Effect of titanium surface treatment on reaction of osteoblast cells

서 론

티타늄과 그 합금은 비교적 낮은 탄성계수와 높은 부식저항 성 등 기계적 성질이 우수하고 생체적합성이 좋아 생체의료 용 금속재료로 널리 사용되고 있다. 그러나 티타늄과 그 합금 은 낮은 골결합 능력으로 인하여 사람뼈에 이식 시 성공률이 감소하는 단점이 있다[1-3].

임플란트 성공적인 매식과 유지를 위하여 임플란트의 물리

티타늄 표면처리가 골모세포의 반응에 미치는 영향

Xing-Hui Piaoㆍ김영준*

전남대학교 치의학전문대학원 치주과학교실, 전남대학교 치의학연구소

Effect of titanium surface treatment on reaction of osteoblast cells

Xing-Hui Piao, Young-Joon Kim*

Department of Periodontology, School of Dentistry, Chonnam National University, Institution of Dental Science, Chonnam National University, Gwangju, Korea

ABSTRACT

Purpose: This study was carried out to evaluate the effects of several surface modifications with titanium on cell responses.

Materials and Methods: Titanium discs (15 mm in diameter and 2 mm in thickness) were divided into five groups; control

Results: The results are as follows. Each group showed a different surface morphology. Roughness test showed a statistically

Conclusion: The results suggest that titanium surface modification could show better surface properties and biological

Key Words: Titanium surface, Osteoblast cell, Alkali heat

Received Jul 2, 2015; Revised version received Jul 9, 2015 Accepted Aug 20, 2015

Corresponding author: Young-Joon Kim

Department of Periodontology, School of Dentistry, Chonnam National University, 33 Yongbong-ro, Buk-gu, Gwangju 61186, Korea

Tel: 82-62-530-5648, Fax: 82-62-530-5649 E-mail: [email protected]

적, 화학적 표면처리를 통하여 표면적을 증대시키고 표면형 상을 변화시켜 골반응을 증진시키고자 하는 연구가 꾸준히 이루어지고 있다[4,5].

다양한 티타늄 표면처리를 위하여 산처리(acid-etching) [6], 알칼리-열처리법(alkali-heat) [7,8], sandblasting with large grit and acid etching (SLA) 처리법[9], resorbable blasted media (RBM) 처리법[10], 양극산화법[11], 코팅법[12], 생물학적 유 용성이 증명된 단백질을 티타늄 표면에 부착시키는 생체모방 코팅[13] 등이 소개되었다. 다양한 표면처리법 중 산을 이용 하여 티타늄을 에칭하는 것은 생체 적합성을 손상시키지 않 고 티타늄의 표면을 거칠게 할 수 있는 효과적인 방법이라고 하였다[6]. 또한 알칼리 및 대기 혹은 진공 중 열처리를 통해서 적절한 결정 구조의 산화막을 가진 생체 활성화된 무정형의 나트륨 티탄산염 층을 얻을 수 있고, 칼슘, 인산 등이 침착된 생체 활성화된 표면을 얻을 수 있다[7]. SLA 표면은 골모세포 의 활성을 촉진시키고 골과 임플란트의 접촉이 더욱 빠르게 함으로써 치료기간을 단축시키고, 임상적인 성공률을 높이고 [9], RBM 처리는 선반가공 임플란트에 비하여 유의하게 더 많 은 골 접촉을 갖는다고 하였다[10].

최근 임상적으로 가장 많이 사용되는 표면처리 방법은 SLA 처리법, RBM 처리법 및 산처리법 등이다. 알칼리-열처리 방 법은 티타늄 임플란트의 생체활성을 얻고 더 좋은 치유 조건 을 만든다고 하였으며[7,8,14], 생화학적 특성이 우수하여 조 만간 임상에 적용될 수 있을 것으로 생각된다. 현재까지 많은 표면처리법이 소개되었고 각각 이 표면처리는 골반응을 증대 시킨다고 알려져 있다. 그러나 많은 연구들이 티타늄의 기계 가공면과의 비교를 통한 연구들도 여러 방법에 의해 처리된 티타늄 표면의 골 생물학적 반응을 동시에 비교한 연구는 드 물다.

이번 연구의 목적은 향후 임플란트 개발에 있어서 우수한 표면처리가 어떤 것인지 알아보고자 함이다. 여러 가지 표면 처리 방법 중 티타늄 표면자체의 기계적 성질을 변화시키는 방법들 중에서 산처리법, 알칼리-열처리법, SLA 처리법, RBM 처리법에 의한 표면처리 후 표면거칠기, 접촉각 등을 측정하 고 세포반응에 어떤 영향을 미치는지를 비교 평가하고자 세포 생활성, 알칼리 인산 분해효소(alkaline phosphatase, ALP) 활 성분석, 주사전자현미경(scanning electron microscope, SEM) 조사를 시행하였다.

재료 및 방법

시편의 준비

티타늄 디스크 준비

티타늄 시편은 티타늄센터(테크노파크, Gwangju, Korea)에 서 공급받았다. 원형 형태의 직경 15 mm, 4 mm, 두께 2 mm의 순수 티타늄(cp-Ti, grade II, ASTM) 시편을 각 군당 20개 제작 하였다. 티타늄 시편을 #600, #800, #1000, #1200, #1500, #2000 의 sand paper로 연마한 다음 연마흔을 제거하기 위해 0.1 μm 알루미나 단계까지 시행하였으며, 아세톤과 알콜용액 내에서 각각 10분간 초음파 세척한 다음 증류수로 세척하여 건조하 였다. 아무 표면처리를 하지 않은 순수 티타늄을 대조군으로 하였고 각각의 표면처리를 시행한 군을 실험군으로 하였다.

표면처리 방법 및 실험군 설정

산 표면처리(acid-etching)군

티타늄 표면을 H2SO4 수용액으로 산처리하였다. 60^oC 오븐 에서 48% H2SO4 수용액 내에서 1시간 동안 침수시켰다. 아세 톤과 알콜용액 내에서 각각 10분간 초음파 세척한 다음 증류 수로 세척하여 건조하였다[8].

알칼리-열표면처리(alkali-heat)군

NaOH 수용액으로 알칼리처리하였다. 60^oC 오븐에서 5 M NaOH 수용액 내에서 24시간 동안 침수시켰다. 그 후 5 M NaOH 침수군을 전기로에 넣고 승온 조건 5^oC/min으로 600^oC 까지 온도를 상승시킨 후 1시간 동안 열처리를 하였다. 아세톤 과 알콜용액 내에서 각각 10분간 초음파 세척한 다음 증류수 로 세척하여 건조하였다[7].

SLA 표면처리군

SLA 처리 시 Al2O3 분말은 평균입경 300 μm와 100 μm 입자 를 50/50 wt%의 비율로 혼합하여 사용하였으며, 80^oC의 HCl- H2SO4 수용액으로 산부식 처리하였다. 아세톤과 알콜용액 내 에서 각각 10분간 초음파 세척한 다음 증류수로 세척하여 건 조하였다[9].

RBM 표면처리군

RBM 처리 시 분말은 생체 흡수성의 hydroxyapatite 분말 (MCD powder; Hi-Med, Old Bethpage, NY, USA)을 평균입 경 100-150 μm와 90 μm 이하의 비율이 50/50 wt%가 되도록 혼합하여 사용하였고, 압력은 4기압으로 설정하였으며, 20%

HNO3 수용액으로 10분간 처리하였다. 아세톤과 알콜용액 내 에서 각각 10분간 초음파 세척한 다음 증류수로 세척하여 건

조하였다[9].

시편의 표면분석

SEM 관찰

시편의 표면에 이온 스퍼터기(E-1030; Hitachi, Tokyo, Japan)를 이용하여 백금을 코팅한 뒤 SEM (S-4700; Hitachi)하 에서 표면 형상을 30,000배로 관찰하였다.

원자힘현미경(atomic force microscope, AFM) 관찰과 표면 거칠기 측정

AFM (Digital Instruments, Tonawanda, NY, USA)을 이 용하여 5×5 μm 크기로 표면의 거칠기와 형상을 관찰하였 다. 거칠기(Ra)는 profilometer (DIAVITE DH-7; Diavite AG, Bachenbülach, Switzerland)로 측정하였다. 각 군당 2개의 시편 을 무작위로 선택한 후, 시편당 3회 측정하였다.

X-선회절(X-ray diffraction, XRD) 분석

시편들은 CuKα1 radiation으로 다목적 고분해능 XRD 장치 (high resolution X-ray Diffractometer)인 D/MAX Uitima III (Rigaku, Tokyo, Japan)를 사용하여 XRD 분석을 시행하였다.

접촉각 측정(contact angle test)

각 군당 2개의 시편을 이용하여 증류수를 시편의 표면에 서 5 mm 떨어진 부위에서 떨어뜨리고 30초 후 droplet을 디지 털 화상분석현미경(Image Analyzing Microscope, Camscope;

Sometech Inc., Seoul, Korea)으로 촬영하였다. 촬영된 이미 지를 이미지분석 소프트웨어(Surftens QA 3.0; OEG GmbH, Frankfurt, Germany)로 분석하여 접촉각을 측정하였다. 각 시 편의 세 부위에서 측정을 시행하였으며 평균을 구했다.

생물학적 반응

세포배양

이 연구에 사용된 MC3T3-E1 조골모세포는 American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA; CRL-2594)에 서 구입하였다. 세포 배양은 10% fetal bovine serum (Gibco;

ThermoFisher Scientific, Grand Island, NY, USA)이 포함된 alpha minimum essential medium (α-MEM; Gibco) 배지에서 배양하였다.

세포부착 평가

직경 15 mm의 티타늄 디스크를 12-well 배양기에, 무균 조 건하에서 배치한 후 70% 에탄올로 3번 세정하고, 1시간 동 안 자외선에 노출한 후 세포 배양 후드에서 건조하였다. 이후

well당 5×10⁴개의 MC3T3-E1 세포를 분주하여 배양하였다. 배 양 2일 후, 시편을 인산 완충 식염수(phosphate buffered saline, PBS; Gibco BRL, Carlsbad, CA, USA)로 3회 세척하고, 100 mm 의 cacodylate buffer (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA) 에 2.5% 글루타르알데히드(Sigma-Aldrich Co.)로 고정하였다.

시편은 에탄올의 농도(30%, 60%, 95% 및 100%)를 증가하며 15분 이상 탈수하고 hexamethyldisilazane (Sigma-Aldrich Co.) 에 15분 동안 처리한 후, 공기 건조하였고 장착하여 백금 코팅 하였다. 이어서 SEM 관찰을 시행하였다.

세포 생활성 평가(3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5- diphenyltetrazolium bromide, MTT)

배양된 세포는 배지를 모두 제거한 후 PBS를 이용하여 세 척하였으며 trypsin/thylenediaminetetraacetic acid를 소량 첨 가하여 배양접시로부터 분리시켰다. 소독된 직경 4 mm의 티 타늄 시편을 96-well plate에 위치시킨 후 well당 10,000개의 MC3T3-E1 세포를 분주하였다. 세포는 37^oC, 5% CO2 배양기 에서 3일 동안 배양한 후 well당 100 μL phenazine methosulfate (PMS; Promega, Madison, WI, USA)에 2.0 mL MTS (Promega) 로 MTT 분석을 시행하였다. 흡광도를 측정하기 위해 반응 액을 96-well plate에 각각 200 μL씩 분주한 후 ELISA reader (Molecular Devices, USA)를 이용하여 490 nm에서 흡광도를 측정하였다.

ALP 활성도 평가

골활성 성능을 추정하기 위해, ,ALP 활성을 측정하였다. 소 독된 직경 15 mm의 티타늄 시편들을 12well plate에 위치시 킨 후 MC3T3-E1 세포를 5×10⁴개씩 분주하여 7일 동안 배양하 였다. 배양된 세포는 PBS로 세척하였으며, 0.1% Triton X-100 buffer로 용해시켰고, 통법에 따라 처리하였다. 이후 ELISA reader (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 이용하여 405 nm에서 흡광도를 측정하였다.

통계적 분석

본 연구에서는 통계 프로그램인 IBM SPSS ver. 19.0 (IBM Co., Armonk, NY, USA)을 이용하였으며 표면거칠기, 접촉 각, 세포 생활성 평가와 ALP 활성분석은 평균 값을 one way ANOVA로 시행하고, Scheffe test로 사후검증을 시행하였다.

각각의 통계적 유의성은 p<0.05로 평가하였다.

결 과

SEM 관찰

SEM 관찰에서 대조군의 경우 기계가공면이 관찰되었다.

표면처리된 시편에서 산처리군은 요철상이 관찰되었고, 알칼 리-열처리군이 다소 균일한 그물망 구조가 관찰되었고, SLA 군은 균일한 미세요철이 관찰되었으며 RBM군은 상대적으로 미세한 HA 분말의 고압 분사로 인해 기계가공 시 생성된 선상 자국의 소실 및 불규칙한 압입 자국이 관찰되었다(Fig. 1).

AFM 관찰과 표면 거칠기 측정

AFM 분석결과 표면처리군이 대조군에 비해 거칠기가 증가 되었다. 대조군은 기계 가공면이 관찰되고 산처리, SLA, RBM 군은 요철상이 관찰되는데 알칼리-열처리군의 경우 표면이 균일하게 분포된 작은 둥근 구조물이 관찰된다(Fig. 2). 알칼 리-열처리군이 다른 표면처리군에 비해 거칠기가 낮았다. 거 칠기 테스트 분석결과 대조군은 0.24 μm, 알칼리-열처리군 은 0.28 μm, 산처리군은 3.34 μm, SLA군은 0.85 μm, RBM군은 1.28 μm이다. 산처리군, SLA군과 RBM군은 대조군과 알칼리- 열처리군에 비해 더 거친 표면을 보였다(p<0.05; Fig. 3).

XRD 분석

XRD 분석 결과 티타늄과 티타늄 옥사이드 픽을 확인할 수

있었다. 티타늄 픽 중 높은 세기를 나타낸 결정면이 알칼리-열 처리군에서는 다른 군과 다른 양상을 나타내었다(Fig. 4).

티타늄 표면의 접촉각 측정

접촉각 측정 결과, cp-Ti군은 61도, 산처리군은 68도, 알칼 리-열처리군은 12도, SLA군은 63도, RBM군은 72도였다. 표 면 젖음성에서 알칼리-열처리군이 대조군과 다른 표면처리군 에 비해 낮았으며 통계적으로 유의한 차이가 있었다(p<0.05).

그러나 다른 표면처리군들은 대조군과 비슷한 표면 젖음성을 보였다(Fig. 5).

세포 부착의 관찰

각 시편에 부착한 세포를 SEM으로 관찰하였다. 세포들은 각 군 표면에 방추상으로 광범위하게 분포되어 있었다. 그들 은 세포의 확산을 나타내는 실모양의 위족을 내어 서로 연결 되어 있었다. 규칙적인 방향성은 없었고 모든 방향으로 확장 되어 분포되어 있었다. 대조군과 차이가 없으며, 산처리군에 서 세포 퍼짐성이 줄어 들어 있는 경향을 보였다. 세포 돌기를 내어 세포들이 연결되어 있었다(Fig. 6).

MTT 분석

세포 생활성은 MTT 분석으로 측정하였다. MTT 분석결 과 대조군과 알칼리-열처리군은 산처리군, SLA군과 RBM

A B C

D E

Fig. 1. The scanning electron microscope images of surfaces on control (A), acid-etching (B), alkali-heat (C), sandblasting with large grit and acid etching (D), resorbable blasted media (E) discs (A-E: ×1,000, ×30,000 [insert]).

군에 비하여 통계적으로 유의하게 더 높은 활성도를 보였다 (p<0.05; Fig. 7).

ALP 활성

ALP 활성에서 표면처리군이 대조군에 비해 유의하게 높은 값을 보였고, 특히 알칼리-열처리군이 다른 표면처리군에 비 해 유의하게 높은 ALP 활성을 보였다(p<0.05; Fig. 8).

고 찰

치과질환이나, 노화, 사고 등으로 인해 치아가 상실된 경우 기능적인 수복과 더불어 심미적 수복에 대한 요구가 증가하

면서 임플란트의 매식에 의해 인공적으로 치아를 대체하고 자 하는 많은 노력이 거듭되어 왔으며, 생체적합성, 기계적 성 질 및 골 전도성의 측면에서 티타늄이 치아 결손부의 인공치 아 매식재료로서 널리 받아들여지고 있다. 그리고 다양한 표 면처리 기법들이 계속적으로 개발되어 임플란트-골의 융합을 빠르게 하거나 골 융합을 증대시켜 왔다[7-13].

지금까지 티타늄 표면자체의 기계적 성질을 변화시키는 많 은 표면처리 방법이 보고되었다. 대표적으로 산처리법, 알칼 리-열처리법, SLA처리법, RBM처리법을 들 수 있고 이들 표면 처리 방법은 순수 티타늄에 비해 더 우수한 골 반응을 보인다 고 하였다. 그러나 이런 많은 표면처리 방법 중에서 어떤 방법 이 더 우수한지 비교 연구한 논문은 적었다. 이에 이번 연구에

m

10 5

4

0 1 2 3

1.20.8 0.40 -0.4-0.8

0 1

2 3

4 5

m

5 4 10

1 2

3

m

A B

C

D

E

m

m 

7,083.9nm

5

4

0 1 2 3

200 0 -200 -400

0 1

2 3

4 5

m

nm

m  5

m

Fig. 2. The atomic force microscope Images of surfaces control (A), acid-etching (B), alkali-heat (C), sandblasting with large grit and acid etching (D), resorbable blasted media (E) discs.

서는 기존에 보고된 여러 가지 표면 처리 방법들의 기계적 성 질과 생물학적 특성을 비교 평가하고자 하였다.

임플란트의 유지력은 일반적으로 골과의 접촉 면적이 넓을 수록 증가하므로 표면조도의 증가는 유지력 개선에 직접적으 로 영향을 미칠 수 있다. 티타늄 임플란트에 대한 세포 부착성 이나 증식성은 매끄러운 표면에 비해 거친 표면에서 보다 유 리하다고 하였고[15,16], Larsson 등[17]은 임플란트 표면의 형 상 변화가 심할수록 더 높은 유지력을 발휘한다고 하였다. 본 연구에서 중심선 평균 거칠기(Ra)는 산처리, 알칼리-열처리, RBM 처리와 SLA 처리한 표면에서 각각 3.34 μm, 0.27 μm와 1.28 μm, 0.84 μm로서 기계가공한 표면의 0.23 μm에 비해 각

각 14.21배, 1.17배, 5.44배와 3.6배 증가되었다. 산처리군 거칠 기가 가장 높았고 알칼리-열처리군이 낮았다. Wennerberg 등 [18]은 표면 거칠기 정도에 따라 임프란트 보철부분과 같은 정 도의 거칠기를 평활면으로 분류하고, 0.5-1 μm를 최소 거칠기, 1-2 μm를 중등도 거칠기, 2-3 μm를 최대 거칠기로 분류하고 거칠기가 1.2-1.5 μm 정도일 때 골 반응이 우수하다고 보고하 였으며 일반적으로 사용되는 적당한 임플란트 표면 거칠기는 1-2 μm라고 하였다[19]. 본 연구에서는 RBM 처리와 SLA 처 리한 표면이 이상적인 거칠기 범위에 들었으나 산처리한 경 우는 3.34 μm로 상당히 거친 표면을 보였다. 또 다른 연구에서 48% 황산으로 90^oC에서 1시간 동안 산처리 시 3.3 μm 정도 거 칠기를 보고하였는데[20] Miyamoto 등[21]은 48% H2SO4에 1 시간 산처리 시 티타늄 표면의 Ra 값은 1.74 μm로 각 연구마다 산처리 시 거칠기값이 다양함을 알수 있다.

임플란트 표면층의 미세구조와 표면층에 존재하는 원소의 화학적 조성은 외부원자나 분자와의 반응성에 중요한 영향 을 미칠 수 있다. 본 연구에서는 티타늄의 기계가공 후 산처리, 알칼리-열처리, RBM 처리와 SLA 처리로 표면을 개질한 다 음 표면층의 미세 구조변화를 조사하였다. 표면처리된 티타 늄 SEM 사진에서(Fig. 1) 48% H2SO4로 산처리한 그룹, SLA그 룹, RBM 그룹보다 5 M NaOH 용액으로 알칼리-열처리된 시 편이 다소 치밀해진 양상을 보였다. 본 실험에 사용한 60^oC, 5 M NaOH 용액에 24시간 알칼리 표면처리 조건은 티타늄 표 면에 나트륨 티탄산염 겔층(sodium titanate gel layer)을 형성 할 수 있는 가장 이상적인 방법으로 보고되고 있으며[22,23], Wang 등[24]은 알칼리 처리를 한 티타늄 디스크에서 균일한

4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5

m

0

*

Contro l

Alkali-heat Acid-etching

SLA RBM

Fig. 3. Surface roughness of control, alkali-heat, acid-etching, sandblasting with large grit and acid etching (SLA), and resorbable blasted media (RBM) discs. *Control and alkali-heat treated groups compared to other groups were significant (p<0.05).

Control raw

Alkali-heat raw Acid-etching raw

SLA raw

RBM raw

Intensity(counts)

30 40 50 60 70 80

TR T

T R

T

T R

T

T T R

T

TT T R T R

T R

T R

T TR T

T R

T

Two-theta ( )

T

Fig. 4. X-ray diffraction patterns of the samples.

SLA: sandblasting with large grit and acid etching, RBM: resorbable blasted media, T: titanium, R: titanium oxid.

100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0

*

Contro l

Alkali-heat Acid-etching

SLA RBM

Angle()

Fig. 5. Water contact angle of control, acid-etching, alkali-heat, sandblasting with large grit and acid etching (SLA), and resorbable blasted media (RBM) discs. *Alkali-heat treated group was showed lower water contact angle than other groups (p<0.05).

다공성의 망상 구조가 나타났다고 하였다. 그러나 알칼리 처 리로 형성된 다공질의 hydrogel layer는 취약하기 때문에 열처 리함으로써 수분을 제거하고 밀도를 증가시켜 다공질 조직의 경화(hardening) 및 고착력(bond strength)을 향상시켜야 한

다. 이에 따라 이번 연구에서도 티타늄 시편을 알칼리 처리 후 600^oC에서 1시간 동안 열처리하여 표면을 개선시켰다.

이 연구에서 각 표면처리된 티타늄의 XRD 분석결과 티타 늄과 티타늄 옥사이드 픽을 확인할 수 있었다. 티타늄 픽중 높 은 intensity를 나타낸 결정면이 알칼리-열처리군에서는 다른 군과 다른 양상을 나타냈다. Lausmaa 등[25]은 루틸층(결정)

A B C

D E

Fig. 6. Scanning electron microscope image shows the morphologies of spread cell on cp-Ti (A), acid-etching (B), alkali-heat (C), sandblasting with large grit and acid etching (D), resorbable blasted media (E) after 24 hours of incubation (A-E: ×250, ×1,000 [insert]).

0.35

0.30

0.25

0.20

0.15

0.10

0.05

0.00

*

Contro l

Alkali-heat Acid-etching

SLA RBM

OD

Fig. 7. Cell proliferation measured by the 3-(4,5-Dimethylthiazol- 2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay. A statistically significant difference as compared with control. *Control and alkali- heat treated groups compared to the other treatment groups were significant (p<0.05).

OD: opital density, SLA: sandblasting with large grit and acid etch- ing, RBM: resorbable blasted media.

600

500

400

300

200

100

0

*

Contro l

Alkali-heat Acid-etching

SLA RBM

Protain(U/g)

Fig. 8. Alkaline phosphatase activity on the acid-etching, sandblast- ing with large grit and acid etching (SLA), resorbable blasted media (RBM), *alkali-heat treated group was higher than on the control (p<0.05).

이 유리하다고 하였고, Uchida 등[26]은 반대로 아나타제층 (결정)이 유리하다고 하였으며, Yang 등[27]과 Lim [28]은 산 화막에 두 종류의 결정 구조가 혼재하여 있는 경우가 생체 친 화성이 우수하다고 보고하였다. Kim 등[29]은 NaOH 수용액 중에서 알칼리 처리한 순수 티타늄의 XRD 분석 후 600^oC까지 는 sodium titanate의 주 결정 피크가 나타나지만, 그 이상의 온 도에서는 루틸상의 피크가 주류를 이루기 때문에 600^oC에서 의 열처리가 적절하다고 하였다. 이번 연구에서도 알칼리 처 리 후 600^oC에서 1시간 동안 열처리를 시행하였고 이에 따라 알칼리-열처리 시편에서 아나타제와 루틸층이 혼재되어 나타 난 것으로 생각된다.

표면 젖음성에서 알칼리-열처리군이 대조군과 다른 표면처 리군보다 통계적으로 유의한 차이가 있었다(p<0.05). 여러 보 고들에 의하면 cp-Ti군 접촉각이 66도[30], 산처리군 접촉각이 60도가 넘지 않았으며[6], SLA군 접촉각이 83도[31], RBM군 접촉각이 103도라고 하였다[32]. 이번 연구에서 여러 가지 표 면처리 후 접촉각을 분석한 결과, cp-Ti군은 61도, 산처리군은 68도, 알칼리-열처리군은 11도, SLA군은 63도, RBM군은 72도 였다. 이번 연구에서 cp-Ti군과 산처리군의 표면 젖음성은 다 른 연구들과 유사하였으나 SLA군과 RBM군은 다른 연구들에 비해 더 낮은 접촉각을 보였다. 표면 젖음성은 많은 인자들이 영향을 주는데 시편 제조 후 보존기간도 영향을 준다. 이번 연 구에 사용된 시편 중 SLA군과 RBM군은 시편 제조 후 오랜 기 간 공기중에 방치되어 공기중의 수분이 시편에로 흡수되었을 가능성을 배제할 수 없고, 이것이 표면 접촉각에 영향을 주었 을 것으로 추정된다.

표면 처리의 목적은 임플란트-조직 계면에서 더 유리한 세 포반응을 활성화하여 표면특성을 변경하는 것이다. Lauer 등 [33]은 세포가 연마표면에서 매우 편평한 형태로 발견되였 지만, sandblast 표면에서는 방추형을 보였다. 본 연구에서도 SLA군, RBM군, 산처리군, 알칼리-열처리군에서 세포는 다각 형으로 확산하고 세포를 연결하는 세포 돌기를 볼 수 있었다.

모든 표면에서 세포사이 형태학적 차이는 관찰되지 않았으며 이는 이번 연구에서 각각의 표면처리가 세포부착을 방해하지 않았음을 알 수 있다.

세포활성도는 알칼리-열처리군과 대조군이 다른 군들에 비 해 더 높은 세포활성도를 보였다(p<0.05). 다양한 연구가 이 미 증명한 바 ALP 활성은 조골세포에 의한 발현이 티타늄 및 티타늄 합금에 표면 거칠기 영향을 받는다고 하였다. Ong 등 [34]은 거친 표면이 연마 티타늄표면에 비해 ALP 활성과 더 빠른 osteocalcin 생산을 보여준다고 하였다. 이번 연구에서는 표면처리군들이 대조군보다 더 높은 ALP 활성을 보였다. 특 히 알칼리-열처리군은 다른 표면처리군들에 비해 더 높은 활

성을 보였다(p<0.05). 이번 연구에서 세포활성도와 ALP 활성 은 알칼리-열처리군이 다른 표면처리군들에 비해 더 우수한 결과를 보였다. Kim 등[35]에 따르면 알칼리-열처리된 티타 늄을 인공체액(simulate body fluid)에 담그어 두면 나트륨 이 온이 배출되고, 수산기가 유입되어, 음극 성향을 띤 티타늄 산 화 하이드로겔층(titanium oxide hydrogel layer)이 형성이 된 다. 이렇게 생긴 표면에 양극 성향의 칼슘 이온이 결합되어, 다 시 양극성향의 무정형의 칼슘 티탄산염층(amorphous calcium titanate layer)이 형성되고, 이곳에 다시 음극 성향의 인 이 온이 결합되어 안정적인 무정형의 인산-칼슘층(amorphous calcium phosphate layer)이 형성되어, 이곳을 중심으로 결정 형의 인회석(crystalline apatite)으로 전환된다고 알려져 있다 [24,35,36]. 따라서 이번 연구에서도 세포 배양액에 침수된 알 칼리-열처리 표면에서 인산-칼슘층이 형성되어 양호한 골반 응을 보인것으로 추정된다.

일반적으로 표면의 거칠수록, 표면 밀도가 낮을수록, 그리 고 표면 젖음성이 낮을수록 세포부착과 증식력 및 ALP 활성 에 부정적인 영향을 준다고 알려져 있다[35]. 이번 연구에서 표면처리한 군들이 대조군보다 더 우수한 골반응을 보였다.

알칼리-열처리군에 비해 산처리, SLA, RBM 처리군의 표면이 유의하게 거칠었다. 표면 젖음성은 알칼리-열처리군이 대조 군과 다른 표면처리군들에 비해 더 높은 세포 활성도와 ALP 활성을 보였는데 이는 알칼리-열처리 표면이 비교적 매끄러 운 표면을 가지면서 표면 젖음성이 높고 또한 표면에 칼슘과 포스페이트층이 형성되어 골모세포의 골원성 반응에 유리한 표면이 되었기 때문으로 생각된다.

이상의 결과들은 종합해 보면, 티타늄의 표면처리는 표면특 성을 개질시키고 우수한 골반응을 유도하였다. 특히 알칼리- 열처리 표면은 다른 표면처리보다 더 우수한 표면특성과 생 물학적 반응을 보여 향후 임플란트 표면처리 방법으로 널리 사용될 수 있을 것으로 생각된다.

순수 티타늄의 이상적인 표면처리방법에 대해 연구하고자 티타늄 그룹과 각각 산처리, 알칼리-열처리, SLA, RBM으로 표면처리된 그룹을 조사하여 표면의 물리적과 생물학적 특성 을 관찰한 결과 다음과 같은 결과를 얻었다.

물리적 특성을 보면 SEM 관찰에서 아무 처리하지 않은 순 수 티타늄 대조군의 경우 기계 가공면이 관찰되었다. 표면처 리 된 시편에서 산처리군은 요철상이 관찰되었고, 알칼리-열 처리군이 다소 균일한 그물망 구조가 관찰되었다. SLA군은 균 일한 미세요철이 관찰되었으며 RBM군은 상대적으로 미세한 HA 분말의 고압 분사로 인해 기계가공 시 생성된 선상 자국의 소실 및 불규칙한 압입 자국이 관찰되었다. AFM 분석 결과 표 면처리군이 대조군에 비해 거칠기 증가됨을 확인할 수 있었

고 알칼리-열처리군이 다른 표면처리군에 비해 거칠기가 낮 은 양상을 보였으며 거칠기 테스트 분석결과 산처리군, SLA군 과 RBM군은 대조군과 알칼리-열처리군에 비해 더 거친 표면 을 보였다(p<0.05). XRD 분석 결과 티타늄과 티타늄 옥사이드 픽을 확인할 수 있었다. 티타늄 픽 중 높은 세기를 나타낸 결 정면이 알칼리-열처리군에서는 다른 군과 다른 양상을 나타 냈다. 표면 젖음성에서 알칼리-열처리군이 대조군과 다른 표 면처리군에 비해 낮았으며 통계적으로 유의한 차이가 있었다 (p<0.05). 그러나 다른 표면처리군들은 대조군과 비슷한 표면 젖음성을 보였다.

생물학적 특성에서 SEM 세포형태를 살펴보면 잘 발달된 돌 기를 가진 방추형 형태의 세포가 관찰되었고 세포가 잘 부착 되었다. 대조군과 차이가 없으며, 산처리군에서 세포 퍼짐성 이 줄어 들었다. 세포 돌기를 내어 세포들이 연결되어 있었다.

MTT 분석 결과 대조군과 알칼리-열처리군은 산처리군, SLA 군과 RBM군에서 통계적으로 유의한 차이가 있었다(p<0.05).

ALP 활성에서 표면처리군이 대조군에 비해 유의하게 높은 값 을 보였고, 알칼리-열처리군이 다른 표면처리군에 비해 유의 하게 높은 ALP 활성을 보였다(p<0.05).

이상의 결과 티타늄의 표면처리군은 표면처리하지 않은 군 보다 더 우수한 표면특성과 생물학적 특성을 보였다. 특히 알 칼리-열처리군의 표면특성과 생물학적 특성이 가장 우수하였 다.

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