon cancer cell. The HT-29 colon cancer cells were treated with variable concentrations of LAB for 24 h. The arrows indicate cleaved nuclei in the HT-29 cells. The cells were photographed using a Nikon digital camera and a fluoromicroscope after being treated with Hoechst 33342 staining.
우에는 암세포의 증식이 30%까지 감소되었고, 동일한 5-FU 농도에서 LAB를 106 cfu/ml 농도까지 낮추었을 경우 에는 HT-29 세포의 증식이 약 20%까지 억제된 것을 관
찰할 수 있었다.
3. LAB에 의한 HT-29 세포의 apoptosis
이와 같이 암세포의 증식이 억제되는 것이 LAB에 의 해 HT-29 세포에서 apoptosis가 일어난 것인지를 관찰하 기 위하여, Hoechst 33342를 이용한 chromatin staining을 통하여 확인하였다. Fig. 3에서 나타난 바와 같이 LAB를 None, 106, 107, 108 cfu/ml의 농도별로 24시간 동안 HT-29 세포에 처리했을 때, 화살표가 가리키는 것처럼 apoptotic body를 관찰할 수 있었다. 이러한 apoptotic body는 염색사 의 응축으로부터 유발된 것이며, LAB의 농도가 높아질 수록 더욱 많은 apoptotic body가 나타났는데, LAB의 농도 를 108 cfu/ml로 처리했을 때, 가장 많은 apoptotic body를 확인할 수 있었다. 이와 같이 apoptotic body가 생성된 것 은 LAB에 의해 HT-29 세포에서 apoptosis가 일어난 것으 로 보인다.
4. Western blotting 분석을 이용한 AMPK의 신호경 로의 확인
본 연구에서 HT-29 세포에 LAB를 단독 처리 했을 때 와 5-FU 50μM을 LAB와 복합 처리 했을 때에 phospho-
Fig. 5. ROS generation by LAB, and LAB ＋5-FU in HT-29 colon cancer cells. (A) ROS generation by LAB in HT-29 cells was determined by DCFH-DA dye. Cells were treated with various concentrations of LAB for 6 h. After additional 30 minutes of incubation in the presence of 10μM DCFH-DA, changes in fluorescence intensity were measured by fluorescence-activated cell scanning analysis. (B) The HT-29 cells were treated with LAB and 5-FU (50μM) for 6 h. Under the identical conditions, ROS generation by LAB and 5-FU are shown by DCFH-DA dye.
ACC (pACC)와 phospho-AMPK (pAMPK)의 발현에 어떠한 차이를 보이는지를 관찰하기 위하여 Western blotting 분 석실험을 실시하였다. Fig. 4A에서 보여 지는 것과 같이, LAB를 None, 106, 107, 108 cfu/ml의 농도별로 24시간 단독 처리하였을 때, LAB의 농도가 높아질수록, pACC와 pAMPK의 활성이 강해지는 것을 확인하였다. 또한 5-FU 의 농도를 50μM로 일정하게 유지하고, LAB의 농도를 None, 106, 107, 108 cfu/ml로 24시간 동안 복합 처리하였을 때, pACC와 pAMPK의 활성이 강해지는 것을 확인하였 다. 이와 같이 LAB를 농도별로 단독 처리했을 경우와, 5-FU를 LAB와 복합처리 했을 때, LAB의 농도가 저농도 에서 고농도로 갈수록 pACC가 활성화 되었으며, pAMPK 또한 pACC와 마찬가지로 농도 의존적으로 활성화 되는 것을 관찰하였다.
5. ROS의 생성 변화
LAB 단독처리와 LAB와 5-FU의 복합처리 시, ROS의 생성에 어떤 영향을 미치는지를 비교하기 위하여, HT- 29 세포 내의 활성산소와 반응하여 형광물질을 만들어 내는 DCFH-DA를 이용하여 H2O2 생성을 확인하였다.
Fig. 5A에서 보여 지는 것과 같이 배양한 HT-29 세포에 LAB를 None, 106, 107, 108 cfu/ml의 농도로 6시간 동안 단
독처리 했을 경우에서보다, Fig. 5B에서와 같이 LAB의 동일한 농도조건 아래서 LAB에 5-FU를 50μM 더하여 복 합처리 하였을 경우에 HT-29 세포의 증식이 더욱 억제 된 것을 알 수 있었다.
고 찰
항암치료에 있어서 5-FU와 같은 항암제가 갖는 약제 내성은 암 치료의 화학요법에 있어 중요한 장애물 중의 하나로 알려져 있으며,10) 따라서 LAB와 5-FU의 복합 처 리를 통하여 HT-29 세포에 apoptosis를 유도하는 synergy 효과를 관찰하고자 하였다. 따라서 본 실험을 통하여 LAB를 다양한 농도별로 HT-29 세포에 단독 처리했을 때 와 5-FU를 50μM로 복합 처리했을 경우에 HT-29 세포증 식의 억제에 미치는 영향을 관찰하였고, 이것이 apoptosis 와 연관이 있는지를 알아보았으며, apoptosis를 유도할 수 있는 AMPK 단백질의 활성 변화를 분석하였다.
우선 5-FU가 HT-29 세포의 증식에 어떠한 영향을 미 치는지를 조사하기 위하여 MTT assay를 실시하였다. Fig.
1에 나타난 바와 같이 HT-29 세포에 5-FU를 25μM, 50μ M, 100μM, 200μM의 농도로 단독 처리했을 때, 50μM에 서는 10%, 200μM에서는 20% 정도로 HT-29 세포의 증
식이 억제되었다. 한편, Fig. 2에서와 같이 HT-29 세포에 5-FU를 50μM의 농도로 일정하게 유지하고, LAB를 106 cfu/ml 농도로 복합 처리했을 경우에는 HT-29 세포의 증 식이 약 20%까지 억제되었고, 107 cfu/ml 농도에서는 30%, 그리고 LAB를 108 cfu/ml 농도까지 증가시켰을 경 우에는 암세포의 증식이 40%까지 감소하였다. 이와 같 이 LAB의 농도가 높아질수록 암세포의 증식이 점차로 억제되었으며, 본 실험에서는 5-FU를 50μM의 농도에서 만 실험을 수행하였으나, Fig. 1에서와 같이 5-FU의 농도 가 높아짐에 따라 암세포의 증식억제 효과가 상승하는 결과로 미루어보아, 5-FU의 농도가 높아지면 5-FU와 LAB의 시너지 효과가 더욱 커질 것으로 보인다.
이러한 HT-29 세포 증식의 억제가 LAB에 의한 단순한 세포 사멸이 아니라 apoptosis에 의한 것인지를 확인하기 위하여 Hoechst 33342를 이용하여 apoptosis 발생여부를 관찰하였다. Fig. 3의 화살표에서 보이는 바와 같이, LAB 를 None, 106, 107, 108 cfu/ml의 농도별로 24시간 동안 HT-29 세포에 처리했을 때, apoptotic body 형태인 염색사 의 응축이 일어난 것을 확인할 수 있었다. 따라서 Fig.
1과 Fig. 2에서 관찰된 HT-29 세포의 증식 억제는 LAB의 처리에 따른 apoptosis에 의해서 유도된 것으로 보인다.
이처럼 LAB 처리에 따른 apoptosis의 유도가 pACC 및 pAMPK와 어떠한 연관성이 있는지를 밝히기 위해서 Western blot 실험을 실시하였다. AMPK는 세포 안에서 에너지 센서 역할을 함으로써 우리 몸의 에너지 수준을 조절해 생체활동을 돕는 효소이며, 외부로부터의 스트 레스에 대하여 세포 내의 에너지 항상성을 유지시키는 데 중요한 역할을 한다.11) 이러한 AMPK의 활성도는 세 포 내의 AMP：ATP의 비율에 의해 조절된다고 알려져 있다. 최근 연구에 의하면 AMPK가 종양억제유전자와 연관되어 나타나며, 암세포에 있어서 신호분자의 역할 을 통하여 암의 발달과 조절에 중요한 역할을 하는 것으 로 보고되었다.12,13) 또한 AMPK는 apoptosis를 유도할 뿐 만 아니라 세포 내 단백질의 합성을 억제하는 중요한 역 할을 한다고 보고되었다.14,15) Fig. 4A에 보이는 바와 같 이, LAB를 None, 106, 107, 108 cfu/ml의 농도별로 24시간 단독 처리하였을 때, LAB의 농도가 높아질수록, AMPK 의 전구체인 pACC와 pAMPK의 활성이 강해지는 것을 확인하였다. 또한 Fig. 4B에서와 같이 5-FU의 농도를 50 μM로 일정하게 유지하고, LAB의 농도를 None, 106, 107, 108 cfu/ml로 24시간 동안 복합 처리하였을 때에는, pACC 와 pAMPK의 활성이 더욱 강해지는 것을 확인하였다. 이 와 같은 실험 결과를 통하여, HT-29 세포에 LAB와 5-FU 를 복합 처리한 경우에 암세포에서 apoptosis를 유도함에
있어서 LAB를 단독으로 처리한 경우보다 synergy 효과가 나타나는 것으로 보인다.
LAB에 의해서 apoptosis가 유도될 수 있다는 또 다른 실험은 ROS의 활성 측정실험을 통하여 이루어졌다. 최 근 연구보고에 의하면 HT-29 세포에서 ROS의 활성이 증 가하게 되면 apoptosis가 유도되어 암세포의 성장이 억제 되는 것으로 알려져 있다.16) Fig. 5A에서 나타난 것처럼, ROS 활성은 DCFH-DA를 이용한 H2O2의 생성을 관찰함 으로써 알 수 있었는데, 이 그림에서 보듯이 LAB의 농도 가 106, 107, 108 cfu/ml로 점차 높아질수록 ROS의 활성이 강해짐으로써, 암세포의 성장이 억제되는 확인할 수 있 었다. ROS의 활성이 증가하게 되면 세포 내의 미토콘드 리아에서 apoptosis가 유도되는 것으로 알려져 있는데,17) 이와 같이 ROS 활성이 증가되면 AMPK의 활성을 증가시 켜 apoptosis가 유도되는 것으로 보인다. 또한 Fig. 5B에서 보이는 것처럼, 동일한 LAB 농도에서 LAB와 5-FU (50μM) 를 복합 처리했을 경우에는 암세포의 성장이 더욱 억제되 는 것이 관찰되었으며, 이는 LAB와 5-FU 복합 처리 시에 나타나는 시너지 효과로 보인다.
이상의 결과들로부터, LAB를 HT-29 세포에 단독으로 처리했을 때, LAB의 농도가 높아짐에 따라 암세포의 증 식이 억제되는 것은, 암세포의 apoptosis에 의해 유도된 것으로 여겨지며, LAB와 5-FU를 복합처리 하였을 경우 에는 시너지 효과가 나타나 apoptosis가 더 많이 유도되는 것으로 보인다.
결 론
다양한 암세포에서 항암제로 사용되는 화학 물질 5-FU는 장시간 사용하였을 경우 약제 내성이 생기게 된 다. 이러한 내성을 감소시키기 위하여 생물요법제가 대 두되고 있는 실정인데, 본 연구에서는 HT-29 대장암 세 포에서 사균 처리된 유산균 LAB를 단독 처리 했을 때와 LAB와 5-FU를 복합처리 했을 때 나타나는 암세포에서의 apoptosis 효과를 알아보고자 하였다. 이 실험을 위하여 HT-29 대장암 세포주를 사용하였으며, MTT assay 분석 결과 LAB를 단독으로 처리 했을 때보다 5-FU를 복합 처 리했을 때 HT-29 세포의 증식이 현저하게 억제된 시너 지 효과를 관찰할 수 있었다. Hoechst 33342를 이용한 chromatin staining 및 ROS의 활성 측정실험 결과, 이와 같 은 암세포의 증식이 억제되는 것은 apoptosis에 의해 유도 된 것으로 확인되었다. 한편 이러한 apoptosis의 유도가 AMPK와는 어떤 연관성이 있는지를 조사하기 위하여 Western blot 실험을 실시한 결과, LAB를 단독으로 처리
했을 때보다 5-FU를 복합 처리했을 때 HT-29 세포의 증 식이 현저하게 억제된 시너지 효과를 관찰할 수 있었다.
따라서 HT-29 세포에서 5-FU와 LAB의 복합처리가 새로 운 항암요법의 가능성을 제시한 것이라고 할 수 있다.
감사의 글
이 논문은 2009학년도 한남대학교 학술연구조성비 지 원에 의하여 연구되었음.
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