Colorimetric Based Analysis Using Clustered Superparamagnetic Iron Oxide Nanoparticles for Glucose Detection

학 술 논 문

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클러스터 초상자성체 산화철 나노입자를 이용한 색채학적 해석 기반 당 측정

최원석 · 기재홍*

연세대학교 보건과학대학 의공학과

Colorimetric Based Analysis Using Clustered Superparamagnetic Iron Oxide Nanoparticles for Glucose Detection

Wonseok Choi and Jaehong Key*

Department of Biomedical Engineering, Yonsei University, 1 Yonseidae-gil, Wonju, Gangwon-do, 220-710, Republic of Korea

(Manuscript received 17 November 2020 ; revised 11 December 2020 ; accepted 18 December 2020)

Abstract: Superparamagnetic iron oxide nanoparticles (SPIONs) are approved by the Food and Drug Administration (FDA) in the United States. SPIONs are used in magnetic resonance imaging (MRI) as contrast agents and targeted delivery in nanomedicine using external magnet sources. SPIONs act as an artificial peroxidase (i.e., nanozyme), and these reactions were highly stable in various pH conditions and temperatures. In this study, we report a nanozyme ability of the clustered SPIONs (CSPIONs) synthesized by the oil-in-water (O/W) method and coated with biocom- patible poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA). We hypothesize that the CSPIONs can have high sensitivity toward H

O

derived from the reaction between a fixed amount of glucose and glucose oxidase (GO

). As a result, CSPIONs oxi- dized a 2,2 '-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt (ABTS) commonly used as a substrate for hydrogen peroxidase in the presence of H

O

, leading to a change in the color of the substrate. We also utilized a colorimetric assay at 417 nm using various glucose concentrations from 5 mM to 1.25 μM to validate β-D-glucose detection. This study demonstrated that the absorbance value increases along with increasing the glucose level. The results were highly repeated at concentrations below 5 mM (all standard deviations < 0.03). Moreover, the sensitivity and limit of detection were 1.50 and 5.44 μM, respectively, in which CSPIONs are more responsive to glucose than SPIONs. In conclusion, this study suggests that CSPIONs have the potential to be used for glucose detection in dia- betic patients using a physiological fluid such as ocular, saliva, and urine.

Key words: Clustered iron oxide nanoparticles, Artificial peroxidase, Diabetes, Colorimetric detection

I. 서 론

초상자성체 산화철 나노 입자(superparamagnetic iron oxide nanoparticles, SPIONs) 는 표적화된 약물 전달, T2

MRI 조영제, 그리고 고온 기반 암 파괴 등 의공학 분야에 널리 사용되고 있다[1-7]. 또한 SPIONs는 인조적인 과산화 효 소의 역할을 할 수 있다는 것이 보고되었다. SPIONs의 인 조 효소 역할은 몸에서 발현되는 실제 과산화 효소와 다르게 넓 은 온도 및 산성도(pH)에서 반응이 매우 안정적이며, 비교 적 값싼 비용으로 대량 합성할 수 있다는 장점이 있다[8-9].

최근에는 SPIONs를 이용한 당 계측의 시도도 이루어지고 있다. 당은 당 산화제(glucose oxidase, GO

) 에 의해서 산 화되면서 과산화수소(hydrogen peroxide, H

O

) 를 만들어 낸다. SPIONs는 구체적으로 H

O

가 존재하는 환경에서 과산화 효소에 특이적으로 반응하는 기질인 3,3′,5,5′-tetramethyl-

*Corresponding Author : Jaehong Key

Department of Biomedical Engineering, Yonsei University, 1 Yonseidae-gil, Wonju, Gangwon-do, 220-710, Republic of Korea Tel: +82-33-760-2857

E-mail: [email protected]

본 연구는 한국연구재단이 지원하는 이공분야 기초연구사업(NRF- 2018R1D1A1B07042339), 국제기관간MOU지원사업(NRF- 2019K2A9A2A08000123)과 사회맞춤형 산학협력 선도대학(LINC+) 육성사업으로 수행된 연구결과임.

229 benzidine (TMB) 그리고 2,2′-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-

6-sulfonic acid) diammonium salt (ABTS) 의 색채 변화를 이 끌어낸다. 다양하게 표면이 개질된 SPIONs를 이용한 당 측 정 관련 연구는 학계에 보고되었고[9-12] 간단하면서도 그 절차에 필요한 비용이 저렴하며, 눈으로 그 색의 변화를 직 관적으로 감지할 수 있다는 장점이 있다[13].

최초로 Gao et al.의 연구에서 SPIONs에 존재하는 Fe

가 인조 과산화 효소 역할의 핵심적이다는 것을 발표하였다[8].

YU, Faquan et al. 의 연구에서는 6개의 서로 다른 물질로 개질된 SPIONs를 당 측정 관련 연구에 적용하였고[9], 사 용된 색채 변화 기질의 종류와 개질된 SPIONs의 종류에 따라 결과에 차이가 있음을 보고하였다. 또한 색채 변화 기질과 입자 간 정전기력(electrostatic interaction)을 증진시킴에 따라 더 큰 효소 역할과 민감도를 가진다고 보고하였다. 하지만, SPIONs 나노크리스탈(nanocrystals) 자체의 구조나 표면이 개질된 것이 아닌 SPIONs를 포함하는 형태의 구조체 대한 당 측정의 관한 연구는 많이 진행되지 않았다. 입자의 표면 개질을 포 함하는 나노크리스탈의 형질 전환은 반드시 합성 단계인 핵 생성 및 성장 과정(nucleation and growth stage)에서 이 루어져야 하며, 특히 SPIONs를 포함한 금속 입자의 경우 에는 이 과정이 끝난 시점인 크리스탈 단에서의 형질 전환은 어렵다. SPIONs를 합성하는 대표적인 방법 중 하나인 열 분해(thermal decomposition) 방법은 대량의 균일한 입자를 합 성할 수 있지만, 열분해에 필요한 특정 온도를 정확히 조절 해줘야 하며 특정 리간드(ligand)를 넣어줘야만 특정 형질을 가 지는 입자를 생성할 수 있다[14].

당에 대한 기질의 색체 변화는 SPIONs, H

O

, 그리고 기질 간의 산화/환원의 연속적인 과정(redox activity)을 통한 전 자의 흐름(electron transfer)에 기인한다. 즉, SPIONs의 인조 효 소 역할은 얼마나 효과적인 전자의 흐름을 유도할 수 있는지에 의존적이다. 따라서, 효과적인 전자의 흐름을 유도할 수 있는 나 노 구조체의 합성은 민감한 당 측정 센서가 될 것이라는 가설을 도출할 수 있다. 본 연구에서는, Fe

O

가 Fe

와 Fe

사 이의 전자 전달을 통해 가역적으로 산화/환원 반응이 진행 되는 금속 물질이며[15-17], 이 때문에 우수한 전기전도성을 가 지는 것을 바탕으로[18] 효율적인 전자 흐름을 극대화 할 수 있는 나노 구조체의 합성을 진행하였다. 구체적으로, 개별 SPIONs 에 대한 개별 처리 없이 다공성 성질(porous property) 을 가지는 PLGA라는 폴리머를 통해 물리적으로 가깝게 붙 어있는 클러스터링 나노 구조체(clustered nanoconstructure) 를 개발 하였다. 구형 모양을 가지는 SPIONs는 수많은 Fe

O

로 이루어져 있고, 클러스터화된 SPIONs(clustered SPIONs, CSPIONs) 는 PLGA를 이용하여 SPIONs를 뭉 친 구조를 의미한다. In-vitro 실험을 위하여 실제 당뇨병 환자의 생리적 유동 물질에 포함되어있는 당의 농도로 설계

하였다[19-20]. 1) CSPIONs가 기본적으로 H

O

에 대한 인조 효소 역할을 하는지 평가하였고 2) 그 이후 당과 GO

의 반응물에서 생성되는 H

O

에 대한 효소 역할을 할 수 있는지 평가하였다. 3) 40 μM 이하의 당 농도에서 CSPIONs의 검 출한계와 민감도가 조사되었고 이전에 발표된 문헌의 결과 와 비교하였다[9-11]. 모든 실험은 in-vitro의 색채 변화 기 반 해석으로 이루어졌다.

II. 연구 방법

1. 화학 물질

사용된 재료는 추가적인 정제과정이나 전처리 없이 사용 하였다. Iron oxide nanoparticles (SPIONs, 5 mg/ml, avg size: 10 nm), poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA), β-D-glucose, glucose oxidase (GO

, from Aspergillus niger), L-Ascorbic acid, TraceCERT Iron Standard for ICP, hydrogen peroxide solution, sodium acetate, and ferene-s 0.5 M 은 Sigma- Aldrich CO. Ltd. (St.Louis, MO, USA) 에서 구입하였다.

2,2'-azino-bis (3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt (ABTS) 는 TCI Co. Ltd. (Tokyo, Japan)에 서 구입하였다. Acetic acid glacial는 Fisher Science (Massachusetts, USA) 에서 구입하였다. Acetonitrile은 Honeywell CO. Ltd. (North Carolina, USA) 에서 구입하 였다.

2. 클러스터 초상자성체 산화철 나노입자의 합성

CSPIONs 는 상향식(bottom-up) 및 물 안의 기름(oil-in- water, O/W) 방법으로 합성하였다. 3 mL의 증류수, 500 μg의 SPIONs (5 mg/ml, in toluene), 그리고 100 μg의 PLGA (1 mg/ml, in acetonitrile) 가 합성에 사용되었다. 유기용매에 녹아있는 PLGA와 SPIONs를 증류수가 포함된 바이알에 drop-wise 방법으로 순차대로 첨가하였다. 그 후, 물리적 고 에너지원인 vortexing과 sonication를 거쳐 용액을 균질화 시켰다. 반응물에 교자를 넣은 후 6시간, 400 RPM으로 교 자판(PC-420D, Corning, USA)에서 균질하게 섞어주었다. 유 기용매가 충분히 날라간 후 반응물을 2,700 RPM에서 10 분 원심분리하여 상층액을 조심스럽게 모았다. 상층액을 다 시 13,500 RPM으로 10분 원심분리하여 침전된 CSPIONs를 얻어내었다.

3. CSPIONs 내의 SPIONs의 정량

구조체 내 SPIONs를 정량하기 위해서 ferene-s assay가 사

용되었다. 이 방법은 대표적인 정량 방법인 유도 결합 플라

즈마 질량 분석법(inductively coupled plasma mass

spectrometer, ICP-MS) 과의 비교했을 때도 합리적인 것으

230

로 여겨진다[21-23]. 2 M의 acetate buffer (pH=4)에 2.27 mM 의 L-ascorbic acid, 12 mM의 ferene-s, 그리고 증류 수를 넣어 총 10 mL의 1x working 용액을 만든다. SPIONs 의 교정 곡선(standard curve)은 TraceCERT Iron Standard for ICP 용액을 이용하여 0부터 4 μg까지로 그 범위를 설 정하였다. 현탁액 상태의 2 μL의 CSPIONs과 48 μL의 증 류수로 이루어진 희석된 50 μL의 샘플 용액을 950 μL의 1x working 용액과 섞은 후, 96 well plate에 300 μL씩 세 well 에 분주하였다. 이것의 평균을 CSPIONs의 광밀도로 간주하였다. 20시간 동안 37

C 에서 용액을 반응시킨 후 595 nm 에서 광밀도(optical density)를 측정하였다. SPIONs의 교정 곡선에 따른 역추정된 CSPIONs의 농도를 구할 수 있다.

4. CSPIONs의 특징 분석

CSPIONs 의 크기, 제타 포텐셜, 그리고 그 모양 파악이 이루어졌다. 990 μL의 증류수와 10 μL의 샘플을 포함한 총 1 mL 부피(100 : 1 = deionized water : CSPIONs)를 크기 (DTS0012, Malvern Panalytical Ltd, UK) 및 제타 큐벳 (DTS1070, Malvern Panalytical Ltd, UK) 에 넣어 측정 하였다. 분석은 Zetasizer (ZS90, Malvern Panalytical Ltd, UK) 를 통해 이루어졌다. CSPIONs의 형상 파악에는 Cs-corrected STEM (JEM-ARM 200F, JEOL, USA) 를 이용한 TEM 이미징이 진행되었다.

5. CSPIONs의 인조 과산화 효소 역할 평가

CSPIONs 의 인조 과산화 효소 역할을 평가하기 위해서, H

O

가 존재하는 환경에서 ABTS assay가 진행되었다.

60 mM 의 ABTS 24 μL, 0.2 M acetate buffer (pH=4) 185 μL, 그리고 서로 다른 CSPIONs의 양(10, 20, 40 μg) 이 해당 실험에 사용되었다. H

O

는 100 mM부터 0.7813 mM 까지 절반씩 희석하였다. 언급된 모든 물질을 튜브에 섞은 후 10분간 45

C에서 반응하였다. 그 후, 13,500 RPM의 원심분리를 통해 침전된 CSPIONs를 제거 후 상층액을 300 μL 씩 나누어 평균 흡광도를 측정하였다.

6. CSPIONs의 당 측정

CSPIONs 의 인조 과산화 효소 역할의 실험과 유사하게, 해당 실험도 또한 ABTS를 이용한 assay로 진행되었다. 10 mg/ml 의 GOx 40 μL, 4 mM의 ABTS 360 μL, 그리고 50 μg의 CSPIONs 를 서로 다른 β-D-glucose 농도를 가지는 용액에 첨가하였다. β-D-glucose는 5 mM부터 0.078125 mM까지 희석되었고 45분간 45

C 에서 반응하였다. 그 후, 13,500 RPM 에서 원심분리하여 침전된 CSPIONs를 제거하였고 상 층액을 분석하였다.

7. CSPIONs의 검출한계와 민감도 측정

CSPIONs 의 검출한계와 민감도는 40 μM 이하의 당 농 도에서 조사되었다. 당은 40 μM부터 1.25 μM까지 절반씩 희석되었고 417 nm에서 분석되었다. 검출한계와 민감도를 구하기 위해서 아래 식 (1)과 식 (2)를 이용하였다.

Limit of Detection (LOD) =

(1) Glucose Sensitivity =

≈ Coefficient of Regressed 1st function (2)

III. 연구 결과

1. CSPIONs의 합성과 그 특징 분석에 관한 결과

우리는 O/W 방법을 통해 SPIONs를 클러스터링하였고 일련의 과정은 그림 1에 도시되어 있다. SPIONs는 매우 큰 소수성 물질(highly hydrophobic material)이기 때문에 이 를 수용액 상태에서 균일한 입자의 모양과 크기로 클러스터 링하기 위해서는 외부의 강한 물리적인 힘을 통한 균질화 (emulsified) 가 필요하다. 본 연구에서는 SPIONs가 포함 된 용액에 vortexing 및 sonication를 통해 균질화하였다.

구체적으로, PLGA는 양친매성(amphiphilic)을 띄기 때문 에 강한 소수성 물질인 SPIONs과 같이 물이 풍부한 환경 에 첨가하여 물리적인 균질화를 거치면 PLGA 내 SPIONs 가 캡슐화되는 구조체를 합성할 수 있다.

CSPIONs 의 특징 분석은 그림 2에 도시되어 있다. 합성 된 CSPIONs는 균일한 크기를 가졌으며(PDI=0.124) 평균 크기 및 제타 포텐셜은 각각 120.1 nm 그리고 –61.7 mV로 나 3 × Standard Deviation of y − intercepts of Regression Line

Corresponding Slope of Regression Line

△Absorbance

△Glucose Concentration

그림 1. 클러스터화된 초상자성체 산화철 나노 입자의 합성에 대한

개략도 Fig. 1. The schematic illustration of the synthesis process of

clustered superparamagnetic iron oxide nanoparticles (CSPIONs)

타났다(n=3, 그림 2a). 투과 전자 현미경(transmission 231 electron microscopy, TEM) 이미지는 합성된 CSPIONs가 구 형 모양을 가지며, PLGA 내부에서 클러스터링화 된 것을 뒷받침한다(그림 2b). SPIONs의 인조 과산화 효소는 얼마 나 많은 Fe

이 존재하는가와 관련이 있으므로 합성된 입자의 철 이온의 양을 정량화할 필요가 있다[8]. CSPIONs의 철 이온을 정량하기 위해, ferene-s assay가 수행되었고 결과는 그 림 2c에 도시되었다. 이는 구조체 내 철 이온을 빠르고 쉽 게 정량할 수 있는 것으로 알려져 있다[21-23]. 대표적인 교 정 곡선은 y = 0.4671x + 0.0649 (R

= 0.996) 로 일차회귀 되었다. x축과 y축은 각각 Fe의 농도, 그리고 흡광 값을 나 타낸다. 역추정하여 얻어진 SPIONs의 양은 100.73 μg/μL 로, 질량과 부피의 비가 일정한 것으로 나타났다. 합성에 있 어 500 μg의 SPIONs를 사용하였기 때문에 약 20% 정도 의 SPIONs가 PLGA 폴리머 구조체 내 클러스터화 됐다 는 것을 알 수 있다. 위에 언급한 대로, SPIONs는 매우 소 수성이므로 합성이 진행되는 단계에서 사용된 바이알의 표 면에 달라붙었다. Ferene-s assay는 입자가 합성될 때마다 구조체 내 SPIONs의 양을 파악하기 위해 매번 수행되었다.

2. CSPIONs의 인조 과산화 효소 역할에 관한 결과 PLGA 폴리머에 SPIONs가 클러스터화되더라도 인조 과 산화 효소의 역할을 잃지 않는다는 것을 검증하기 위해, Fenton

reaction 을 기반으로 한 기질의 산화 정도를 측정하였다. Fenton reaction 은 H

O

를 수산기를 포함하는 자유 라디칼 형태로 변환하는 촉매 반응으로 식 (3) 과 그림 3a에 도시되어 있다.

Fe

+ + O

→ Fe

+ + O

Fe

+ + H

O

→ Fe

+ + OH

+ OH

(3) H

O

가 존재하는 환경에서 CSPIONs의 양에 따른 산화 된 ABTS의 정도를 나타내는 assay 결과가 그림 3b에 도 시되어 있다. H

O

의 양이 증가함에 따라 전 실험군에서 흡 광도가 증가하였으며, 100 mM 부근에서 포화되었다. CSPIONs 의 양이 증가함에 따라 흡광도-[H

O

] 그래프가 위로 이동 하였고, 이는 같은 시간대에서 H

O

와 더 빠른 촉매 반응 으로 인해 색채 변화 기질이 빠르게 산화되었다는 것을 의 미한다. 즉, 합성된 CSPIONs를 과산화 효소로 생각한다면, 고 정된 색채 변화 기질에 대해 효소의 양이 증가하였으므로 반응 속도가 증가했다는 해석이 가능하다. 이 결과는 SPIONs 가 PLGA 기반의 폴리머에 감싸져 있는 형태의 디 자인인 CSPIONs에서도 인조 과산화 효소 역할을 수행할 수 있음을 보인 것이다.

3. 당에서 유래된 H

O

에 대한 CSPIONs의 인조 과산화 효소 역 할에 관한 결과

CSPIONs 가 간접적으로 당을 측정할 수 있는지 검증하기 위

그림 2. 클러스터화된 초상자성체 산화철 나노입자의 (a) 크기와 제타포텐셜, (b) 투과 전자 현미경 사진, 그리고 (c) ferene-s 에세이 결과

Fig. 2. The characterization of CSPIONs for (a) size and zeta-potential, (b) transmission electron microscopy image, and (c)

ferene-s assay results

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해, 다른 농도의 당에서 기질인 ABTS가 산화된 정도의 결 과가 그림 4에 도시되어 있다. 구체적으로, SPIONs 자체가 당을 측정할 수 있는 기전은 존재하지 않으므로 우리는 당과 GO

가 반응하여 생성된 H

O

를 간접적으로 측정하는 것으로 실험을 설계하였다. 그림 4에서 당의 농도가 증가함에 따라 함께 흡광도가 증가한 것을 알 수 있다. 또한 5 mM 이하의 실 험군 사이에서는 육안으로도 기질의 색채 변화가 있음을 확 인할 수 있었다. 또한 전 실험군에서의 표준 편차가 0.03 미

만으로, 굉장히 반복적으로 결과가 도시된 것을 알 수 있다.

4. CSPIONs의 당에 대한 검출한계와 민감도 조사 그리고 기 존 문헌의 SPIONs과의 비교

CSPIONs 의 당에 대한 검출한계와 민감도는 그림 5에 도 시되어 있다. 40 μM 이하의 농도에서 당 농도와 흡광도는 선형 회귀 되었다. 회귀식의 y 절편에 3을 곱한 후 회귀식 의 기울기로 나눠주면 이는 CSPIONs의 당에 대한 검출한 그림 3. 클러스터화된 초상자성체 산화철 나노입자의 (a) 인조 과산화 효소 기전과 (b) 질량에 따른 과산화 효소 결과

Fig. 3. The (a) artificial peroxidase mechanism of the CSPIONs and (b) peroxidase results depending on the CSPIONs’ mass

그림 4. 클러스터화된 초상자성체 산화철 나노입자의 당에서 유래된 과산화수소에 대한 인조과산화 효소 역할 평가

Fig. 4. The analysis of artificial peroxidase activity of H

O

derived from the reaction between glucose and GOx

그림 5. 클러스터화된 초상자성체 산화철 나노입자의 당에 대한 검 출한계 및 민감도에 대한 조사

Fig. 5. The investigation of the limit of detection (LOD) and sensitivity of CPSIONs toward to glucose

표 1. 초상자성체 산화철 나노입자의 인조 과산화 효소 Table 1. The artificial peroxidase in SPIONs

Nanoparticles Sensitivity Limit of Detection Substrate [SPIONs]

Glycine-coated SPIONs [9] 1.251 8.5 µmol/L ABTS 325 µg

Heparin-coated SPIONs [9] 0.910 15.8 µmol/L ABTS 325 µg

GOx-IONPs cellulose SPIONs [10] 1.1304 83 µmol/L ABTS None

Citrate-coated SPIONs [11] None 50 µmol/L TMB 30 µg

Clustered SPIONs (CSPIONs) 1.50287 5.44 µmol/L ABTS 50 µg

233 계로 이해할 수 있다. 검출한계는 5.44 μM로 나타났다. 회

귀식의 기울기는 당의 농도 변화에 따른 흡광도 변화이므로, 이 를 당에 대한 민감도로 기술할 수 있다. 민감도는 1.50으로 나타났다.

본 연구에서 합성된 CSPIONs와 기존 문헌에서 당 측정에 이 용된 SPIONs과의 검출한계와 민감도가 표 1에서 비교되 었다. CSPIONs는 6.5배의 더 적은 SPIONs의 양을 사용 했음에도 불구하고 더 나은 당에 대한 민감도와 검출한계를 보였다.

IV. 고찰 및 결론

본 연구는 SPIONs를 클러스터 형태로 만든 CSPIONs를 당 측정에 적용하여 평가하였다. 그 결과, 클러스터링을 위 해 양친매성 PLGA 폴리머에 SPIONs을 캡슐화 하더라도 CSPIONs 의 H

O

에 대한 인조 과산화 효소 역할을 잃지 않음을 보였다. 5 mM 이하의 당 농도에서도 표준 편차가 0.03 미만으로, 결과값이 반복적으로 도출되었다. 또한, 설 정한 당 농도는 침, 안액, 그리고 소변 등에서 존재하는 농 도로 피에 존재하는 당의 농도와 비교했을 때 매우 소량이 다. 구체적으로, 정상인의 경우 정상상태의 피에서는 4.44

~ 6.66 mM 의 당 몰농도가 존재한다[24]. 피를 제외한 생 리적 유동 물질에는 0.008 ~ 5.5 mM의 범위에서의 상대 적으로 적은 농도의 당이 포함되어있다. 본 연구에서는 해 당 넓은 당 범위에서의 색채 변화 실험을 진행하였고, 눈으 로 당의 농도를 직관적으로 구분할 수 있음을 보였다. 이러 한 결과는 직관적인 색채 변화로 소량의 당의 차이를 확인 할 수 있다는 것을 의미하여 이는 피를 제외한 생리적 유동 물질을 이용한 비침습적 체외 진단기로서의 CSPIONs의 사 용 가능성을 기대하게 한다.

본 실험 설계에 참조 논문이 된 6개의 다른 물질로 코팅 된 SPIONs의 인조 과산화 효소의 관련 연구와의 직접 비 교를 통해서 CSPIONs는 SPIONs에 비해 당에 대한 민감 도가 더 높았으며, 검출한계는 낮음을 확인하였다[9]. 흥미 롭게도, 본 연구에서 합성된 CSPIONs의 제타 포텐셜은 -61.7 mV 로, 두 개의 설폰산 그룹(sulfonic acid group)을 가져 음전하를 띄는 ABTS 기질에도 반응성이 좋은 것을 확 인하였다. 앞서 SPIONs와 기질 간의 반응성을 증가시키기 위해서는 정전기력 관점에서의 입자 개질 및 기질 사용이 필요하다고 언급한 바 있다[9]. 해당 결과는 정전기적으로 서로 다른 전하를 띄지 않더라도 클러스터링된 산화철 나노 입자가 기질에 대한 친화도(affinity)가 높아, ABTS에 대 한 반응 속도(reaction velocity)가 커졌다고 해석할 수 있 다. 40 μM 이하의 당 농도에서도 색채 기질의 흡광도의 표 준 편차가 참조된 것에 비해 작았고, 반복적으로 도시되었

다. 이는 극소량으로 포함된 당을 충분히 계측할 수 있다는 강점으로 해석할 수 있다. SPIONs가 사용된 경우에 비해 6.5 배 적게 사용되었음에도 불구하고 더 좋은 민감도와 검 출 한계를 가졌다. 이는 반응물 속의 인조 효소의 양 자체 가 줄었음에도 불구하고 더 많은 기질을 산화시킨 것을 의 미한다. 해당 결과는 금속 크리스탈 단의 개질 뿐만 아니라 이를 포함하는 구조체의 개질이 당 측정에 영향을 미칠 수 있다는 점을 시사한다.

크리스탈 단에서의 SPIONs의 모양 차이에 따라 인조 과 산화 효소 역할이 바뀐다는 것이 보고되어 있다[25]. Zhou et al. 의 연구에 따르면 해당 촉매 반응에 필요한 선호되는 크리스탈 면(preferential crystal plane)이 반응물과 노출 되었을 때 과정이 더 잘 일어난다고 밝혔다[26]. 하지만, 선 호 크리스탈 면은 크리스탈의 핵 생성 및 성장 과정에서 단 일 입자 내에서 결정되는 것이므로, 이는 클러스터의 형태 가 증진된 당 측정을 이끌었다는 근거는 되지 못한다. H

O

의 평균 직경 크기는 0.25 ~ 0.28 nm[27], 그리고 PLGA로 구성된 나노입자의 평균 공성 크기(pore size)는 9.65 nm[28]로서 CSPIONs 내/외부로 H

O

의 이동이 가능하나, PLGA 폴 리머로 일차적으로 감싸져있는 구조이기 때문에 직접적인 H

O

과의 반응 확률이 커져 해당 결과를 얻었다고 해석하 기 또한 부적절하다.

다른 문헌에 따르면, 금속 산화물 기반의 산화 환원 반응

성질은 얼마나 많은 양의 산소 빈자리(oxygen vacancies)

가 존재하는지에 의존적이라 밝혀져있다. 대표적으로 언급

되는 금속 물질에는 세륨 산화물 나노입자(cerium oxide

nanoparticles) 가 있다. 세륨 산화물의 Ce

와 Ce

간 환원

전위(low reduction potential)는 1.52 V 미만의 낮은 값을 가

지고 있어, 서로간 변환이 자유로워 활성 산소종(reactive

oxygen species, ROS) 의 제거에 사용되어 왔다[29-30]. 그

중, Ce

의 전자 구성은 [Xe]4f

으로 전자 결함(charge

deficiency)이 있는 상태로서 이를 안정화 하는 과정에서 산

소 빈자리가 생성되게 된다. 이 빈자리에서 산화/환원이 강

하게 일어나며, 나노입자 자체의 크기가 커짐에 따라 이 빈

자리의 농도가 감소한다고 알려져 있다[29]. 이러한 관점에

서 해석해볼 때, 본 연구에서 합성한 CSPIONs는 평균 120

nm 의 크기를 가지는 하나의 인조 효소가 아닌 H

O

에 대

한 반응성이 있는 작은 10 nm SPIONs가 뭉쳐진 하나의

큰 인조효소를 만들었다고 할 수 있다. 또한, 금속 산화물에

서의 산화/환원 과정은 물질의 표면 혹은 표면에 가까운 곳의

격자 산소 원자(lattice oxygen atom)에서 주로 일어난다

[31-32]. 이는 Mars-van Krevelen (MvK) 기전으로 알려

져있다[31]. 즉, 물리적으로 매우 가깝게 붙어 있는 CSPIONs의

경우, 반응한 SPION의 산화/환원에 따른 전자 흐름이 주

위 인접한 SPIONs들에 영향을 줄 수 있다고 기대된다. 그

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리고 이것이 증진된 기질의 색채 변화를 이끌었다고 추측된 다. 하지만 보다 구체적인 기전 연구가 필요하다.

결론적으로 본 연구에서 보고한 CSPIONs의 당 측정 기 능에 대한 보고를 바탕으로, 구체적인 기전을 포함한 실제 생체 유동 물질에서의 계측 연구가 진행될 계획이다.

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