에서 Heat shock protein 70의 발현양상과 초산화물 불균등화 효소 (Superoxide Dismutase)와의 관계
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(2) 0.67±0.72, 0.65±0.29, P<0.05). Conclusion：We found difference between ischemic preconditioning and heat shock in the level of expression of HSP 70 and activity of MnSOD. Both preconditioning effect may have different mechanism on myocardial tolerance to ischemia/reperfusion injury. (Korean Circulation J 1999;29 (2) ):965-975) ) KEY WORDS：Ischemic preconditioning·Heat shock protein 70·Superoxide dismutase... window 효과가 나타날 때까지 일어나는 심근내의 변. 서. 론. 화를 관찰하기 위해 허혈성 전처치를 가한 후 4시간이 경과한 토끼의 심근에서 HSP 70의 발현 정도와 Mn-. 세포의 괴사를 초래하지 않을 정도의 허혈이 선행(ischemic preconditioning)된 심근은 장시간의 허혈과 재. SOD의 활성도를 측정하여 심근 보호효과가 알려진 열 쇽 후 24시간이 경과된 토끼모델과 비교하였다.. 관류에 의한 손상을 잘 견뎌낼 수 있다. Murry 등이 pr-. 재료 및 방법. econditioning 효과로 명명1) 한 현상이 알려지면서 허 혈성 심질환의 치료에 응용하기 위한 연구가 계속되고 있다. 또한 preconditioning 효과가 열 쇽(heat shock). 재 료. 를 가하고 24시간 후 회복시킨 쥐의 심장에서 허혈로. 뉴질랜드산 흰토끼 17마리를 암수 구별 없이 실험동. 부터 심근이 보호되는 preconditioning 효과와 동일한 결. 물로 사용하였다. 실험동물의 평균 체중은 3.1(2.5～3.5). 과(crosstolerance)가 나타나며 이때 heat shock pro-. kg이었다. 전처치 없이 30분간 지속적인 심근허혈을 유. 2). tein 70(이하 HSP 70)이 관여한다는 보고 가 있었다.. 도한 후 4시간의 재관류를 시킨 대조군 6마리(1마리는. 초기 연구에서 허혈에 의한 심근 보호효과가 1～2시간. 재관류 시작 1시간 후에 심실세동으로 사망하여 실험에. 내에 사라지는 일시적인 것(1st window)으로 알려졌. 서 제외하였다.)와 3분간의 심근 허혈과 5분간의 재관. 으나 24시간이 경과한 후에 다시 발현(2nd window)된. 류를 3회 반복한 후 30분간 지속적인 심근 허혈을 유. 다는 사실3)이 최근 연구에 의해 알려졌다. 이러한 pre-. 도하고 4시간의 재관류를 실시한 허혈성 전처치군 5마. conditioning 효과의 기전으로 protein kinase C, 4) K. 리와 전신마취 상태(Ketamine 200 mg 정맥주사)에서. 5). ATP channel(ATP sensitive potassium channel). 전기패드로 전신을 감싸서 직장온도 42℃로 15분간 유. 등이 1st window에 관여하고 HSP 70,6) Mn-SOD. 지하여 열 쇽을 가한 후 상온에서 24시간 동안 회복시. 7). (superoxide dismutase, 초산화 불균등화 효소) 등이. 킨 후 30분간 지속적인 심근허혈을 유도한 후 4시간의. 2nd window에 관계될 것이라는 가설이 있지만 아직. 재관류를 실시한 열 쇽군 6마리(1마리는 회복 중에 사. 명확히 밝혀진 것은 없다. 또한 oxygen free radical이. 망하여 실험에서 제외되었다.)로 나누었고 실험도중 사. 8). 9). 1st window 와 2nd window 모두에 중요한 역할을. 망한 2마리를 제외하고 각 군에 5마리씩을 실험에 포함. 할 것으로 생각되고 있다.. 시켰다(Fig. 1).. 2nd window의 경우에 심근 보호효과가 HSP 70의 10). 양 과 MnSOD의 활성도11)와 관련이 있다. 따라서 1st. 방 법. window와 2nd window사이에 심근 보호효과가 사라 지는 기간이 존재하는 이유가 허혈 이후에 이들 단백질. 수술적 술기. 이 충분히 발현될 때까지 시간이 필요하기 때문인 것으. 모든 실험동물은 실험 6시간 전부터 금식시키고 Ke-. 로 알려져 있다. Knowlton 등에 의하면 허혈성 전처치. tamine 200 mg을 정맥주사하고 2% Xylazine hydro-. 를 가한 토끼의 심근에서 HSP 70 mRNA이 유도되어. chloride 4 mg을 근육 주사하여 전신마취 시킨 후 기관. 2～4시간에 최고치에 달한다는 보고12)가 있다.. 삽관술을 시행하고 인공호흡장치(ventilator, animal, 68. 이에 저자들은 1st window 효과가 사라진 후에 2nd. 966. 3, Harvard, U.S.A.)를 사용하여 분당 60회, 1회 호흡 Korean Circulation J 1999;29(9):965-975.
(3) 시켜 결찰할 준비를 하였다. 기초자료로 혈압과 심전도를 기록한 후 실크를 조여서 인위적으로 심근허혈을 유도하고 실크를 느슨하게 하여 재관류시켰다. 지속적인 심근허혈 30분, 재관류 1시간, 4시간에 심전도와 혈압을 측정하였다. 4시간 동안 재관 류를 실시한 후에 KCL 10 mEq/5 ml를 정주하여 심정 지시키고 심장을 종격동으로 부터 빠르게 제거하여 일 부는 MnSOD의 활성도 측정에 이용하고 나머지는 면 역조직화학염색(immunohistochemical stain)을 위해 Fig. 1. Experimental protocols. The control group was subjected to no treatment. The ischemic preconditioning group was subjected to three 3-minute coronary ligations separated by 5-minute periods of repefusion. In the heat shock group after anesthesia, rectal temperature was raised to 42℃ for 15 minutes by wrapping rabbits in an electric warming blanket. Rabbits were then recovered at room temperature. All group were underwent 30-minute coronary ligation followed by reperfusion for 240 minutes (n＝5 for each group).. 포르말린 용액에 고정하였다. 면역조직화학염색(Immunohistochemical stain) 포르말린에 고정한 심장의 장축에 수직방향으로 심 실의 전벽(全壁)을 포함하도록 조직을 얻어서 파라핀 에 굳혀서 절편을 얻어서 Probeon Plus 슬라이드(15188 52, Fisher)위에 붙였다. 슬라이드를 xylene에 담아서 60℃에서 5분간 처리하여 파라핀을 제거하고 100%, 90%, 80% 에탄올에 차례로 담가 조직에 수분을 공급 했다. 조직을 100℃에서 5분간 TUF(Target Unmasking Fluid, SP-0025-TUF3, Kreatech biotechnology B.V., Amsterdam, Netherlands)로 처리한 후 에 실온에서 10분간 냉각시켰다. 증류수에 두차례 세 척후 Auto blocker(750110, Research Genetics, Huntsville, AL, USA)를 가해서 45℃에 3분간 처리하였 다. 1×Immuno/DNA buffer (750124, Research Genetics, Huntsville, AL, USA)로 두차례 세척한 후 auto pepsin에 45℃, 5분간 처리하고 1×Immuno/DNA. Fig. 2. Representative tracings from the poligraph illustrating observed changes. Scales is in millimeters and recording rate is 25 mm/sec. The first set of panels demonatrated baseline recordings；the second set 30 min into the period of coronary artery ligation；the third set 1 hour of reperfusion, and the last set of panels demonstrated 4 hours of reperfusion.. buffer로 3회 세척후 Protein blocker(750113, Research Genetics, Huntsville, AL, USA)을 가하고 45℃ 에 3분간 처리하였다. HSP 70 monoclonal antibody (SPA-810, StressGen, Canada)를 1：100으로 희석 하여 조직에 가하고 45℃, 60분간 처리후 1×Immuno/ DNA buffer로 3회 세척하고 Universal secondary. 량 15～20 ml로 양압인공호흡을 실시하였다. 경부의 피. antibody(750122, Research Genetics, Huntsville,. 부를 절개하여 내경동맥을 노출시킨 후에 18G Angion-. AL, USA)를 가하고 45℃에서 8분간 처리한 후 1×. eedle을 삽입하여 대동맥압을 압력 변환기를 통하여. Immuno/DNA buffer로 3회 세척하였다. Streptavidin. 폴리그래프(NEC Sanei 366, Japan)로 심전도와 함께. HRP detection system(750106, Research Genetics,. 기록하였다(Fig. 2). 흉부 정중앙의 피부를 절개하고. Huntsville, AL, USA)을 가하고 45℃에서 10분간 처. 흉골 정중앙을 절개하여 심장을 노출시킨 후 바늘로 3. 리후 1×Immuno/DNA buffer로 3회 세척한 후에 AEC. 번 실크를 좌관상동맥의 전하행지의 근위부 아래로 통. kit (51027302, Zymed laboratory INC., San Fra-. 과시켜 혈관을 둘러싸도록 한 후 폴리에틸렌관을 통과. ncisco, CA, USA)에 45℃에서 5분간 처리하여 발색 967.
(4) 시킨 후에 1×Immuno/DNA buffer로 3회 세척하였다.. 4℃의 0.25M sucrose내에서 Tissue grinder로 갈아. auto Hematoxylin으로 실온에서 30초간 대조염색을. 최종 10%(w/v)가 되도록 하여 4℃에서 10분간 8,500. 하였다.. rpm으로 원심분리후 상층액을 얻어 MnSOD 활성도 측. 관상동맥 결찰에 의한 심근의 허혈손상 정도에 대한. 정을 위한 검체로 하였다.. 평가와 허혈부위와 비허혈부위를 구별하기 위해 면역 조. MnSOD 활성의 측정은 Nebot 등13)의 방법으로 시. 직화학 염색을 시행한 절편과 연속된 조직절편에 He-. 행하였다. 사용된 SOD-525 kit(Bioxytech.Co. Fra-. matoxylin-Eosin 염색을 시행하였다. 두 절편을 비교하. nce)는 자가산화되는 BXT-01050 R1 용액(5,6,6a,. 여 허혈부위와 비허혈부위에서 면역조직화학 염색에. 11b-tetra-hydro-3,9,10trihydroxybenzo[c]flu-. 의한 HSP 70의 발현의 정도를 평가하였다.. orene)과 mercaptan에 의한 방해를 제거하기 위한. HSP 70의 염색정도는 음성에서 3＋까지 네 단계로. BXT-03077 R2용액(1,4,6-trimethyl-2-vinyl py-. 나누었다. 전혀 염색이 되지 않은 경우를 음성, 400배. ridinium trifluoromethane sulfonate), 수산화기(hy-. 로 확대한 현미경 시야에서 심근세포의 10%이하가 염. droxy radical)의 제거를 위한 dimethyl sulfoxide. 색된 경우를 1＋, 심근세포의 10%에서 50%가 염색된. (DMSO)와 0.11 mM DTPA(pH 8.8)를 포함한 완충. 경우를 2＋, 50%이상이 염색된 경우를 3＋로 하였다.. 용액으로 구성되어있다. R2 용액 30 μl와 증류수 40 μl에 37℃에서 1분간 방치한 후 R1 용액 30 μl를 섞 은 직후부터 25초와 50초후의 광학밀도 값의 변화를. MnSOD 활성도 측정 토끼의 심장을 허혈부위와 비허혈부위로 나누어 2～. 분광광도계(spectrophotometer)로 측정하여 표준치. Table 1. Hemodynamic changes during myocardial ischemia Baseline. Coronary ligation. Reperfusion. Reperfusion. PC group. 237±12. 229±15. 232± 8. 227±15. HS group. 233±17. 234±13. 237±15. 225±15. control group. 232±16. 233±15. 231±12. 226±12. Heart rate (bpm). Arterial systolic pressurre (mmHg) PC group. 81± 9. 77± 8. 79± 8. 82±11. HS group. 82± 7. 81± 7. 82± 6. 82± 7. Control group. 81± 6. 78± 6. 79± 9. 81± 5. Arterial diastolic pressure (mmHg) PC group. 61± 7. 58± 6. 62± 5*. 62± 7†. HS group. 59± 5. 60± 4. 60± 3. 59± 4. Control group. 59± 4. 58± 3. 58± 7. 61± 4. Mean arterial pressure (mmHg) PC group. 68± 8. 64± 6. 68± 6*. 69± 8†. HS group. 67± 6. 67± 5. 67± 4. 68± 4. Control group. 66± 5. 65± 4. 65± 7. 66± 4. PC group. 160±21. 147±12. 157±15. 158±18. HS group. 156±19. 156±17. 158±12. 149±11. Rate-pressure product (RPP). Control group 153±13 151± 9 157±15 156±17 Hemodynamic data (mean±S.E.M.) among the three groups in each step of procedures were not different significantly by repeated measures ANOVA *P<0.05 for PC group at reperfusion 1 hr vs coronary ligation using Wilcoxon signed rank test.；†P<0.05 for PC group at coronary ligation vs reperfusion 4 hr using Wilcoxon signed rank test Baseline data were recorded before the chest was opened, n=5 for each group RPP=HR×mean arterial pressure/100, PC；schemic preconditioning, HS；heat shock, bpm；Beats per minute. 968. Korean Circulation J 1999;29(9):965-975.
(5) (Vc)를 구하였다. 증류수 대신 검체를 넣어 동일한 방. 손상의 정도를 비교해 보면 핵농축 등 허혈 손상이 관. 법으로 구한 광학밀도값의 변화를 측정치(Vs)로 하여. 찰된 심근세포에는 HSP 70이 발현되지 않았고(Fig. 3). Vs/Vc＝1＋[SOD]/a[SOD]＋b(a＝0.07, b＝0.93)의. 허혈 손상을 입은 심근세포들이 분포된 영역의 주위를. 공식을 이용하여 MnSOD 활성도 값을 구하였다.. 둘러싸고 있는 정상 모양의 심근세포들에서 HSP 70이 발현되었다. 염색의 정도(positivity)의 차이는 있었지 만 핵 주위에 국한되거나 세포질에 전반적으로 분포하. 통계학적 분석 각 군에서 시기별로 측정한 혈압과 심전도에서 계산. 는 양상으로 HSP 70이 발현되는 것이 모든 군에서 관. 한 맥박에 차이가 있는지를 repeated-measure ANO-. 찰되었다. 또한 모든 군의 비허혈부위에서도 HSP 70이. VA로 분석하였고 각각의 군내에서의 차이를 비교하는. 발현되었다.. 데는 Wilcoxon signed rank 검정을 사용하였다. HSP. HSP 70의 발현정도를 비교해 보면 심근의 허혈부위. 70의 발현정도를 비허혈부위와 허혈부위로 나누어 각. 에서 허혈성 전처치군과 열 쇽군이 대조군에 비해 통계. 군간에 비교하고 각각의 군 안에서 두 부위사이에 차이. 학적으로 유의하게 많이 발현되었다(허혈성 전처치군. 가 있는지를 알아보기 위하여 Fisher’s exact 검정을. 대 대조군 P<0.01, 열 쇽군 대 대조군 P<0.01). 또한 비. 이용하여 분석하였다. MnSOD의 활성도를 비허혈부위. 허혈부위에서도 허혈성 전처치군과 열 쇽군이 대조군. 와 허혈부위로 나누어 각 군간에 비교하기 위해 일원. 에 비해 HSP 70이 유의하게 더 많이 발현되었다(허혈. 분산분석법을 사용하였고 각각의 군에서 두 부위사이에. 성 전처치군 대 대조군 P<0.01, 열 쇽군 대 대조군 P<0.. 차이가 있는지를 알아보기 위하여 Wilcoxon signed. 01). 허혈성 전처치군과 열 쇽군을 비교하면 허혈부위. rank 검정을 사용하였다. 모든 검정에서 통계적인 유의. 에서는 차이가 없었으나 비허혈부위에서는 열 쇽군이 유의하게 더 많이 발현되었다(P<0.01)(Table 2). 각각. 성은 5% 미만으로 하였다.. 의 군 안에서 허혈부위와 비허혈부위 사이에 HSP 70의. 결. 과. 혈류역학적 자료 세 군 사이에 심근허혈 및 재관류시 맥박, 수축기 동 맥압, 이완기 동맥압, 평균 동맥압, Rate-Pressure Product 등 혈류역학적인 차이는 유의하지 않았다. 허혈 성 전처치군에서 재관류 1시간과 4시간시 이완기 동맥 압과 평균 동맥압이 심근허혈시에 비해 유의하게 높았. 발현의 차이는 허혈성 전처치군과 대조군에서 허혈부위 Table 2. Distribution of Positivity of HSP 70 in myocardium on Immunohistochemical stains Case No.. PC*†§. HS*†‡. Control §. 1. 3＋. 3＋. 2＋. 2. 3＋. 3＋. 2＋. 3＋. 1＋. Ischemic area. 3. 3＋. 지만(P<0.05) 심근의 산소요구량을 대변하는 Rate-. 4. 3＋. 3＋. 2＋. Pressure Product사이에는 통계학적 차이가 없었다. 5. 3＋. 3＋. 2＋. 1. 1＋. 2＋. 0. 2. 2＋. 3＋. 1＋. 3. 1＋. 3＋. 0. 4. 2＋. (Table 1).. 면역조직화학 염색 H-E 염색을 시행한 모든 군의 조직에서 괴사는 관찰 되지 않아 30분의 관상동맥 결찰이 심근경색을 일으키 지는 않았다. 그러나 핵농축, 핵용해, 핵붕괴 등과 같은 허혈 손상을 입은 심근세포들이 모든 군의 허혈부위의 일부에서 관찰되었으며 이들의 세포질이 정상 모양의 심 근세포들에 비해 에오진에 더 진하게 염색되는 것이 관찰 되었다. 비허혈부위에서는 이상소견이 관찰되지 않았다. 면역조직화학 염색에 의한 HSP 70의 발현과 심근. Non-ischemic area. 0. 1＋ 3＋ 1＋ 5 Reactions were graded as follows；no staining；0, plus sign (＋)；1＋, 10% or fewer myocardial cells；2＋, 10% to 50% of myocardial cells；and 3＋, more than 50% of myocardial cells *P<0.01 vs control in ischemic area；†P<0.01 vs control in non-ischemic area；‡P<0.01 vs PC model in non-ischemic area；§P<0.01 for each individual group in ischemic vs non-ischemic area using Fisher’s exact test PC； ischemic preconditioning group, HS；heat shock group. 969.
(6) Fig. 3. Case 1 in ischemic preconditioning group. Left, a part of myocardium in ischemic area demonstrate ischemic changes. Myocardiocytes have pyknotic, karyolytic nuclei and strong eosinophilic cytoplasm (H-E stain). Right, Myocardium underwent ischemic changes demonstrate no expression of HSP 70 by immunohistochemical stain. (×400 magnification). Fig. 4. Case 2 in ischemic preconditioning group. Left, Myocardium in ischemic area demonstrate diffuse (>50% of myocardial cells), strong cytoplasmic positivity (3＋) for HSP 70. Right, In non-ischemic area, myoca-rdium show focal (10% to 50%), weakly cytoplasmic positivity (2＋) for HSP 70. (×400 magnification). 970. Korean Circulation J 1999;29(9):965-975.
(7) Fig. 5. Case 4 in heat shock group. Left, Myocardium in ischemic area and Right, myocardium in non-ischemic area demonstrate diffuse (>50% of myocardial cells), strong cytoplasmic positivity (3＋) for HSP 70. (×400 magnification). Fig. 6. Case 2 in control group. Left, Myocardium in ischemic area demonstrate focal (10% to 50%), weakly cytoplasmic positivity (2＋) for HSP 70. Right, In non-ischemic area, a few (≤10%) of myocardial cells shows perinuclear waekly positivity for HSP 70. (×400 magnification). 971.
(8) 하며 그 기전에 있어서 heat shock protein이 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다.14) Heat shock protein은 단세포 생명체에서 인간에 이르기까지 다양한 종에서 발견되며 hyperthermia,15) 허혈,16) 허혈과 재 관류,12) 저산소증,17) 무산소증,18) 압력 또는 volume overload,18) 기계적 신장(mechanical stretch),20) vasFig. 7. The activity of managanese superoxide dismutase (MnSOD) in ischemic preconditioning group, heat shock group, and control group. The activity of SOD was significantly increased in ischemic area of ischemic preconditioning group (38.2±0.15, P≤0.01 vs heat shock, control group, 0.67±0.72, 0.65±0.29 in ischemic area using one-way ANOVA；P≤0.05 vs non-ischemic area in ischemic preconditioning group, 0. 11±0.16, Wilcoxon signed rank test). There was no significant difference in SOD activity between ischemic and non-ischemic area in each of heat shock and control group (0.34±0.40, 0.48±0.34 in non-ischemic area of heat shock and control group). PC；ischemic presconditioning group, HS； heat shock group.. opressin,21) isoproterenol,22) 과산화 수소,23) 칼슘통 로 차단제(Ca2＋-channel blocker),24) 중금속18)등에 의해서 발현이 유도된다. 다른 조직과 마찬가지로 심장에서도 다양한 스트레 스에 대한 반응으로 heat shock protein이 발현되며 스트레스로부터 심근의 손상을 막아내는데 중요한 역 할을 할 것으로 생각되고 있다. 심근의 허혈 스트레스에 대한 반응으로 HSP 70이 발현되며12) 열 쇽을 가하고 24시간 후 회복시킨 쥐의 심장에서 허혈로부터 심근이 보호되는 preconditioning 효과와 동일한 결과(cro-. 가 유의하게 높았고(P<0.01) 열 쇽군에서는 통계학적. sstolerance)가 나타난다는 사실10)이 알려지면서 pre-. 차이가 없었다(Figs. 4, 5 and 6).. conditioning 효과에 HSP 70이 관여할 것이라는 가설이 있었지만 그 기전은 아직 명확하지 않다. 현재까지 알려. MnSOD 활성도. 진 바로는 HSP 70이 허혈과 재관류에 의해 손상된 단. MnSOD 활성도는 허혈성 전처치군의 허혈부위에서. 백질이 기능을 발휘할 수 있는 모양으로 되돌아가는 것. 3.82±0.15로 열 쇽군의 허혈부위 0.67±0.72와 대조. 을 촉진시켜 세포가 빠른 시간내에 정상기능을 회복하거. 군의 허혈부위 0.65±0.29에 비해 유의하게 높았고. 나 손상된 단백질과 기능이 살아있는 단백질사이의 부. (P<0.01) 비허혈부위에서는 허혈성 전처치군이 0.11. 적절한 반응을 방지하여 심근의 보호와 회복에 기여할. ±0.16, 열 쇽군이 0.34±0.40, 대조군이 0.48±0.34. 것으로 생각되고 있다.14) 또 다른 기전으로 허혈상태에. 로 세군 사이에 통계학적 차이가 없었다.. 서 αβ-crystallin(HSP homologue)이 세포골격을. 또한 각각의 군 안에서 허혈부위와 비허혈부위 사이 에 MnSOD의 활성도를 비교하여 보면 허혈성 전처치. 안정화시키는 것과 관련이 있을 것이라는 가능성이 제 시되고 있다.25). 군은 허혈부위가 비허혈부위에 비해 유의하게 활성도가. 본 실험에서 허혈성 전처치군과 온열 쇽군의 허혈부. 높았지만(P<0.05) 다른 군에서는 통계학적 차이가 없. 위에서 발현된 HSP 70의 정도가 대조군의 허혈부위와. 었다(Fig. 7).. 비교하여 유의한 차이(P<0.01)를 보였을 뿐 아니라 온열 쇽군의 경우 비허혈부위에서도 HSP 70이 유의하. 고. 찰. 게 높게 발현됨을 관찰할 수 있었다. 또한 허혈성 전처 치군에서 허혈부위뿐만 아니라 비허혈부위에서도 발현. Heat shock protein은 급격한 외부 환경에 대한 반응. 되는 것이 본 실험에서 관찰되었는데 이는 허혈과 같은. 과정에서 생성되는 스트레스 단백질의 일종으로 세포가. 직접적인 스트레스를 받지 않은 비허혈 부위에서도 간. 스트레스에 대해 저항성을 보이는 것에 관여한다고 알. 접적으로 HSP 70이 발현되는데 영향을 미치는 인자가. 려져 있다. 어떤 한 종류의 스트레스에 폭로되었던 개체. 존재할 것이라는 가능성을 보였다. 이러한 인자의 존재. 가 후속되는 같은 종류의 스트레스에 일시적으로 내성. 에 대해 Williams들은 심근 허혈이 metabolic bypro-. 을 보일 뿐만 아니라 다른 종류의 스트레스에 대해서도. ducts, catecholamines, peptide growth factors의 분. 내성을 보이는데 이러한 현상을 crosstolerance라고. 비와 관련되고 이러한 인자들이 허혈을 받은 부위로부. 972. Korean Circulation J 1999;29(9):965-975.
(9) 터 떨어진 심근에서 heat shock 반응을 일으키는데 관. 져있는 연구에 의하면 허혈성 전처치후 4시간이 경과. 여할 가능성을 제시하였을 뿐아니라 이를 근거로 HSP. 한 상태에서 심근 보호효과는 거의 기대할 수 없지만 이. 70이 심근경색에 의한 심실 remodeling과 비후에 관. 미 상당한 양의 HSP 70이 발현되고 있고 MnSOD의. 여할 것이라고 주장하였다.26). 활성도 또한 높다는 것을 알 수 있었다. 이에 비해 심근. 심근이 허혈상태에 놓이게 되면 oxide 음이온, 과산화. 보호효과가 충분히 기대되는 열 쇽군의 경우(2nd win-. 수소, 수산화기 등의 과산화기를 만들게 되고 이렇게 형. dow)에 HSP 70의 발현이 현저한 상태에서 MnSOD. 성된 과산화기가 허혈성 손상과 재관류시에 일어나는 허. 의 활성도가 낮았다는 것은 열 쇽에 의한 심근 보호효. 혈후 손상에 기여한다. 또한 열 쇽에 의해서도 과산화. 과가 일어나는 기전에 있어서 HSP 70이 차지하는 역. 기가 발생된다.27) 이러한 과산화기에 의한 산화 스트레. 할이 MnSOD의 역할에 비해 더 중요할 가능성을 시사. 스가 antioxidative enzyme의 활성도를 증가시키는데. 한다고 할 수 있다. 또한 허혈성 전처치에 의한 심근 보. 그중 대표적인 효소가 MnSOD이다. MnSOD는 세포질. 호효과의 경우에 과산화기가 중요한 역할을 할 것으로. 과 마이토콘드리아내에 존재하며 과산화 음이온에 수소. 알려져 있고 HSP 70의 발현뿐만 아니라 MnSOD의 활. 분자를 결합시켜 과산화 수소가 생성되는 과정에 관여하. 성도 증가에도 관련되기 때문에 두 단백질의 변화가 과. 여 과산화기를 제거하는 작용을 한다.. 산화기의 자극에 의해 같은 경로를 거칠 가능성을 생각해. 심근허혈에 의한 MnSOD 활성도의 증가와 심근 보호. 볼 수 있다. 하지만 열 쇽의 경우에는 과산화기가 작용. 효과의 관련성은 아직 논란이 많다. Yamashita 등은. 하더라도 그 자극의 정도가 허혈성 전처치에 비해 작아서. 허혈성 전처치11)를 시행한 심근과 열 쇽을 가한 심근29). MnSOD의 활성도 증가가 더 늦게 나타날 수 있는 가. 에서 MnSOD 활성도가 증가되었고 심근 보호효과와. 능성을 생각해 볼 수 있고 또한 HSP 70의 발현에 관여. 관련이 있다는 보고를 하였다. 그러나 Turrens 등은 심. 하는 다른 기전이 있을 가능성도 있다. 가능한 기전으로. 근 보호효과와 관련이 없다28)고 하였고 Tanaka들은 허. 열 쇽에 의해 변성된 단백질이 HSP 70의 발현을 강력히. 혈성 전처치를 전후로 초산화 불균등화 효소를 주사하. 자극할 것이라는 가설31)이 있다.. 30). 였지만 심근 보호효과가 없었다 고 하였다. 본 실험에. 그러나, 본 연구의 결과를 명확히 하기 위해서는 좀더. 서 열 쇽군에서 MnSOD 활성도가 대조군에 비해 의미있. 다양한 실험이 필요할 것으로 생각된다. 허혈성 전처치. 는 차이를 보이지 않았을 뿐만 아니라 허혈부위의 경우. 후 1st window 효과가 사라지고 2nd window 효과가. 에는 허혈성 전처치군에 비해 통계적으로 유의하게 활성. 나타날 때 까지 심근세포내에서 일어나는 HSP 70과. 도가 낮았다. 42℃의 열 쇽을 가한 쥐의 심근에서 Mn-. MnSOD의 변화를 관찰하기 위해 재관류 4시간후에 심. SOD의 활성도가 24시간 이후에 증가하기 시작하여. 근조직을 얻었으나 본 실험의 결과에서 1st window에. 72시간후에 최고치에 달했다는 보고29)가 있어 토끼에. 의한 효과를 완전히 배재할 수 없는 가능성도 생각할. 서도 MnSOD의 활성도가 증가되는데 더 많은 시간이 필. 수 있기 때문이다. 물론 대조군에서 30분 허혈에 따른. 요할 가능성도 있다. 하지만 42℃의 열 쇽을 가한 후. HSP 70과 MnSOD의 변화가 허혈성 전처치군에 비해. 24시간이 경과된 토끼에서 심근 보호효과가 나타난다는. 현저한 차이를 보였기 때문에 1st window의 효과가. 2,6). 보고 와 본 실험에서 MnSOD의 활성도가 증가되지 않. 영향을 미치지 않았을 가능성도 높지만 이를 명확히 하. 은 결과를 비교해 보면 심근 보호효과에 MnSOD가 직. 기 위해서는 허혈성 전처치와 30분간의 허혈사이에 1. 접적인 영향을 미치지 않을 가능성도 생각해 볼 수 있다.. 시간 이상의 간격을 두어 결과를 비교해 볼 필요가 있. 저자들은 본 실험을 통하여 HSP 70의 발현과 Mn-. 다. 또한 열 쇽과 허혈성 전처치가 심근 보호에 미치는. SOD의 활성도와의 관계를 비교 관찰하고자 하였다. 허. 기전을 비교하기 위해서 열 쇽후 4시간 또는 허혈성 전. 혈성 전처치군의 허혈부위에서는 HSP 70의 발현과. 처치후 24시간과 같이 동일한 시간에 심근조직의 변화. MnSOD의 활성도가 모두 증가되어 있었으나, 열 쇽군. 를 관찰할 필요가 있다. 또한 여러 가지 약물에 의해. 에서는 HSP 70의 발현은 증가되어 있는 반면에 초산화. HSP 70과 MnSOD가 발현될 수도 있기 때문에 본 실. 불균등화 효소의 활성도는 증가되어 있지 않아서, 양군. 험에서 사용한 마취제의 영향을 배제하기 위해 마취제. 이 서로 다른 결과를 보임을 관찰할 수 있었다. 이미 알려. 만을 투여한 비교군을 실험에 포함시킬 필요가 있다. 973.
(10) Preconditioning 효과의 기전을 이해하기 위해 저자. 결 론：. 들은 허혈성 전처치 이후에 일어나는 세포 내 물질들의. 본 연구 결과 허혈성 전처치와 열 쇽 전처치에 의한. 변화를 관찰하고자 하였으며 앞서 지적한 바와 같이 향. HSP 70의 발현을 확인하였으며 MnSOD의 활성도 증. 후 더 많은 연구가 더 필요할 것으로 사료된다.. 가는 서로 다른 양상으로 나타남을 알 수 있다. 이러한 차 이는 HSP 70과 MnSOD의 발현에 있어서 서로 다른. 요. 약. 두 전처치가 작용하는 기전에서 과산화기의 역할이 다 를 가능성이 있으며, 특히 열 쇽에 의한 심근 보호효과에. 연구배경：. HSP 70의 역할이 MnSOD에 비해 더욱 중요할 가능성. 선행되는 짧은 허혈이 장기간의 허혈상태로부터 심근. 을 시사해준다. 하지만 preconditioning 효과의 기전을. 을 보호하는 preconditioning 효과가 알려지면서 그 기. 보다 정확히 이해하기 위해서는 향후 허혈성 전처치후에. 전을 밝히기 위한 노력이 계속되고 있다. 최근 연구에 따. 시간의 변화에 따른 HSP 70과 MnSOD의 발현을 여러. 르면 HSP 70과 MnSOD가 그 기전에 있어서 중요한. 시점에서 측정하는 연구가 필요할 것으로 생각한다.. 역할을 할 것이라는 결과가 나오고 있다. 이 연구의 목 적은 토끼를 대상으로 허혈성 전처치에 의해 발현되는 HSP 70과 MnSOD를 측정하여 열 쇽 전처치 후의 결. 중심 단어：허혈성 전처치・HSP 70・초산화 불균등화 효소.. 과와 비교하고 심근 보호효과와의 상관관계를 알아보 고자 하였다.. REFERENCES 1) Murry CE, Jennings RB, Reimer KA. Preconditioning with. 방 법： 뉴질랜드산 흰토끼 17마리를 허혈성 전처치(ischemic. 2). preconditioning)군, 온열 쇽(heat shock)군, 대조군으 로 나누어 허혈을 가한 후 심근에서 HSP 70과 MnSOD. 3). 의 발현 양상을 비교하기 위하여 면역화학조직염색과 SOD-525 kit를 이용하여 그 발현정도와 활성도를 측 정하였다.. 4). 결 과： 세 군 사이에 혈류역학적인 차이는 유의하지 않았으며. 5). 허혈성 전처치군과 온열 쇽군의 허혈과 비허혈부위 모 두에서 대조군에 비해 HSP 70의 발현이 유의하게 증. 6). 가되었고 각각의 군 안에서 허혈부위와 비허혈부위 사 이에 HSP 70의 발현의 차이는 허혈성 전처치군과 대 조군에서 유의하게 높았고 온열 쇽군에서는 통계학적 차이가 없었다. 또한 허혈성 전처치군에서 허혈부위뿐만 아니라 비허혈부위에서도 HSP 70이 발현되었다. 초산. 7) 8). 화 불균등화 효소의 활성도는 허혈성 전처치군의 허혈 부위에서 온열 쇽군과 대조군의 허혈부위에 비해 유의. 9). 하게 높았고 비허혈부위에서는 세 군 사이에 통계학적 차이가 없었다. 또한 각각의 군안에서 허혈부위와 비허 혈부위 사이에 초산화 불균등화 효소의 활성도를 비교 하여 보면 허혈성 전처치군은 허혈부위가 비허혈부위 에 비해 유의하게 활성도가 높았지만 다른 군에서는 통 계학적 차이가 없었다. 974. 10). ischemia: A delay of lethal cell injury in ischemic myocardium. Circulation 1986;74:1124-36. Currie RW, Tanguay RM, Kingma JG. Heat-Shock response and limitation of tissue necrosis during occlusion/ reperfusion in rabbit hearts. Circulation 1993:87: 963-71. Yellon DM, Baxter GF. A second window of protection’ or delayed preconditioning phenomenon: Future horizons for myocardial protection? J Mol Cell Cardiol 1995;27: 1023-4. Ytrehus Y, Liu Y, Downey JM. Preconditioning protects ischemic rabbit heart by protein kinase C activation. Am J Physiol 1994;226:H1145-52. Gross GJ, Auchampach JA. Blockade of ATP seneitive potassium channels prevents myocardial preconditioning in dogs. Circ Res 1992;70:223-33. Marber MS, Latchman DS, Walker JM, Yellon DM. Cardiac stress protein elevation 24 hours after brief ischemia or heat stress is associated with resistance to myocardial infarction. Circulation 1993;88:1264-72. Das DK, Engelman RM, Kimura Y. Molecular adaptation of cellular defence following preconditioning of the heart by repeated ischemia. Cardiovasc Res 1993;27:578-84. Baines CP, Goto M, Downey JM. Oxygen radicals released during ischemic preconditioning contribute to cardioprotection in the rabbit myocardium. J Mol Cell Cardiol 1997;29:207-16. Zhou X, Zhai X, Ashraf M. Direct evidence that initial oxidative stress triggered by preconditioning contributes to second window of protection by endogenous antioxidant enzyme in myocytes. Circulation 1996;93:1177-84. Hutter MM, Sievers RE, Barbosa V, Wolfe CL. HeatShock Protein induction in rat hearts, A direct correlation between the amount of heat-shock protein induced and the degree of myocardial protection. Circulation 1994;89: 355-60.. Korean Circulation J 1999;29(9):965-975.
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