Analytical Method Development of Cholic Acid in Human Plasma and Gall Bladder Bile by Ultra Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

DOI 10.17480/psk.2019.63.6.351

초고성능액체크로마토그래피-탠덤매스에 의한 혈장과 담즙 중 콜릭산의 정량 분석에 관한 연구

나승훈·윤혜란^#

덕성여자대학교 약학대학 생의약분석실

Analytical Method Development of Cholic Acid in Human Plasma and Gall Bladder Bile by Ultra Performance Liquid

Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

Seonghoon Na and Hye-Ran Yoon^#

College of Pharmacy, Duksung Women’s University

(Received September 27, 2019; Revised November 12, 2019; Accepted November 22, 2019)

Abstract Bile acids are increasingly appreciated as bioactive molecules and important end products of cholesterol metabolism. While they have been identified as key factors in lipid emulsification and absorption due to their detergent properties. bile acids have also been shown to act as signaling molecules and intermediates between the host and the gut microbiota. To investigate bile acid functions in humans, an advanced platform for high throughput analysis is essential.

Herein, we developed the analytical method of cholic acids following simple one step protein precipitation from biological sample by UPLC-MS/MS. MRM ions was m/z=407.2 for cholic acid. The R² of calibration curves provided 0.9995 in the calibration range of 0.005~5 µg/mL. The quantification system was validated with excellent sensitivity that allows quantitative targeted analyses of bile acids. The LOD (0.001 µg/mL), LOQ (0.005 µg/mL), recoveries (96.8~101.3%±

2.7~4.0%) on intra-day assay, and (98.4~111.0%±2.3~3.4%) on inter-day assay achieved resonable validated data for bile acids analyses. The developed method was applied for drawing plasma and bile acid profile in both normal and disease status. Our study is characterized by rapid and simple sample preparation as well as successful application to plasma and bile. These results could be usable for routine diagnostic monitoring of bile acids on human biofluids.

Keywords bile acids, cholic acid, stable isotope, deproteinization, UPLC-MS/MS, plasma, gall bladder

서 론(Introduction)

담즙산(bile acid)은 담즙을 구성하는 주요 유기물질로서 간세 포에서 지용성 콜레스테롤의 모핵에 수용성 수산화기가 결합되 어 양극성(amphipathic) 구조를 가진다. 이 때 수산화기가 붙는 위치에 따라 용해도와 소수성(hydrophobicity)에 영향을 주어 담 즙산 수용체에 대한 친화력은 달라지게 되고 그 경과 생리적, 약리적 활성에서 중요한 차이가 나타난다.

담즙산은 지난 수십 년간 많은 연구들을 통해 계면활성제로 서 소화작용에 관여할뿐만 아니라 세포막과 핵에 존재하는 여 러 수용체에 결합하여 포도당과 지방 등의 에너지 대사와 콜레 스테롤의 항상성 유지, 염증조절 및 면역체계에 관여하는 등 다

양한 신호전달 호르몬으로서 작용을 하는 것으로 보고되었다.

또한 대사질환은 전세계적으로 유병률이 증가하면서 그 중요성 이 커지고 있는데 이에 따라 담즙산과 그 수용체를 통한 대사 조절 작용의 역할은 대사질환 치료에 있어서 중요한 표적물질 로 주목받고 있다.

당뇨, 비만 그리고 천식과 같은 질환은 대사 작용과 면역 체 계에 영향을 줌으로써 장내 세균의 조성과 기능적인 변화를 통 해 효소 활성을 초래하여 담즙산의 프로파일이 달라지는 것으 로 보고되었다.

쓸개와 관련된 질환, 에너지 합성의 방해, 간으 로부터 분비, 장내 흡수와 같은 활동은 다양한 생체액에서 담즙 산의 구성에 영향을 준다.

천식환자의 경우, 건강한 대조군 과 구별됨과 동시에 염증 및 면역 경로에 있어서 차별적인 활 성화을 통해 독특한 혈장 대사체를 가지며 담즙산의 종류별 농 도에 영향을 준다.

알러지성 천식을 가진 쥐의 폐 대사 변화 를 정상군과 비교해 보면 스테롤 대사에 영향을 주어 콜레스테 롤과 콜릭산을 감소시킨다는 보고가 있다.

콜릭산을 합성하는 3β-hydroxy-Δ5-C27-steroid oxidoreductase (3β-HSD)와 Δ4-3-oxosteroid

#

Corresponding author

Hye-Ran Yoon, College of Pharmacy, Duksung Women’s University, Samyangro-144 gil 33, Dobong-gu, Seoul 01369, South Korea Tel: +82-2-901-8387, Fax: +82-2-901-8386

E-mail: [email protected]

5β-reductase (Δ4-3-oxo-R) 효소의 결함을 가진 15명의 어린이들 에게 콜릭산 경구투여 치료를 통해 알파-페토프로테인, 프로트 롬빈, 알부민, 담즙산, 지용성 비타민의 혈액 내 수치가 모든 환 자에게서 정상화되었고 간경병증이 크게 호전 되었다는 연구가 보고되었다.

따라서 담즙산의 분석을 통해 간과 장의 기능을 확인하고 콜레스테롤, 간암과 같은 관련 질환을 진단할 수 있으 며, 1차 담즙산 중 하나인 콜릭산은 대사질환에 대한 중요한 표 적의 역할이 될 수 있음을 확인할 수 있었다. 그러나 생체시료 의 복잡한 성분들과 담즙산의 낮은 농도 때문에 이를 분석하는 것은 기술적인 어려움이 따른다.

기존에 담즙산은 GC-MS,

LC-MS/MS,

UPLC-MS/

MS,

LC-MS-QOrbitrap,

LC-MS-QTOF,

NMR

을 통해 분석되었으며 최근에는 UV와 비교하여 더 높은 선택성과 낮은 검출한계를 가지는 질량분석기(mass spectrometry)를 사용 한 연구가 많이 보고되고 있다.

GC-MS 의 경우, 가수분해와 휘발성을 가질 수 있게 유도체화 를 시키는 전처리 방법이 필요하며 LC-MS/MS의 경우에도 고 체상 추출

과 숯을 이용한 추출

과 제단백, 건조, 농 축과 같은 전처리법이 주로 사용되고 있다.

본 연구에서는 가수분해, 유도체화 그리고 다양한 추출법없이 설포살리실산을 이용한 단백질 제거 후 여과 과정을 거친 후 분 석용 바이알로 옮겨 UPLC-MS/MS에 주입하는 매우 간편한 전 처리 방법을 통해 콜릭산을 분석하였다. 또한 간단한 전처리 과 정에도 불구하고 UPLC-MS/MS의 장점을 이용하여 10

이하의 낮은 농도에서도 콜릭산의 검출과 정량이 가능하였다.

실험방법 (Experimental Method)

시약 및 기기

콜릭산 표준품은 Alfa Aesar사(MA, USA)로부터 구입하여 사 용하였다(Fig. 1). 내부표준액으로는 cholic-2,2,4,4-d4-acid(이하 cholic acid-d

)를 CDN사(Quebec, CANADA)에서 공급받았다.

HPLC급 시약인 용매 및 이동상인 메탄올, 아세토니트릴, 암모 니움 아세테이트는 J.T. Baker (NJ, USA) 및 Samchun (Pyeong- taek, Korea) 에서 구입하여 사용하였다. 혈장의 제단백 과정에는 설포살리실산은 Kim&friends (Seoul, Korea)사로부터 구입하여 사용하였다.

혈장 시료 분석에 사용한 ESI-MS/MS로는 Shimadzu사(Kyoto, Japan) 의 LCMS-8040 triple quadrupole 모델을 사용하였으며, UPLC 및 펌프는 동사의 Nexera X2 LC-30AD 모델과 함께 SIL- 30AC autosampler 를 사용하였다.

혈장 검체의 채취와 시료 전처리

본 연구에 사용된 모든 통합혈장은 14명의 정상혈장으로부터 조제되었다. 따로 단일혈장은 2명의 정상혈장과 2명의 천식환자 혈장을 준비하였다. 혈장은 한양대학교 의과대학에서 IRB승인 (IRB # HYI-18-227-1) 을 받은 후 제공 받았으며 폴리에틸렌 튜

브의 검체는 받은 즉시 −20ºC에서 보관하였다.

시료 전처리를 위해서 1.5 mL 에펜도르프 튜브에 혈장 200 µL와 설포살리실산 200 µL를 가한 후 30초간 vortex mix를 하 였다. 이 액을 10분간 원심분리(13,000 rpm)하여 제단백 하였다.

상층액을 시린지 필터(0.2 µM)로 여과하여 1.5 mL 에펜도르프에 옮겨 냉장 보관하였다.

혈장 중 콜릭산 정량

표준용액 제조: 상온에서 보관된 콜릭산 표준품을 메탄올에 녹여 농도를 1 mg/mL로 조제하여 저장용 용액으로써 냉장 보관 하였다. 이 용액을 메탄올로 희석하여 농도를 0.1, 0.4, 1, 2, 4, 10, 40, 100 µg/mL 로 조제하여 냉장 보관하였다. 냉장 보관된 내 부표준품(cholic acid-d

) 을 메탄올에 녹여 stock 용액은 농도를 1 mg/mL로 조제하였고, working 용액은 메탄올로 희석하여 농도 를 10 µg/mL로 만들어 사용하였다.

검량선 작성: 실험용 표준액은 전처리 된 혈장으로 희석하여 최종용액 100 µL 중 콜릭산의 농도가 각각 0.005, 0.02, 0.05, 0.1, 0.2, 0.5, 2 및 5 µg/mL가 되도록 조제하였고, 내부표준액(0.5 µg/

mL)을 첨가하여 검량선의 용액을 조제하였다. 서로 다른 8개의 콜릭산 농도가 되도록 혈장 90 µL와 내부표준물질인 cholic acid- d

5 µL를 가하여 최종부피를 100 µL로 하였다. 이 액을 vortex mix 로 1분간 잘 섞은 후 autosampler용 유리 바이알에 옮겼다.

이 중 10 µL를 주입하여 ESI-MS/MS로 분석하였다. 여기서 얻 은 내부표준물질의 피크면적에 대한 콜릭산의 피크 면적비를 가 지고 검량선을 작성하였다.

ESI-MS/MS 분석조건: 위와 같이 전처리 된 혈장 시료 중 콜 릭산 분석은 다음 조건에서 분석되었다. 이동상 A는 0.5 mM ammonium acetate 와 초순수 증류수를 사용했고, 이동상 B는 메 탄올/아세토니트릴(1:1, v/v)를 35% 농도로부터 85% 농도까지의 농도 구배조건을 사용하였다. 칼럼은 Kinetex C18 칼럼(50 mm

×2.1 mm, 2.6 µm, Phenomenex 사 CA, USA)을 사용하였으며, 유 속은 0.4 mL/min이었고, 충돌 가스로는 초고순도 질소를 사용하 였다. 칼럼 온도는 40ºC였고 정량을 위해 MRM scan mode로 분 석을 하였다. 이를 위한 모이온과 딸이온 두 이온을 정량이온으 로 선택하여 정량하였고 데이터는 Lab solution (Shimadzu, Japan) 을 이용하여 수집하였다.

콜릭산 분석을 위한 최적의 MS/MS조건은 Interface voltage- 4.5 kV, Nebulizer gas (N

) flow 1.5 L/min, Drying gas flow 15 L/min, Dissolution line temperature 250ºC, heatblock temperature (N

) 400ºC, collision-induced dissociateon gas (Argon gas) 230 Kpa, Detector voltage-2.04 kV에서 MRM mode를 이용하여 콜릭 산를 정량하여 나타내었다(Fig. 2).

밸리데이션: US Food and Drug Administration (FDA) 밸리데

이션 지침서를 따라서 검증되었다. 분석물질의 검출한계는 S/N

비가 3 이상이 되는 농도를 결정하였고, 분석물질의 검량한계는 S/N 비가 10 이상이 되는 농도로 결정되었다.

일내 분석(intra-day assay) 및 일간 분석(intra-day assay)에 대 한에 대한 정확도는 저농도(0.05 µg/mL), 중농도(0.2 µg/mL), 고 농도(2 µg/mL)를 사용하여 다음의 식으로 측정하였다.

[measured concentration]/[apparent concentration]×100%

정밀도는 혼주 혈장에 표준용액을 첨가하여 측정하였고 변동 계수로서 표현하였다.

결 과(Results)

본 연구에서는 혈장 중 콜릭산을 ESI-MS/MS의 음이온 MRM scan 모드를 사용하여 분석하는 새로운 정량법을 개발하였다. 콜 릭산을 스캔하여 Table 1과 같이 특징적인 이온을 볼 수 있었으 며, 확인된 두 이온 m/z=407.20, m/z=407.25를 이용하여 한 개 의 이온은 확인이온, 또 다른 이온은 정량이온으로 선택하였으 며 MRM 모드를 이용하여 매우 감도높게 콜릭산을 정량 분석 하였다. 콜릭산과 cholic acid-d

의 precursor ion/product ion쌍은 [M-H]

로 각 각 m/z=407.20/407.25, m/z=411.40/411.40의 동일한

product ion 이면서 강도가 매우 강한 두 이온을 모니터링 하였 다(Table 1).

콜릭산 표준품을 첨가한 통합 혈장시료의 농도를 희석하여 3 회 반복 측정하였을 때 콜릭산의 피크는 3분대로 매우 빠른 머 무름 시간을 보였다. 검량선의 직선성은 0.005~5.0 µg/mL 범위 내에서 y=1.623x+0.1034이었고 R

=0.9995로 매우 양호한 결과를 보였다(Table 2).

분석법에 대한 정밀도와 정확도를 얻기 위하여 3가지 다른 농 도의 표준품을 혈장에 첨가하여 회수율을 얻어서 정밀도와 정 확도를 수행하였다(n=3). 일내 정밀도는 2.7~4.0%, 일내 정확도 는 96.8~101.3%이며, 일간 정밀도는 2.7~3.4%, 정확도는 98.4~

111.0% 이내로 매우 양호한 결과를 보였다. 본 연구의 결과를 통하여 새로 개발한 UPLC-MS/MS 분석법은 콜릭산의 정성 및 정량에 적합함을 확인하였다(Table 3, 4).

혈장과 담즙산 중 콜릭산의 정량

콜릭산(pKa=4.98)은 암모늄아세테이트를 이동상으로 pH를 조

절하여 약물의 비이온화형(HA)과 이온화형(A)의 비를 이용하여

최상의 분리를 위하여, C18 RP column을 고정상을 사용하여 방

해물질없이 잘 분리되었다. Fig. 2는 본 연구에서 제시한 전처

Fig. 1. Chemical structure (A), spectrum (B) and metabolism (C) of Cholic acid.

리법으로 시료를 처리하여 UPLC-MS/MS로 분석하였을 때 얻어 진 크로마토그램들이다. 콜릭산의 머무름 시간은 3.011분으로 매 우 신속하게 혈장 중의 다른 성분들로부터 완전히 잘 분리됨을 확인하였다.

Fig. 2. LC-MS/MS MRM chromatogram of cholic acid on plasma matrix; blank (TIC) (A), internal standard in blank (TIC) (B), standard (TIC) (C), normal woman (D), normal man (E), asthma woman (F) and asthma man (G).

Table 1. Characteristics for the cholic acid in the quantification method

Compounds F.W [M-H]

(m/z) QI, CI (m/z) cholic acid 408.57 407.20 407.25, 408.28

Table 2. Calibration range, linearity, limit of detection and limit of quantification for cholic acid

Compound Linear Range (µg/mL) Calibration Equation Corr. coeff. (R

) LOD (µg/mL) LOQ (µg/mL)

cholic acid 0.005-5 Y=1.6230X + 0.1034 0.9995 0.001 0.005

임상적 응용목적으로 건강한 지원자와 천식환자인 남성(n=2), 여성(n=2)의 혈장 시료를 분석하였다. 정상군과 천식환자군 모 두에게서 콜릭산과 내부 표준문질은 3분 대에서 각각 잘 분리 되어 검출되었다(Fig. 2). 혈장시료 내 콜릭산의 농도는 정상군 은 0.002±0.008, 대조군은 0.012±0.002였다(Table 5). 이 결과는 담즙산은 담즙 중 분비되어 장-문맥-간-담즙이라는 폐쇄적 장간 순환을 함으로 대순환계는 거의 존재하지 않고 말초혈액에서의 Table 3. Precision and accuracy of the intra-day assay

Compound Accuracy±RSD (%)

cholic acid

Intra-day assay (n=5)

0.05

0.2

2

96.8±2.7 99.9±2.8 101.3±4.0

a

expressed as µg/mL

Table 4. Precision and accuracy of the inter-day assay Compound Accuracy±RSD (%)

cholic acid

Inter-day assay (n=3)

0.05

0.2

2

98.4±2.7 100.4±2.3 111.0±3.4

a

expressed as µg/mL

Table 5. Concentration of cholic acid in human plasma analyzed by UPLC-MS/MS (n=2)

Compound

Concentration (µg/mL)

Normal Asthma Reference range

(low-high) Mean±SD Mean±SD

cholic acid 0.02±0.008 0.012±0.002 0 ~ 0.29

Fig. 3. LC-MS/MS MRM chromatogram of cholic acid on gall bladder bile matrix; blank (TIC) (A), internal standard in blank (TIC)

(B), standard solution (TIC) (C), normal women 1 (D) and normal woman 2 (E).

농도는 극히 낮다는 점을 대변해 준다. 건강한 여성의 담즙산 시료를 2회 UPLC/ESI-MS/MS로 분석함으로서 피크면적과 피크 검출시간이 일관성이 있음을 확인하였다. Fig 3의 크로마토그램 을 통해 콜릭산이 잘 분리되었음을 알 수 있었다. 담즙산 시료 에서 콜릭산의 농도는 5.71 µg/mL였다(Table 6). 알콜성 간염이 나 약제성 간 장애와 같은 간 질환에 따라 담즙산이 감소하는 것으로 보고되어 있으며, 본 연구에서 사용한 담즙산 시료는 간 기능 이상으로 인한 간 이식 수술을 받은 환자 시료여서 콜릭 산의 농도가 현저히 감소한 것으로 여겨진다.

고 찰(Discussion)

일반적으로 LC-MS를 이용한 분석법의 경우 주로 고체상 추

출

과 숯을 이용한 추출,

그리고 농축과 같은 전처리

가 사용되었다. 혈장 내 지질, 인지질, 지방산 등과 같은 내인성 물질을 제단백 처리법만으로는 효과적으로 제거할 수 없는 경 우가 있고, 특히 ESI 방식에서는 이 물질로인한 이온 억제 효과 를 일으키는 원인으로 보고되고 있다. 이러한 이유로 기존에는 SPE, LLE 추출법이 많이 사용되었다.

그럼에도 불구하고 본 실험에서는 비용과 시간 노동력이 많이드는 전처리법 없이 제 단백과 여과과정의 간편한 전처리만으로도 높은 정확도와 정밀 성을 가진 정량적 분석이 가능하였고 이는 상당히 효율적인 분

석법이라고 여겨진다.

LC-MS/MS,

UPLC-MS/MS,

LC-MS-QOrbitrap

를 이 용하여 사람과 쥐의 혈장 또는 혈청에서 콜릭산을 정량 분석한 타 논문들의 정량한계 및 검출한계 농도의 결과를 본 연구의 결 과와 비교하였다(Table 7). 본 연구에서 콜릭산의 검출시간은 3.011분으로 매우 신속하게 분리할 수 있었고 탠덤 매스의 높은 선택성으로 인해 매우 낮은 농도에서 검출 및 정량이 가능함을 확인하였다특히, 콜릭산의 머무름 시간 3.011분에서는 매트릭스 의 영향이 없음을 MRM 크로마토그램에서 확인하였다(Fig. 2C).

1 차 담즙산이 간에서 분비된 후, 대부분의 담즙산은 타우린과 글리신이 결합되며 용해성을 높이기 위해 나트륨염 형태를 가 진다.

또한 곁사슬 구조, 6개의 탄소링의 입체구조, 수산화기 가 결합된 위치에 따라 그 종류가 다양하며 화학적 성질 또한 달라진다.

담즙산의 농도와 구성은 종에 따라서도 차이가 있 으며,

생체 시료에 따라서도 그 비율이 달라진다. 정상적인 환 경 아래 혈청에서 담즙산의 농도는 쓸개에서의 농도보다 훨씬 낮다. 반면에 간과 소장에 질환이 있는 경우 담즙산 분비에 문 제가 생기면 혈청과 간에 담즙산이 축적되며 농도는 달라진다.

또한 담즙산은 세포막을 파괴하는 특성을 가지며 이로 인해 세 포사 또는 세포노화를 유발할 수 있기 때문에 간질환의 중요한 유발원인이라고 보고되고 있다.

따라서 다양한 담즙산의 농 도를 생체시료 내에서 정량하는 것은 관련 질환을 예측하고 진 단하기 위한 임상학적 방법으로써 중요한 의미를 지닌다.

본 연구에서는 혈장과 담즙산 중 콜릭산에 대한 정성 정량 분석법 을 검증하였으며 추후 좀더 다양한 담즙산(단백결합, 비단백결 합, 유리형 등)의 종류를 추가하여 본 연구를 확대하여 광범위 한 생체시료에 적용함으로써 실제 임상적으로 활용할 수 있도 록 확장하고자 한다.

Table 6. Concentration of cholic acid in human gall bladder bile analyzed by UPLC-MS/MS

Compound

Concentration (µg/mL)

Mean±SD Range (low-high) Reference range

(low-high) cholic acid 5.71±0.40 5.31-6.11 20,830-21,250

Table 7. Comparison of calibration range, limit of detection and limit of quantification for cholic acid to our study No. Sample

matrix Sample preparation Range (µg/mL)

LOD (µg/mL)

LOQ

(µg/mL) Instrument References (Note) 1 Human plasma PPT

0.005~5 0.001 0.005 UPLC-QQQ Our method 2 Human serum EDTA plasma/serum ND

~1.8 0.0024 ND

LC-QQQ 18

3 Human serum SPE

0.037~20 0.037 0.14 UPLC-QTRAP 19

4 Artificial Calculus Bovis liquid liquid extraction 0.05~50 0.004 ND

LC-QQQ 20 5 Human plasma charcoal, PPT

0.001~0.1 ND

0.001 UPLC-QQQ 21

6 Mice serum SPE

0.01~10 ND

0.01 LC-QQQ 22

7 Human serum charcoal, PPT

0.01~5 ND

0.01 UPLC-QQQ 23

8 Rat serum PPT

0.005~10 ND

0.005 UPLC-QTOF 24

9 Human plasma Bile acid kit, PPT

0.01~30 0.004 0.01 UPLC-QTRAP 25

10 Human plasma SPE

0.01~2.8 0.003 0.01 UPLC-QQQ 26

11 Human plasma charcoal, PPT

0.001~1 ND

0.001 UPLC-QTRAP 27

a

protein precipitation,

solid phase extraction, and

not detected

결 론(Conclusion)

본 연구는 인력, 시간, 비용을 절감하면서도 제단백만의 간단 한 전처리법을 이용하여 UPLC-MS/MS를 이용하여 신속하고 감 도 높게 혈장 및 담즙산 중 콜릭산의 분석법을 개발하였다. 콜 릭산의 밸리데이션을 수행하였을 때 높은 감도, 정확성과 정밀 성 그리고 매우 낮은 정량한계(0.005 µg/mL)를 보였으며, 실제 임상시료인 혈장 및 담즙에 적용이 가능함을 확인하여 추후 다 양한 질환모델의 대사체학이나 진단에 응용가능할 것으로 여겨진다.

감사의 말씀(Acknowledgment)

본 연구는 덕성여자대학교(2018)로부터 연구비를 지원받아 수 행되었으므로 이에 감사드립니다. 혈장과 담즙을 제공하여 주신 최호순 교수님(한양대학교 의과대학), 논문 실험 중 조언을 아 끼지 않으신 홍영민 소장님(시마즈 연구소)께 감사드립니다.

Conflict of Interest

모든 저자는 이해 상충을 가지고 있지 않음을 선언한다.

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