고활성 근권생육촉진균주 Burkholderia pyrrocinia 13-1에 의한 저온조건에서의 유채생육촉진
이재은 ･ 조상민 ･ 조영은 ･ 박경석*
농촌진흥청 국립농업과학원 농업미생물과
(2009년 9월 27일 접수, 2009년 10월 5일 수리)
Canola Plant Growth Promotion by a Selected Plant Growth Promoting- Rhizobacteria, Burkholderia pyrrocinia Strain 13-1 in the Cold Condition
Jae Eun Lee, Sang Min Cho, Young Eun Cho and Kyungseok Park*
Division of Agriculturral Microbiology, National Academy of Agricultural Science, RDA Suwon 441-707, Korea
Plant growth-promoting rhizobacteria (PGPR) are beneficial native soil bacteria that colonize plant roots and result in increased plant growth. The objective of this study was to determine the plant growth promotion in canola plants by selected PGPR strain 13-1 under low temperature condition. The seed treatment of strain 13-1 was enhanced plant height and root elongation on canola plant at low temperature condition. This result determined that a selected strain of PGPR can enhance plant growth and root propagation under extremely low temperature conditions. Thus, this PGPR strain extends their role on plant growth promotion on canola until low temperature condition for practical applications.
Key words PGPR, Burkholderia, 13-1, canola, cold resistance Abstract
*연락저자 : Tel. +82-31-290-0424, Fax. +82-31-290-0406 E-mail: [email protected]
서 론
유채(Brassica napus)는 분류학적으로 십자화과(Brassicaceae), 배추 속(Brassica)에 속하며 원산지는 스칸디나비아반도에서 부터 시베리아 및 코카서스 지방에 걸친 지역으로 알려져 있 다(Downey, 1983). 발아온도의 한계는 최저 4℃, 최고 38～
40℃이고, 최적온도는 25℃이다. 발아 시에는 과다한 습기를 피하고 생육기에는 많은 수분이 필요하다(Raymer, 2002).
우리나라에서는 주로 유채를 봄에 개화시키기 위하여 가을에 파종을 하기 때문에 겨울 동안의 기온이 유채의 월동에 중요 한 요인이 된다.
많은 작물의 경우 낮은 온도는 스트레스가 되어 분자적, 생
화학적, 물리적 변화들을 일으키게 되고 식물의 생육 및 생산 성을 억제하는 주요한 요인으로 작용한다. 이러한 문제점을 극복하기 위하여 화학물질을 응용하여 내한성을 높이거나 (Chen과 Li, 1976; Gusta 등, 1982; Andrew와 Morrison, 1992) 돌연변이 육종을 통한 내한성 품종을 개발하기 위한 연구가 활발히 이루어지고 있다(Eun 등, 2007; Scott와 Laima, 2008).
PGPR(Plant growth-promoting rhizobacteria)이란 토양세 균으로서 식물의 뿌리에 정착하여 그 결과로서 식물의 생육을 촉진시켜주는 세균을 말한다(Kloepper, 1994; Cleyet-Marcel 등, 2001). PGPR은 옥신과 같은 식물 생장 호르몬을 생산하 여 직접적으로 식물에 유익한 효과를 가져다 주며(Kloepper, 1993) 식물이 직접 흡수할 수 없는 성분을 식물이 이용 가능 하도록 변환시켜 주거나 흡수를 도와주는 역할을 하고 인산
연구보문/방 제
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의 가용화와 2,3-butanediol과 같은 휘발성 물질생산을 통해 식물생육촉진 효과를 부여한다(Ryu 등, 2003). 또한, PGPR 은 생물적 스트레스와 비생물적 스트레스에 저항하기 위하여 식물의 영양분과 물의 관리를 개선시킨다(Bensalim 등, 1998;
Barka 등, 2002). 식물이 다양한 스트레스에 대한 반응으로 에틸렌을 합성한다는 것은 잘 보고되어있다(Hyodo, 1991;
Abeles 등, 1992). 또한 PGPR이 갖는 유용기능 중 유도저항 성 발현에 따른 발병억제 효과와 환경 스트레스에 대한 저항 성 등의 기능이 보고되고 있다(Park 등, 2007). 에틸렌의 전 구체인 1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid(ACC)를 가 수분해하는 효소인 ACC deaminase를 생산하는 Pseudomonas putida GR12-2를 유채 종자에 처리하였을 때 저온과 같은 스트레스 환경에서 유채의 생육이 촉진되었음이 보고되었다 (Glick 등, 1997). Katiyar와 Goel(2004)은 저온환경에서 PGPR 처리에 의한 식물의 생육촉진이 siderophore와 관련 이 있음을 보고하였다. 본 연구는 저온상태에서 유채의 생육 촉진효과가 우수한 것으로 선발된 PGPR 13-1 균주를 유채 종자에 처리하여 저온에서의 유채의 생육촉진효과를 증명하 였다.
재료 및 방법
미생물 배양 및 보관
시험균주 13-1은 20% glycerol을 포함하는 Tryptic Soy Broth(TSB, Difco)에 희석하여 -80℃에 보관하면서 Tryptic Soy Agar(TSA, Difco) 배지에 28℃에서 24시간 배양하여 실 험에 사용하였다. PGPR 활성검정을 위한 현탁액을 만들기 위 하여 선발된 Burkholderia pyrrocinia 13-1 균주를 TSA 배지 에 도말하여 28℃ 항온기에서 24시간 배양한 후 1 x 107 (cfu/ml) 농도로 희석하여 균 현탁액을 준비하여 사용하였다. 대 조 균주인 C4와 D8 균주는 각각 Bacillus subtilis와 Bacillus cereus로 선발된 PGPR 균주로 본 시험에 공시하였다.
종자처리
유채 종자를 표면살균하기 위하여 1% NaOCl 용액에 5분 간 침지한 후 70% 에탄올에서 1분간 침지하여 소독한 후 멸균 된 증류수로 4-5회 세척하여 건조시킨 후 시험에 사용하였다.
13-1 균주의 현탁액은 1 x 107(cfu/ml) 농도로 희석하였으며 이때 균주 현탁액은 0.3% CMC(carboxy methyl cellulose) 가 되도록 첨가하였다. 표면 살균된 유채 종자를 13-1 균주의 현탁액에 3시간 침지한 후 후 클린벤치 내에서 건조시킨 다
음 시험에 사용하였다.
식물생육촉진 효과
13-1 균주 처리에 의한 유채의 생육촉진 효과를 검정하기 위하여 표면 살균된 유채 종자 2 g을 준비된 13-1균주 현탁 액과 증류수에 각각 3시간 동안 침지한 후 식물배양플레이트 (Plant culture dish, 100 x 40 mm, SPL Lifesciences)에 멸 균된 여과지를 깔고 그 위에 종자를 파종하였다. 시험1에서는 12시간 광 조건으로 25℃/18℃(light/dark condition), 25℃/
12℃, 25℃/3℃의 변온 조건에서, 시험2에서는 25℃/3℃, 20℃/
3℃, 15℃/3℃로 조절된 인공생장실(존샘, JS-FC-145)에서 생장시켰다. 이때 광 조건은 12 hrs / day로 동일하게 하였다.
발아 후 3일째부터 식물의 초장과 뿌리 등 생육생황을 조사 하였다.
Siderophore 검출 시험
13-1 균주의 siderophore 생성을 확인하기 위하여 Chrome Azurol(CAS) Agar 배지를 사용하였으며 푸른색에서 오렌 지색으로의 변화를 통하여 siderophore의 존재여부를 확인하 였다. CAS agar를 만들기 위하여 먼저 60.5 mg의 chrome azurol S 를 50 ml의 증류수에 녹이고 10 ml의 Fe III 용액 (27mg FeCl3.6H2O, 100 ml의 증류수에 83.3 ul의 HCl)을 첨 가한 후 72.9 mg의 hexa decyltrimethyl ammonium bromide (HDTMA)를 40 ml에 녹인 후 첨가하여 CAS 지시용액을 준비하였다. Basal agar 배지를 만들기 위하여 250 ml 플라스 크에 3 g 3-(N-morpholino)propane sulfonic acid(MOPS), 0.05 g NaCl, 0.03 g KH2PO4, 0.01 g NH3Cl, L-asparagine 을 83 ml의 증류수에 녹이고 pH를 6.8로 조정후 총 부피를 88 ml로 하여 1.5% agar를 넣고 멸균하였다. 멸균된 basal agar와 CAS 지시용액과 50% glucose 용액을 50℃로 유지 시키고 서로 혼합한 후 페트리디쉬에 부어 굳힌 다음 시험에 사용하였다. 각각의 시험은 3반복으로 실시하였으며 결과는 JMP 프로그램(SAS Institute, Cary, NC)을 사용하여 유의 치를 비교하였다(LSD, P=0.05).
결과 및 고찰
변온조건에서 13-1 균주 처리에 의한 유채의 생육을 검정 하기 위하여 유채 종자를 13-1 균주 현탁액의 처리하여 시험 한 결과 증류수를 처리한 대조구에 비하여 발아가 촉진되는 것을 관찰할 수 있었다(Fig. 1). 변온 조건 중 야간온도가 1
Fig. 1. Effect of plant growth promotion by selected strain 13-1 on canola plant in diurnal condition (day condition : 12hours at 25℃, night condition : 12 hours at 18℃). Canola was seeded on filter paper with bacterial suspension (1 x 107 cfu/ml).
Table 1. Canola plant growth promotion by seed treatment with selected strain 13-1 in the cold condition
Treatment
25℃/18℃ 25℃/12℃ 25℃/3℃
Plant height (mm)
Root length (mm)
Plant height (mm)
Root length (mm)
Plant height (mm)
Root length (mm)
CON 14.7 36.0 20.3 36.7 23.5 43.3
BTH 14.7 40.6 20.1 36.7 25.8 42.4
13-1 17.9* 53.7* 22.9* 50.6* 26.7* 73.9*
C4 18.9* 43.9* 31.9* 60.7* 27.6* 59.5*
D8 29.1* 48.4* 31.7* 50.9* 22.0* 46.4*
LSD (p=0.05) 2.7 5.3 2.1 3.2 2.8 9.0
*= significantly different (p=0.05) according to Student’s Least Significant Difference (LSD) test.
Table 2. Plant growth promotion of canola seedling by seed treatment with selected strain 13-1 in different cold condition Treatment
25℃/3℃ 20℃/3℃ 15℃/3℃
Plant height (mm)
Root length (mm)
Plant height (mm)
Root length (mm)
Plant height (mm)
Root length (mm)
CON 16.2 33.1 18.6 27.9 22.4 23.9
BTH 17.2 31.7 21.8 25.8 25.6 25.0
13-1 20.8* 40.5* 26.7* 36.4* 28.3* 41.8*
LSD (p=0.05) 2.3 5.5 2.8 5.0 2.8 5.0
*= significantly different (p=0.05) according to Student’s Least Significant Difference (LSD) test.
8℃인 경우와 3℃인 경우 저온생육형인 13-1은 18℃에서 고 온균인 C4, D8균주에 비하여 초장이 떨어지며 뿌리의 길이 도 크게 차이가 나지 않으나 3℃ 저온의 경우 13-1 균주는 고온균보다 초장은 12.6%, 뿌리생장은 16% 증가함을 알 수 있었다(Table 1). 대조처리와 비교하였을 때는 공시한 3개 균주 처리 모두 생육촉진이 인정되었다(Table 1). 최고온도 를 25℃로 고정하고 최저온도를 18℃, 12℃, 3℃로 하였을 때 가장 낮은 온도인 3℃에서 뿌리길이가 가장 차이가 많았 다. 이와 같은 결과는 13-1균주의 저온 정착활성이 공시한 바 실러스균주 보다 우수하기 때문으로 생각되며 이 균주가 갖
는 sidrophore 생성능력과 저온스트레스에 관여하는 유전적 특성이 높기 때문일 것으로 생각된다.
Table 1에서와는 반대로 Table 2에서는 저온조건을 3℃
로 고정하고 낮 시간의 온도를 변화 시켰는데 13-1 균주처리 는 모든 공시 조건에서 초장과 뿌리 발근이 대조처리보다 증 가함을 알 수 있었다(Table 2).
낮 온도가 가장 낮은 15℃에서 뿌리길이가 가장 차이가 많 았다(Table 2, Fig. 3). 세가지 변온조건에 따른 뿌리길이의 차이가 모든 조건에서 비슷하고 보다 저온에서 가장 크게 나 타나는 것으로 보아 13-1 균주 처리에 의한 생육촉진효과가
Fig. 2. The growth promotion of canola seedling by selected strain 13-1 in growth chamber. The growth chamber was controlled three different condition as 12 hour day/night condition (a: 25℃/3℃, b: 20℃/3℃, c: 15℃/3℃) respectively.
Fig. 3. Activities of siderophore formation and phosphate solublization by treatment of a selected PGPR strain 13-1. (a: halo zone on CAS agar, b : halo zone on Pikovskaya medium)
넓은 범위의 온도차이에서도 나타남을 알 수 있었다.
Sun 등은 Pseudomonas putida GR12-2를 유채에 처리하 였을 때 25℃와 5℃에서 유채 뿌리의 길이가 신장되었으며 이는 이 균주가 내한성 단백질을 생산하기 때문이라고 보고 하였다(Sun 등, 1995). Vandana와 Reeta는 Pseudomonas fluorescens ATCC 13525 균주의 돌연변이 균주인 CRPF9 균주를 녹두에 처리하여 25℃와 10℃ 조건에서 생육촉진효과 가 있음을 확인하고 siderophore에 의한 것으로 보고하였다 (Katiyar와 Goel, 2004). Selvakumar 등은 Pantoea dispersa 1A 균주를 밀에 처리하였을 때 15℃와 4℃ 조건에서 생육촉 진효과가 있음을 확인하였으며 이 균주의 인산가용화 능력과 siderophore 생산 그리고 indole acetic acid(IAA)생산과 관 련이 있음을 보고하였다(Selvakumar 등, 2007). 13-1 균주 또한 인산가용화 배지 시험과 siderophore 배지 시험 결과 인 산가용화 능력과 siderophore를 생산하는 것을 확인하였다 (Fig. 3). 이 결과를 통하여 13-1 균주에 의한 유채의 생육촉 진과 관련이 있을 것으로 생각되었다. 또한 우리나라의 경우 유채는 늦가을 벼 수확을 마친 논 토양에 주로 파종되는 월동 작물로 저온기간 동안의 토양 내 미생물 활성 화를 통한 유채 생육 촉진과 내한성 증진에 도움이 될 것으로 생각된다. 본
연구에서 저온 조건에서의 유채의 생육촉진효과의 대한 대사 기작 차원의 연구는 수행하지 않았지만 13-1균주가 가진 생 육촉진, 인산가용화, 시드로포아생산, 항균활성, 발근촉진과 내한성증대 등의 다양한 유용기작 들이 복합적으로 관여할 것으로 추축된다. 따라서 13-1 균주를 이용한 온실 및 포장검 정을 거쳐 저온기 유채 생육촉진용으로 실용화가 가능 할 것 으로 생각된다.
인 / 용 / 문 / 헌
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고활성 근권생육촉진균주 Burkholderia pyrrocinia 13-1에 의한 저온조건에서의 유채생육촉진
이재은 ･ 조상민 ･ 조영은 ･ 박경석*
농촌진흥청 국립농업과학원 농업미생물과
요 약 유채 근권으로 부터 분리된 고활성 근권균 Burkholderia pyrrocinia 13-1는 유채의 생육을 촉진 시키며 특히 저온조 건에서의 식물 생육이 우수하다. 이 균주의 유채 처리는 저온조건에서 뿌리의 발근을 좋게 하며 지상부 생육도 다른 대조 균주 처리 보다 우수하다. 근권미생물이 가지는 유용 기능 중 식물의 영양 흡수와 병 저항성에 관여하는 시드로포어의 생성, 항균활 성,과 토양 중 불용화 인산인 칼슘포스페이트를 가용화시켜 식물의 흡수를 돕는 용해 능력이 우수하였다. 이와 같은 특성은 식물의 생육을 촉진시키는 근권세균의 활성기작으로 식물생육 촉진용으로 유채재배에 적용할 수 있을 것으로 기대된다.
색인어 근권미생물, 생육촉진, 저온조건
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