組織에 서 의 Estradiol Receptor 分析方法에 관한 昭究

(1)

대 한엽 상병 r:] 사회 지 : 끼 16컨 지11 후 1984

組織에 서 의 Estradiol Receptor 分析方法에 관한 昭究

서 울大學校病院臨*病理科

鄭夏承

Study on the Estradiol Receptor Àssay in Tissue

Ha Seung Jung

DePI

^‘

0/

Cliη ical

Lab , Seoul NaUonal UniversUy Hosp

z"t

al

=Abstract=

Several methods of estradiol receptor assays in tissue have been proposed; The method of dextran coated charcoal (DCC) , sucrose density gradient centrifigation (sedimentation) and hydro- xylapatite , etc. Among them , the method of DCC was simply modified in this experiment.

The result are as follows;

1. 1t is required in this model to decrease the amount of (6.7

³

H) estradiol to around one twen- tieths and to shorten the time of solvent evaporation. Also it can performed on many specimen simultaneously.

2. True bound forms are abtained by use of DES (diethyl styl bestro

l)

as non specific bound forms in cytosol instead of the blank without cytoso l.

3. The correlation between the concentration of estradiol receptor and Boun/Free ratio in Scatchard plot shows the excellent linearity (r=O. 925-0. 994)

4. Using such a simplified method , estradiol receptor assay in breast tissue can be performed easily and particulary it useful in the diagnosis and treatment of breast cancer by determination of the concentration of estradiol receptors.

1 . 서 론

estradiol

receptor에 대 한 청 성 적 및 정 량적 분석 의

필요성은 분석화학이나 생화학적 면에서는 물론 임상

화학적 면에서도 려우 중요하다. 여성 생식거와 같응

조직들은 분화와 말육과정중에 일정량의 Steroid 호르 폼을 외부로 받아들여야만 적절한 성장과 본연의 기능

을 발휘할 수 있다는 사살은 오래 천부터 알려져 있 다1) • 또한 이 러 찬 조직 에 는

steroid

호르폼을 선택 척 ￡ 로 받아들이는 receptor가 존재하고 있다는 사살도 밝

혀져 있다. 이 receptor는 단펙질로 세포잘내에서는

- 3

steroid

호르몬파 결 합하여 complex릎 형 성 한 후 써l~

액내로 이동하여 핵산의 단텍칠 생합성 메카니즘에 영

향을 마침무로써 그 호르온의 기능을 발현한다고 얄려

져 있다2， 3).

이 러 한

steroid

후르푼의 receptor중에 서 는

estradiol

위 receptor가 비 교적 않 ò] 떤구되 어 있 다 •

이 receptor는 분자량이 20만 정 도의 8S의 단벡 철

--_내에 존재하며

O.3M

Kcl 용액 A로 처리하면

4S

로 가역 척 으로 헤 리 되 며

,

estradiol과 complex블 형 성

하단 5S 단백철로 변화되어 세포핵내로이동한다4)

•

이

러 한

estradiol receptor

complex의 세 포핵 내 에 서 의 작

용 메카니즘은 명확하지 않으나 표적세포내의 chromo-

(2)

somal nonhistone

단백 칠중의 특허 산성 단백 질파 득 이하게 결합함으로써 RNA 합성을 촉진시켜 준다고 한 다i 긴6). 이 러 한 호르온 reccptor는 정 상조직 이 아닌 암

조직에도 존재하고 있음이 알려져 있으며， 특히 유암 (￥L癡) 에 서 는 이 러 한 estradiol receptor의 조직 내 함량 이 매우 중요한 임상척 의의블 지니고 있다는 것도 얄

려져 있다 7， 8， 9) •

1942년 Bittner

¹⁰

)에 위 해 유암의 발생 기 천으로 뇌 하 수체-성선축(性願輔)의 호르몬 분비 이상이 지적된 이후 초기에는 주로 유암과 그 조직 또는 혈청과 소변 중의 estrogen

,

progesterone 등의 농도사。1 의 장판관계

를 칩 중적 으로 연구하여 왔으나11， 12， 13， 14， 15) , 최 근에 는

steroid 호르몬의 작용 메카니즘이 밝혀짐에 따라 호르 폼의 표적세포내의 선택적 receptor와의 complex 형성

야 중요한 의미를 갖고 있다는 것을 알게 되었다16， 1).

이 러 한 receptor는 호르몸 의 존성 조직 내 에 특이 하게

높은 농도로 존재하며 24) 특히 유암조직의

estradiol

receptor의 함량과 호르몬 요법에 10， 17， 18) 의한 치료 효

과간에는 매우 높은 상관관계를 보이고 있음01 알려진 후로는 유암조직 에 서 의 estradiol receptar의 청 랑분석

운， 거 의 필수적 으로 되 어 있 다5， 7， 8， 9， 19， 20， 21) •

본 연극L는 이 와 같은 실정 을 고려 하여

Steroid

호르

몬 receptor의 측청 방법 을 확렵 할 목적 으로 몇 가지 estradiol receptor ~ 청 량결과를 토대 로 더 간펀하고，

청확한 측정방법에 대하여 연구하였다.

n. ^{실험재료 및 방법}

1.

실험재료

@시 약

3H-estradiol-17얘 (6，

7-3H estradiol-17ß , Specific acti- vity: 52 Cijmmol , Concentration; 5.0mci) PPO (2 , 5 Diphenyl oxazole) , Tritonx-100 Glass counting vial;

NoritA chacoal , estradiol , DES (diethyl stylbestrol) Trisaminomethane , Na2-EDT A;

Dextran , Sephadex LH-20;

Sllcrose;

@측청거기

Fraction collector;

Deep freezer;

Refrigerated ultracentrifuge:

Liguid scinti1lation spectrophotometer;

@재 료

Sprague-Da w ley계 흰쥐의 근육， 고환， 간장등의 조

- 4

직파 유암조직

@

정제 및 조제

가.

3H estradiol-17

^{ß의 정 제}

3H estradiol-17 ß

원액응 reservoir가 부착된

seph

^‘

adex LH-20 column

chrormatography에 의 해

3

개월에 1회씩 정제하였다.

나. Buffer 용액

6) O. O1 M Tris-Hcl buffer

^용액

, PH7.4

<9 O.OlM sucrose Tris-Hc1 buffer

용액

, PH8.0

다.

Dextran-coated chacol

^용액

6) 0.025% dextron-coated charcoal

용액 (1주알 유

효)

<9 0.05% dextran-cocted charcoal

용액 (1주일 유

효)

라.

Li guid Scinti1lator

PPO

10g파

methanol 40mI

,

toluene 1

^,

960ml

^,

triton

X-100을 II로 coctail하였 다.

@

cytosol의 조제

약

1"-'2g

청도의 조칙을

1

"-'2mm정도의 크기로 잘게 자른후 3，，-，4배 의

Sucrose Tris-Hcl buffer

용액 을 가 하여

Biotron

homogenizer로 마쇄 하였 다.

조직을 마쇄할 해 열에 외한 단백철등의 변성을 방 지하기 위하여

ice

bath에서 15초간 마쇄하고난 후

45 초간 청지하였다가 다시 마쇄하였으며 이것을 4회 반 복 살시하였다. 이와 같이 마쇄된 조직은 냉동초원심

기 로

swing bucket

rotor를 사용하여 108， 000xg에 서 1 시간 원섬분리하여 그 상청액안 cytosol분획을 얻셔 단백칠을 경향한 후 회석하여 사용하였다. 단백질 청 량은

Folin-Phenol

시 약을 사용하여

Lowry

방법 19)으로 측정하였다.

2.

살험망볍

방볍

1 ;

제

2

조의 시 험 관에 는

sucrose Tris Hc1

buffer용액 만 을 1ml썩 가하였 다 (blank count용 시 험 판).

제

3

조의 시 험 판에 는

sucrose tris-Hc1 buffer

용액 만 을 2ml썩 가하였 다 (total count용 시 험 관). 이 와 갇。l

(3)

이

true

bound의 dpm파

total

bound 의 dpm차로 부댐

free

_{from을 주하였}다. bound의 dpm파

free

form의 dpm으로부터 boundjfree비 를 계 산하여 y측오로 하고

estradiol receptor

함량을 결합된 cytosol 내 의 단벡 질

1mg당 fmol로 환산하여 z측으로 하여 도표로 나타내 면

Fig.

2와 같다. 이 때

estradiol

receptor의 농도는

conc. of estradiol receptor (fmoljmg'prot) true bound(dpm)

114 , 400

X _A{\

conc. of prot. (mgjml)x

1 :V{\{\_

40 1 , 000

로 계산하였다.

방법

2

;시험판을 2개조로 나누어 제 1 조에는 각 시 험 관에 3H-estradiol 만을

0.1 , 0.25 , 0.5 , 0.75 , 1 , Z

pmol 넣 고 (total

bound

form용 시 험 판) 제

2

조에 는 제

1

조의 각 용액 에 다 3H-estradiol 파 이 농도의 200배 에 해 당하는

estradiol

즉

20 , 50 , 100 , 150 ,

200， 400pmol 을 가하였 다 (non

specific bound

form용 시 험 판). 이 와 같 이 만둔 제

1

조 및 제 2 조 시험판의 ethanol은

37

⁰

C water

bath에 서 질소가스를 사용하여 증말시 켰 다. 여 기 에 앞에 서 조제 한 cytosol 을 농도가 2mgjml되 도록

Sucros Tris-Hcl buffer

용액 A로 희 석 하여 이 회 석 된 cytosol을 0.5ml싹 가한둬 진당한 후 각 시 험 판들을

4

⁰"，lO^oC에 서 12시 간 incubation하였 다. 그리 고

0.05%

dextran -coated charcoal

용액 을 0.5ml씩 가하여

4

⁰

",

10⁰C에 서 10분정 도 incubation한 다음 2， 000Xg에 서 10분간 원심분리하고 0.5ml의 상청액을 5ml의

sCÎn-

ti1lator가 들어 있는

glasscounting

Vial에 가하였다. 이 것 을 12시 간 정 도 싣온에 방치 한 다음 방사능을

Packard Tri Carb B 2450 liquid scint

ilI

ation

counter로 측정 하였 다(별도로

3H estradiol O. 1 , O. 25 , O. 5 , O. 75 , 1 , Z

준비한 제

1 , 제 2 , 제 3 조의 천 시험관을 4

⁰

"，lO

^o

C에

서 12 시 간정 도 incubation한후

O. 025 % dextran -coated charcoal

_{용액을 가하고}

vortex

mixer로 정확히 10초씩 혼합한 후 10분정도 방치하였다. 이것을 4⁰

C에서 2 , 000

Xg의 냉동원성기로 원섣분려하고 즉시 장청액 1ml씩

을 5ml의 scintillator가 들어 있 는

glass counting vial 에 넣고 흔합 후， 싶온에서 12시간 방치한 후 방사능

을

Packard Tri Carb B

2450또는

(3255) liguid scin- ti1lation

counter로 측정 하였 다.

bound cont용 시 험 관의 장청 액 으로 측청 된 cpm을 dpm으로 환산하여 bound form이 라 하여 3축어11 ， total

count용 시험관의 상청액으로 측정띈 cpm을 3축으혹 하여 도표로 나타내 면

Fig.

1 과 같다.

blank

count용 시 험 관의 장청 액 으로 측청 된 cpm을

dpm으로 환산하여 도표로 나타내 면 Fig. 1의 b

와 같 고

bound form의 dpm을 도표르 나타내 면 Fig. 1의 a

와 같다.

a 에 서 b

블 빼 어

true bound from을 구하고

2500 (cpm)

Fig. 1. True bound form calculated by method 1.

스↓ ../ tr따

-1ι/. - _- _- •

100 s

、

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γ

\

-

\

- 깐’!’펴

1FlJj1

」넉」

,- ‘ l

O. 1 O. ~5 0. S 0 amount oÍ ;; H ('stradiol

Fig. 3. True bound form by method 2.

cC'::c. of es:radiol r('c('ptnr of cytosol (fmol/mg. p:'ot

,

Fig. 2. Scatchard plot by Fig. 1.

(4)

fmol의 ethan이용액

을

counting vial에 넣 고 counting

하여 total로 하였 다).

측정 된

Total , bound(Fig.

^3의

a)

그러 고

non specific bound form(Fig.

3의 b)을 도표로 나타내 면

Fig.

3파 같다.

Fig.3도 방법

1

과 같이

estradiol receptor

^{함량은 단}

백질 1mg 당 fmol로 나타내었다.

방볍

3 ;

7개 의 시 험 관에 O.lpmol의 3H-estradiol을 넣 은 후 각 시 험 관에 estradiol을.

0 , O. 1 , O. 2 ,

α

3 , 0.5 ,

1 ， 20pmol을 가하였다.

각 시 험 관을

37

⁰

C water

bath에 서 질소가스를 사용 하여 ethanol를 증발시킨 후 방법 2 와 동일하게 처리하 였 다. 계 산값은 방법

2

의 Fig.3에 서 와 같이

true bound

form이 거의 일청한 ¹³1 율로 증가되었기 혜문에 싣제 시험판에는 3H-estradi이

ethanol

^{용액을 통일하게}

0.1

Pmol씩 넣 고

estradiol ethanol

^용액^만은

0 , 0.1 , 0.2 ,

O. 3 , O. 5 , 1. 0 ,

20Pmol로 변화시 켜 가하여 측청 한 후

total bound

form을 구하면 Fig.4의

a

와 같다.

20pmol

estradiol을 카하였 을 혜 를 충분한

non specific bound form (Fig.

4의 b)~록 생 각하며 모든

total bound

form으로 부터 이

nonspecific bound

^form을^빼

서

O.lpmol

3H-estradi이에 서 의

true

bound값을 계 산 하였 다. 다음 각 시 험 관에 첨 가한 SH-estradiol 양파

estr-

adiol합이 모두

3H-estradiol

양이 라고 가정 하면 각 시 험 판의

3H

estradi이의 양응

0.1 , 0.2 , 0.3 , 0.4 , 0.6 ,1. 1 ,

20.1pmol 이 되므로 (Fig.4의 ( )농도)

Fig.

4에서 겨1 산한

O.lpmol

3H-estradiol의

true bound form(Fig. 4

의 c， d， e， f， g)으로 부터

0.2 , 0.3 , 0.4 , 0.6 , 1. 1 , 20.1

Pmol의

3H

estradi이로 가정 하여

cX2 , dX3 , eX4 ,

fx6 , gX 1.

1 로 계산하였다. 농도밸 계산값을 도표로

〈펙

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20í?) (20.1)

Fig. 4. True bound form at O. lPmol 3H-estradiol

*sum of 3H-estradiol amount and estradiol amount.

6

나타내 며

,

Fig.5와 같고， Fig.5룰 방법

2

와 같야

scatchard

^{plot를 작성}^하여

estradiol

receptor함량을 쿠 하였다.

방법

4 ;

3개의 시험판을 준비하여 pmol의 3개

estradiol ethanol

용액 을 와 같이 잘험하여 계산하였다.

각 시험관에

0.5

가한마음 방법

2

방볍

5 ;

방법

5

에 서 는 5개 의 시 험 관에

3H-estradiol

을 각각

0.025 ,

^α

05 , o. 1 , O.

^{2pmol을 넣}^{고 5 벤의 시}^험

관에 는 40pmol의

diethy

stglbestrol을 가하였 다. 다음 에 앞에서 조제한 미리 청 량한 cytosol을 단백질이

mg

/200μ1되 도록

sucrose Tris-H c1 buffor

용액 으로 붉게 하 여 200μl썩 가한 후 41"J 10⁰C에서 1시간 incuisation한 후 5 먼 시 험 판에 는 별도혹 0.2pmol의

3H

-estradiol을 가하여

nonspecific

bound를 산출하는데 사용하였다.

4I"J IQOC에 서 12시 깐

incubation

한 후，

0.05% dextran- coated

charcoal을 0.5ml썩 가하여 원심분리하여 상청 액 200μ1를 취 하여 5ml의

scinlt i11 ator

(이 해 는

triton x-100

제 외 ) 가 들어 있는

glass counting

vial에 넣 어 방

초 40끽 -

홍 ~---돼파

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^f ^rm ^{+ -}

U. 1 (\. :_'

:i ().

4 ) 이 1. 1 Pmol)

Fig. 5. True bound form ca1culated.

(::-r: η1 2^rlGυμn

25 50 100

arc:O'j!lt of 3H-cst:-adiol

Fig. 6. Concentration of true bound form in

^200μ1

of supernatant.

(5)

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/8

.1

ι f 9

e

、b\ \

~~

\

(6)

Table 2. Experimental data in breast tissue(Chronic mastitis) measured by method 2 (cpm: duplicate mean)

No. of tube

1L

9“

nJ

A*

-a

”b

1 에

•

ψ-$

이아 없 때 뻐 때

m m m

‘-

•

LU

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씨↑」-뻐

1%

」

T|

뻐뻐-- α m

m -4

4 ”“

νι -h」g

rL

‘- AUn

”“

/‘、-

뼈베삐삐펴때셈왜퍼심쩨

E

니l

a n -

펌 뼈

짧 따-

--nU

nU

1i

”i 1l 1i

짧

m-3

7

m

돼

낌 ”이 K M 때-

히j

d

| - UJψ1----

팅기l니이!--

---u nu--i

。‘

-u

”

i l

f c c ---

기 커

a

@

-o o o o

1 2 품 짧

@-

total 1 (cpm) I 4 , 7961 1 , ⁹¹²ⁱ

2 , 563) 38 , 084) 51 , 5141 109 , 982i

free (cpm) I

4 , 760) 1 , 831 25 , 537 37 , 948 51 , 354 109 , 742

co

r;

c of estradiol B/F

I

receptor

i (fmol/mg. prot) 0.381 0.69 0.301

1.

56 0.191

1.

81 0.181 2.61 0.161 3.08 0.111 4.61 cpm/ I

fmol 1 47. 왜

Table 3. Experimental data in breast tissue measured by method 3 (cpm: duplicate medm)

야

-- -띠

얘

--

’g

r‘

--

n

p

-‘

영

•·-%

닮

m m

않

% --

아

야

Lm

… nι

L 2 2 2 2 -- m 때 떼

---

m

%

m ---

-L

hJ

굶때씨며돼낌(쩌

-|-

R

-1

0 0 0 0 0 -- 샤니미

j

「

뻐왜패쩌뻐

「」 따

”

m -낀 깎 때 낀 낀

-- ---기----!

찌꺼」쩌|a|8|W

기「---

-댔 -패 쩨 패 돼 찌

-- -f -9

M

mm

%

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--

m -꾀--패쐐패뼈패

-l

一 m

m

-Qι

‘

μ mι

‘

잃‘ mι

-- 기비11「

쩌히에외씨에」---비

--빼

-강

mm

m m 많

--때

-4f

---Q

‘

마」이끽

끽 4

씨페미괴

1-

아

mJu 때빼빼

-o o o

--m o

-삐

m

a

t와야---m

m

*I

E

---r

n

페 |m 시「

씨끽페펴시아

-1- 않 m 때

f

때

뼈-(

( ( (

-mω

:

m

-,

.때

K

o r

n---

‘

m

와

φ---a

퍼 ---μ

E|

’-j

끽외의의끽

lTl 쿄

K

-빼빼 m-E

$

앓 찌 파

--鋼 때

꾸

--j 에니서에 hi--

젠 때

m -맹‘삐때-않

파 파 m 싸

ζι

--，따

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m·-m

m 따

---m

짧

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U--

에머↓ 메

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에

1-m h

-짧바떼-않

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% 앓 때

-뀐 -때

m

---,

t

’0

-펌‘때갚

----

iILl--υt

lllljllll117|m

m

，따

e

--[

m E M

뼈

2

3

4

5 6 -7 -*

林

2 를 모색하였다. 방법 2 에서는 방법

1

의 5， 6， 7， 8 벤의 시험관에 해당하는 농도를 기줍으로 하여

0.1 , 0.25 ,

O. 5 , O. 75 , 1 ,

2pmol의 estradiol을 사용하였 다. 방법

2

에 의해서 유방조직의

estrediol receptor

함량을 측정 한 결과는

Table

2과 같다.

Table

3의 살험적 결과를 계 산하여

scatchard

plot을 작성 하면 Fig.8에 서 와 같야 이 조직 내 의

estradiol receptor

함량은

5.0 fml/mg.

p10t이 었 다 (y=-0.082x

+0.415 , r=0.897).

방법

2

에 서 는 방법

1

에 서 고려 하지 않았던

nonspeci- fic bound

form에 살제 영 향을 주기 위 하여

estradiol

의 농도를

3H-estradiol

농도의 200배 씩 첨 가하였 으며 또 cpm에서 dpm으로 환산하여 농도를 구하는 먼잡함

을 피하였고 시험관의 사용도가 5분의 2로 줄게 됨에

짜라 방사성 동위원소의 소모량도 5분의 2로 줄이게 되었을 뿐만 아니라 용매의 증발시간도 단축되었고 또 한

linearity

curve도 향상되 었 으나 만족할 청 도의 것 은 아니었다. 또한 방볍 2 의 살험결과는

true bound

form파

nonspecific bound

form이 첨 가된

3H-estradiol

의 농도에 거의 비례하고 있음을 알 수 있었다. 이에

따라 방사정 동위원소의 사용량을 방법에서 보다 절반 으로 더 줄이기 위해 방법 3 을 요색하였다.

방법

3

에서는

o. ^{1 pmol}

3H-estra::iol 만 사용하고 B/F

R ‘)

.

(),ì

.

(fm서 /m딛 prdt f nl시 /ηg. rJ ;‘끼 of (，이 osol)

CO^T\(‘,of l' 까 ’ 2..d!: n.、이‘ p ↑ ;t‘

Fig. 8. Scatchard plot by Table 3.

。。

(7)

Table 4. Expεrimental da~a in breast measured by method 4.

No. of

1

cpm amount amount

^jl

c nnm conc of estradiol

of ea3sHdtrloa elsd+tlro-l1

^1l

tme

J l 1

true of

않(Pt or1a1t1adOlIlO)l bound

|

^|

^total

¹¹^J

;p많{ I ^freE

^BjF

^receptor

tube

1

adiol +

I

boundj

I

boundj

estradiol (fmoljmg. prot.)

0.5m I ml

1 81. 8 38.5 77.0 0.5 51. 27 25 , 556 0.30 1. 46

2 46.3 3.0 6.0 10 10.5 53.92 539 , 07 0.02 2.30

3 43.3 100 100.5

* Sum of amount of 3H-estradiol and estradiol

** True bound calculatedper ml x total amount estradiol

estradiol은

3H

-estradiol의

1 , 2 , 3 , 5 , 10 ,

200배 로 첨 가 하여 측정 하였 다. 방법

3

_{우후 유방조직}_의

estradiol

receptor의 함량을 측정 한 결 과는

Table

4와 같다.

Table

3에 서 이 론적 으로 계 산하여 Fig.9와 같이

Scatchard

plot를 작성 하면 이 조직 내 에 서

estraol

receptor의 함 량은

3.5 fmoljmg.

prot이 었 다.

true

B/F 1.0

0.8-

써 l ,

O U

0.4

0.2-

\

(f m이 /mg. [lT"ot ."f ("vt( 이，， 11 conc. of cs t T"adi

,

,1 n' ， πp ‘ 0['

Fig. 9. a Scatchard pbt by Table 3.

bound form의 농도를 이 론상 계 산하게 되 묘로 O.lpmol 의 3H -estradiol에서의 싶제살험에서 척은 오차를 가져

옹다 할지라도 결파적 A로는 큰 오차블 가져오는 경우 도 있케 펀다-(y=-O.

411x+1. 434 , r=0.988).

또 한

펀 임상척 의의를 감안하여 정상과 비정상무로 나누어

불 수 있는

screen test롤 모색 하는 동시 에 대 링:의 검

체를 살시하는데 목척이 있을 뿐 아니라 필요이외의 실험을 줄이기 위해 방법 4 를 모색하였다. 방법 3 과 같이 estradiol을

10 , 100pmol로 가하여 측정 하여 계 산

하였 다. 방법

4

에 의 해 서 유방조직 의

estradiol receptor

의 함량을 측정한 결과는

Table

5와 같다.

Table 4에 서 살험 과 이 론척 무로 겨l 산하여 Fig. 10에

서와 같이

scatchard plot블 작성하면 Fig. 10에서와

같이 이 조직 내 의

estradiol receptor

함량은 2.3 fmoll

mg. prot

o

] 었다. 방법 4 에서 실험수가 너무나척어 오

차의 범위는 한층 더 커지게 되므로 이러한 문제점을 보완하고 또한

3H

estradiol의 사용량을 방법

2

에 서 ..!L 다 종 더 줄이면서

screen test와 청 량성을 동시에 겸

벼 할 수 있 고

nonspecific bound

form에 estradiol보디

더 특이 하게 반응하는 DES를 첨 가하므로써

true bound

form에 대한 살혐의 오차를 풀이기 위해 방볍 5 를 모 잭 하였 다. 방법

5

로 유방암 조직 내 외

estradiol receptor

의 함량을 측정한 결과는

Table

5와 같다.

Table

5의 실험 결과를 Fig.6 과 같이 작성 하여

true Table 5. Experimental data in breast cancer tissue measured by method 5 (Cpm: auplicate mean)

)때|뻐 mω 야

α

‘찌‘ m-

않 않 않 많

rl、

F4-

/Il、-

떼 뻔 패 뼈

m $

h

κ--L

2

5

‘

m

따

M )-껑

애

O O

m

에 m 때 ，떼 -m

m

+S

때빼 펀 때많

1 2 3

4 5

0.21

0.12

0.088

0.053

BjF

(8)

B/F

E/F

2 ::5 4

(ímol/r.1g prot .of c\'t ，~， o]) conc. of e 서 ra 서 ; r,] r('ρ .. plor

Fig. 10. Scachard plot by Table 4.

\

•

1) l~

•fm"l/mg. [11'''1 ,,[ 이 111:，，， 1) (기 샤 ν:-;t r?.c!i(d rl、 ηνI끼 ur

Fig. 11. Scachard plot by Table 6.

bound

form의 농도를 쿠한 다음 Fig.11 과 같이

scat- chard

plot를 작성 하여 이 조칙 내 의

estradiol receptor

함향을 구한 결과는

12.0 fmoljmg.

prot이 었다. 이 혜 의 모든 계산은 cpm에서 칙캡 fmol로환산하였다 (y=

-0. 024x+0. 28 , r=0.925).

방볍 5 에 서 는 nonspecific bound 물질로 estradiol을

사용하는 대 시 DES을 사용함에 짜라 8H.estradiol의 농도를 다른 방뱀에서 사용한 농도보다 10매냐 줄여서 해 도 좋은 실험 결과와

scatchard

plot를 작성 할 수 있 게 되었다.

방뱀

5

로 쥐 고환조직 의

estradiol receptor

함량은 측 정한 결과

23.8 fmoljmg.

prot.) 로 높았고 또한 쥐 곤

육조직， 피부조직， 두뇌조칙， 간조직은 각각

0.57

,

5.4

,

1. 3

,

3. 7 fmoljmg.

prot로 났케 나타났고， 유암 조직 의

eslradiol receptor

함량은

12 fmoljmg.

prot로 높은 함량은 나타냈다. 이와 같이 개선한 방법 5 에서 는 적 응 양의 3H-estradiol과 적 응 수의 시 험 판을 사용 함에 짜라 실험과정의 시간도 현저히 단축되었고， 반 응의 예만도도 증가되었다.

N. 결 론

본 실험 에 서 는 3H.estradiol을 사용한 DCC 법 을 이 용 하여 이 망법을 단계척오로 보완， 개선하묘로써 좀 더 경제적이고 대량의 검체를 웹고 간펀하게 처러할 수 있으며 또한 정확한 결과를 얻을 수 있는 실험방볍을 확립하는데 노력하였다.

개선된 실험방법을 이용하여 실험한 결과는

3H-estr-

adiol의 소모량은 처 음보다 20분의 1로 감소시 킬 수 있

었으-며 사용한 시험판의 5분의 1로 감소되었다. 이에

따라 용매 증발시간은 단축되었￡며 •• 많은 검체를 동시 에 분석 할 수 있 케 되 었 다.

nonspecific bound

form을 측청 하기 위 하여

nonspecific

bound에 특이 하 게 작용하는 DES를 첨 가한 결과 cyosol내 의

true bound

form의 강도는 증가하게 되 어

3H.estradiol

사용량은 감소되였다.

Scatchard

plot상에 서 의

estradiol

receptor의 농도와 BjF 비 와의 상관관계 에 대 한

linearitY7}

^향상되^었^다

(r=O. 925

^{" ,}

0. 994).

개 량한 DCC 방법 을 이 용하여 여 러 가지 조직 내 의

estradiol

receptor의 함량을 측정 한 결 과 성 선 (性服) 인 쥐 의 고환조직 에 서 는

estradiol rece-

ptor의 함량 (23.8

fmoljmg.

prot.) 이 비교척 높아 양성 오로 나타난 반면 쥐 의 근육 (0.57

fmoljmg. prot.) ,

피 부 (5.4

fmoljmg. pro

t.) 두뇌 조직

(1 .3 fmoljmg. prot.)

간조칙

(3.7 fmolj mg. prot.)

^등에^{서 는 음성}^{A로 나타}

났다. 또한 유암환자의 유방조칙 내 위

estradiol receptor

함량(12.0

fmoljmg.

prot.)은 다른 종양성 환자의 유 방조칙 의

estradiol receptor

함량 (5.0

fmoljmg. prot.)

보다는 비 교적 높은 값을 나타내 어 양성 으로 나타났다.

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組織에 서 의 Estradiol Receptor 分析方法에 관한 昭究