Induction of Apoptosis by Kilkyoung-Sagunjatang and Kilkyoung-Samuyltang in A549 Human Non-small-cell Lung Cancer Cells

84 책임저자：박동일, 󰂕 614-052, 부산시 진구 양정동

동의대학교 한의과대학 내과학교실 Tel: 051-850-8651

E-mail: [email protected]

접수일：2009년 2월 20일, 게재승인일：2009년 3월 4일

Correspondence to：Dong-Il Park

Department of Oriental Medicine and Internal Medicine, Dongeui Uni- versity College of Oriental Medicine, 100, Yangjeong-dong, Busanjin-gu, Busan 614-052, Korea

Tel: +82-51-850-8651 E-mail: [email protected]

길경사군자탕과 길경사물탕이 인체폐암세포의 Apoptosis에 미치는 영향

동의대학교 한의과대학 한의학과, ¹내과학교실

신우진ㆍ박동일

Induction of Apoptosis by Kilkyoung-Sagunjatang and Kilkyoung-Samuyltang in A549 Human Non-small-cell Lung Cancer Cells

Woo Jin Shin and Dong-Il Park¹

Departments of Oriental Medicine and ¹Internal Medicine, Dongeui University College of Oriental Medicine, Busan 614-052, Korea

In the present study, we investigated the anti-proliferative activity of the water extract of Kilkyoung-Sagunjatang (K-SGJT) and Kilkyoung-Samuyltang (K-SMT) in A549 human non-small-cell lung cancer cell lines. We found that exposure of A549 cells to K-SGJT and K-SMT resulted in the growth inhibition in a dose-dependent manner as measured by trypan blue count and MTT assay. The anti-proliferative effect of K-SGJT treatment in A549 cells was associated with morphological changes, formation of apoptotic bodies and increased populations of apoptotic-sub G1 phase. The anti-proliferative effect of K-SMT treatment in A549 cells was associated G1 arrest in a dose-dependent manner as measured by flow cytometry analysis. The present results suggest that K-SGJT and K-SMT have divergent biological functions and additional studies will be needed to identify the active compounds that confer the anti-cancer activity of K-SGJT and K-SMT. (Cancer Prev Res 14, 84-92, 2009)

Key Words: Kilkyoung-Sagunjatang, Kilkyoung-Samuyltang, Human non-small-cell lung cancer cells,

Apoptosis

서 론

암은 인체에서 정상적으로 조절되지 않으며 침윤 및 전 이를 유발하는 질병으로서 가장 중요한 사망원인 중 하나 이다.

세계보건기구(World Health Organization, WHO) 및 미국암학회(American Cancer Society, ACS)에 따르면 모든 사망원인 중 약 30% 정도가 암으로 인한 사망이며 2007 년에는 약 760만 명 정도가 사망한 것으로 보고되어지고

있다.

특히 폐암은 전 세계에서 암으로 인한 사망의

첫 번째 원인으로 알려져 있으며, 폐암의 약 80%를 차지

하고 있는 비소세포암(non small cell lung cancer, NSCLC)의

경우는 방사선 치료 및 화학적 치료에 대하여 저항성을

가지는 것으로 알려져 있다.

또한 화학적 치료를 위하여

사용되어지고 있는 doxorubicin, 5-fluorouracil, cisplatin, eto-

poside 및 gemcitabine 등과 같은 항암제는 종양세포 뿐만

아니라 정상세포인 골수세포와 소장 상피세포에도 심각

한 영향을 주며, 비소세포암은 비교적 늦은 시기에 발견

Table 1. Composition of Kilkyoung-Sagunjatang used in the present study

Herb name Dose (g)

Ginseng radix alba 5.0

Atractylodes rhizoma 5.0

Poria cocos wolf 5.0

Glycyrrhizae radix 5.0

Platycodon radix 6.0

Total amount 26.0

Table 2. Composition of Kilkyoung-Samuyltang used in the present study

Herb name Dose (g)

Rehmanniae radix preparat 5.0

Paeonia radix alba 5.0

Angelicae gigiantis radix 5.0

Cnidii rhizoma 5.0

Platycodon radix 6.0

Total amount 26.0

되기 때문에 완전한 외과적 절제술이 가능하지 않으므 로 5년 생존율이 15% 이하로 매우 낮은 것으로 보고 되 어지고 있다.

따라서 비소세포암을 치료하는데 있어 서 보다 더 효과적인 생리활성을 지닌 물질을 발굴하고 이러한 생리활성 물질의 분자 및 세포 수준에서의 기전 을 밝히는 것이 중요할 것이다.

사군자탕(四君子湯)은 송대(宋代) 진사문(陳師文)에 의 해 편찬된 태평혜민화제국방(太平惠民和劑局方)

에 최 초로 기재된 처방으로 “治榮衛氣虛 臟腑怯弱 心腹脹滿 全不思飮食 腸鳴泄瀉 嘔噦吐逆”이라 하여 대표적인 보 기건비지제(補氣健脾之劑)이다. 또한 사군자탕(四君子湯) 은 보기제(補氣劑)의 기본처방이 되어 대부분의 보기제 (補氣劑)는 사군자탕(四君子湯)에 몇몇 약물을 가감(加 減)하여 구성 된다.

사물탕(四物湯)은 태평혜민화제국 방(太平惠民和劑局方)

에 처음으로 수록된 처방으로

“治衝任虛損 血虛血滯 月經不調 臍腹絞痛 崩中漏下 血 瘕塊硬 陣發疼痛”이라 하여 혈허증(血虛證)을 치료하는 대표적인 보혈제(補血劑)이다.

현재까지 사군자탕(四君子湯)을 이용한 암세포에 관 한 기존의 연구로는 Kim

과 Jung

의 위암세포에 관한 연구가 있고, 사물탕(四物湯)을 이용한 연구로는 Park

의 흑색종 세포고사(枯死)에 관한 연구가 있으나 인체폐 암치료에 효과가 있는 것으로 보고 된

길경(桔梗)을 추가한 길경사군자탕(桔梗四君子湯)과 길경사물탕(桔梗 四物湯)의 항암작용 및 그에 따른 분자생물학적 기전에 관해서는 아직까지 조사된 바가 없다. 본 실험에서는 길 경사군자탕(桔梗四君子湯)과 길경사물탕(桔梗四物湯)이 인체 비소세포암인 A549 세포의 apoptosis에 미치는 영향 을 알기위해 암세포의 증식에 미치는 영향을 조사하였 고, 길경사군자탕과 길경사물탕이 유발하는 증식억제 현상이 apoptosis 및 세포주기에 어떠한 영향을 미치는 지 를 조사하여 유의적인 결과를 얻었기에 이를 보고하는 바이다.

재료 및 방법

본 실험에 사용된 桔梗四君子湯 (Kilkyoung-Sagunjatang, K-SGJT)과 桔梗四物湯 (Kilkyoung-Samuyltang, K-SMT)은 동의대학교 부속 한방병원에서 제공 받았으며(Table 1, 2), K-SGJT 및 K-SMT의 수용액 추출물을 얻기 위하여 약 재 100 g당 증류수 1 L을 가하여 환류 냉각장치가 장착 된 가열기에서 180∼200

C의 온도로 2시간 동안 끓이고, 이를 3,000 rpm에서 20분간 원심분리 시킨 후, 그 상층액 을 Whatman 필터(No. 2)로 걸러내고 감압 농축과 가열을 통해 고형성분을 얻어내어 막자사발로 잘게 마쇄하고 밀봉시켜 초저온 냉동고에 보관하였고 적정 농도로 배 지에 희석하여 처리하였다.

2. 세포의 배양

본 실험에 사용한 A549 인체폐암세포는 American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, USA)에서 분양 받 았으며 90%의 RPMI-1640 배지(Gibco BRL, Grand Island, NY, USA), 10% fetal bovine serum (FBS, Gibco BRL)에 2 mM glutamine (Gibco BRL), 100 U/ml penicillin (Gibco BRL), and 100μg/ml streptomycin (Gibco BRL)이 포함된 성장배 지를 사용하여 5% CO

, 37

C의 조건하에서 배양하였다.

배지는 매 48시간마다 교환해주었고, 세포수의 증식에 따른 과밀도 현상을 해소하기 위하여 0.05% trypsin-ethy- lenediamine tetraacetic acid (EDTA, Gibco BRL)를 처리하여 세포를 부유시킨 다음 적정수의 세포를 분주하여 재배 양하였다.

3. MTT assay에 의한 세포 성장억제 조사

세포 배양용 6 well plate에 A549 인체폐암세포를 3×

10

개/ml로 분주하고 24시간 동안 안정화시킨 다음 K-SGJT

및 K-SMT를 배지에 희석하여 각 well 당 적정농도로 처

리하였다. 48시간 후 배지를 제거하고 성장배지와 희석 된 0.5 mg/ml 농도의 tetrazolium bromide salt (MTT, Amresco, Solon, OH, USA)를 2 ml씩 분주하고 3시간 동안 CO

incu- bator에서 배양시킨 다음 MTT 시약을 깨끗하게 제거하 고 DMSO를 1 ml씩 분주하여 well에 생성된 formazin을 모 두 녹인 후 96 well plate에 200μl씩 옮겨서 ELISA reader (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)로 540 nm에서 흡 광도를 측정하였다. 측정은 모두 세 번을 하였으며, 그에 대한 평균값과 표준 오차를 Microsoft EXCEL program을 사용하여 분석하였다.

4. Hemocytometer를 이용한 세포생존율의 측정

세포 배양용 6 well plate에 A549 세포를 3×10

개/ml의 개수로 well 당 2 ml씩 분주하고 24시간 동안 안정화시킨 다음 K-SGJT 및 K-SMT를 적정농도로 처리하여 48시간 동안 배양한 후 배지를 제거하고 0.05% trypsin-EDTA를 처리하여 세포를 부유시켜서 phosphate-buffered saline (PBS)를 각 well 당 적정량을 첨가하여 세포를 모았다. 이 렇게 모인 세포를 2,000 rpm으로 5분간 원심분리하여 상 층액을 제거하고 세포만 남긴 다음 다시 1 ml의 PBS와 동량의 0.5% trypan blue (Gibco BRL)를 첨가하여 2분간 처리한 후 위상차 현미경(Carl Zeiss)을 이용하여 살아있 는 세포를 계수하였다. 이에 따른 결과를 Microsoft EXCEL program을 사용하여 분석하였다.

5. 위상차 현미경을 이용한 세포의 성장과 형태의 관찰

세포 배양용 100 mm petri dishes에 A549 세포를 3×10

개/ml 정도로 분주하여 24시간 동안 안정화시킨 다음 K-SGJT 및 K-SMT를 적정농도로 희석 처리하여 48시간 동안 배양한 후, 위상차 현미경(inverted microscope)을 이 용하여 200배의 배율로 각 농도에 따른 형태의 변화를 관찰한 다음 Kodak 자동카메라용 필름을 이용하여 사진 을 촬영하였다.

6. DAPI staining에 의한 세포핵의 형태 관찰

암세포의 apoptosis 유발 여부 확인을 위한 핵의 형태적 변화를 관찰하기 위하여 K-SGJT 및 K-SMT가 적정농도 로 처리된 세포를 모은 다음 37% formaldehyde 용액과 PBS를 1：9의 비율로 섞은 fixing solution을 500μl 첨가하 여 충분히 섞은 후, 상온에서 10분 동안 고정하였다.

2,000 rpm으로 5분간 원심 분리하여 상층액을 제거하고 PBS 200μl를 넣어서 충분히 섞은 후, slide glass 위에 80 μl 정도 떨어뜨려 1,000 rpm에서 5분간 cytospin하였다.

PBS로 2~3회 washing하고 PBS가 다 마르기 전에 0.2%의

Triton X-100 (Amresco)을 첨가하여 상온에서 10분간 고정 한 후 다시 PBS로 washing하고 2.5μg/ml 농도의 4',6-dia- midino-2-phenylindole (DAPI, Sigma, St. Luis, MO, USA) 용 액을 세포가 고정된 slide glass 위에 적당량을 떨어뜨린 후 빛을 차단하고 상온에서 15분간 염색시켰다. PBS로 DAPI 용액을 충분하게 세척하고 증류수로 재빨리 세척 한 다음 absolute alcohol을 이용하여 탈수과정을 거친 slide glass 위에 mounting solution을 처리한 후 형광 현미경(Carl Zeiss)을 이용하여 400배의 배율로 각 농도에 따른 암세 포의 핵의 형태 변화를 Axio Vision 프로그램을 이용하여 사진 촬영을 하였다.

7. Flow cytometry 분석

K-SGJT 및 K-SMT를 처리한 후 48시간 동안 배양시킨 암세포들을 0.05% trypsin-EDTA를 처리하여 부유시킨 다 음 2,000 rpm으로 5분간 원심 분리하여 상층액을 버리고 세포들만 모았다. 여기에 다시 PBS를 첨가하여 충분히 씻은 다음 2,000 rpm으로 5분간 원심분리 한 후 상층액 만 버리고 남은 세포에 Cycle test plus DNA regament Kit (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA)를 이용하여 고정 및 염색을 하여 4

C, 암실에서 30분 동안 반응을 시켰다. 반 응시킨 세포를 35-mm mesh를 이용하여 단일세포로 분리 한 후 FACSCalibur (Becton Dickinson)를 이용하여 형광반 응에 따른 Cellular DNA content 및 histogram을 CellQuest software (Becton Dickinson) 및 ModiFit LT (Becton Dickinson) 프로그램을 이용하여 분석하였다.

8. DNA fragmentation의 분석

Apoptosis가 유발되었을 때 관찰될 수 있는 DNA frag-

mentation의 분석을 위하여 정상 및 K-SGJT와 K-SMT가

처리된 배지에서 48 시간 동안 배양된 세포를 모아 lysis

buffer [10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 5 mM

EDTA, 0.5% Triton X-100]를 처리하여 상온에서 30분간

반응시켰다. 그 후 14,000 rpm에서 20분간 원심분리하여

상층액을 모은 다음 proteinase K (Sigma)를 0.5 mg/ml의 농

도로 처리하여 50

C에서 3시간 동안 반응시킨 후 동량의

phenol : chloroform : isoamyl alcohol 혼합 용액(25：24：1,

Sigma)을 첨가하고 30분간 rotate시킨 다음 14,000 rpm에서

10분간 원심 분리하였다. 여기서 얻어진 상층액에 적정

량의 isopropanol (Sigma)과 5 M NaCl를 첨가하여 24시간

정도 냉장 보관한 후, 14,000 rpm, 4

C에서 30분간 원심분

리 시킨 후 상층액을 버리고 DNA를 얻었다. 이렇게 얻

어진 DNA를 RNase A가 적당량 들어있는 TE buffer를 이

용하여 녹이고 6X gel loading dye (Bioneer, Daejeon, Korea)

Fig. 2. Effects of K-SGJT and K-SMT on the viability of human lung carcinoma A549 cells. Cells were seeded at 3×10⁴/ml in a 6-well plate and incubated for 24 h. Cells were treated with variable concentrations of K-SGJT and K-SMT for 48 h. The cells were trypsinized and the viable cells were scored by hemocytometer counts of trypan blue-excluding cells. The data shown are means±SD of three independent experiments.

Fig. 1. Growth inhibition of human lung carcinoma A549 cells after treatment with Kilkyoung-sagunjatang (K-SGJT) and Kilkyoung-samuyltang (K-SMT). Cells were seeded at 3×10⁴/ml in a 6-well plate and incubated for 24 h. Cells were treated with variable concentrations of K-SGJT and K-SMT for 48 h.

The growth inhibition was measured by the metabolic- bye- based MTT assay. The data shown are means±SD of three independent experiments.

를 섞은 후 1.5% agarose gel을 이용하여 50 V로 1시간 가 량 전기영동 시킨 다음 ethidium bromide (EtBr, Sigma)로 염색하여 ultra vilolet (UV) 하에서 사진 촬영하였다.

결 과

1. A549 폐암세포의 증식에 미치는 K-SGJT 및 K-SMT의 영향

인체 폐암세포주인 A549 세포의 증식에 미치는 K-SGJT 및 K-SMT의 영향을 알아보기 위하여 준비된 세 포에 K-SGJT 및 K-SMT 시료를 적정 농도로 처리하여 48 시간 경과 후 MTT assay를 이용하여 조사한 결과는 Fig.

1에 나타난 바와 같다. 결과에서 나타난 바와 같이 K-SGJT 및 K-SMT 모두 2 mg/ml의 농도까지는 증식억제 효과가 크게 나타나지 않았지만 2.5 mg/ml의 농도에서부 터 증식억제효과가 나타나기 시작하여, 3 mg/ml의 농도 에서 K-SGJT 처리군에서는 약 43% 정도의 증식억제효 과가 나타났고 K-SMT 처리군에서는 약 67% 정도의 증 식억제효과가 나타났다. 이상의 결과를 살펴볼 때 K-SGJT 및 K-SMT 모두 증식억제효과가 나타났지만 K-SMT 처리군이 K-SGJT 처리군에 비교해서 증식억제효 과가 강하게 나타났으므로 A549 세포의 경우는 K-SMT 비 해서 K-SGJT에 대해 저항성을 가지는 것으로 사료된다.

2. A549 폐암세포의 생존율에 미치는 K-SGJT 및 K-SMT의 영향

K-SGJT 및 K-SMT의 처리에 따른 인체폐암세포인 A549 세포의 생존율을 알아 보기 위하여 K-SGJT 및 K-SMT를 적정농도로 48시간 동안 처리한 후, hemocytometer로 살 아있는 세포의 수를 계수하여 비교한 결과는 Fig. 2에 나 타낸 바와 같다. 제시된 결과에서 알 수 있듯이 K-SGJT 및 K-SMT 처리군 모두에서 2 mg/ml의 농도까지는 생존 율에 큰 영향을 미치지 못하는 것으로 나타났지만 3 mg/ml의 농도에서부터 급격한 생존율의 감소가 관찰되 었으며 특히 K-SGJT에 비해서 K-SMT를 처리했을 경우 생존율의 감소가 더욱 강하게 유발되는 것으로 관찰되 었다. 이와 같은 결과는 K-SGJT 및 K-SMT의 처리에 따 른 증식억제 현상과 유사한 것으로 나타났다.

3. K-SGJT 및 K-SMT에 의한 A549 폐암세포의 형태 변화

A549 폐암세포의 형태에 미치는 K-SGJT 및 K-SMT의

영향을 알아보기 위하여 K-SGJT 및 K-SMT를 적정 농도

로 처리하여 48시간동안 배양한 후 위상차 현미경을 이

용하여 관찰하였다. Fig. 3에서 볼 수 있듯이 2 mg/ml의

K-SGJT 및 K-SMT 처리군까지는 큰 형태적인 변화가 관

찰되지 않았지만 3 mg/ml 처리군에서는 심한 형태적인

변형이 관찰되었다. 특히 K-SGJT 처리군의 경우에는 전

Fig. 4. Formation of chromatin condensation by K-SGJT and K-SMT treatment in human lung carcinoma A549 cells. Cells were treated with K-SGJT and K-SMT for 48 h and then stained with DAPI solution. After 10 min incubation at room tem- perature, the cells were washed with PBS and nuclear mor- phology was photographed with a fluorescent microscope using blue filter. Magnification, ×400.

Fig. 3. Morphological changes of human lung carcinoma A549 cells after treatment with K-SGJT and K-SMT. Cells were seeded at 3×10⁴/ml in a 6-well plate and incubated for 24 h.

Cells were treated with variable concentrations of K-SGJT and K-SMT for 48 h. Cell morphology was visualized by light mi- croscopy. Magnification, ×200.

Fig. 5. DNA-flourescence histogram of human lung carcinoma A549 cells nuclei after treatment with K-SGJT and K-SMT.

Exponentially growing cells at 50% confluency were treated for 48 h with indicated concentrations of K-SGJT and K-SMT.

Cells were trypsinized and pellets were collected. The cells were fixed and stained with CycleTEST PLUS DNA REAGENT Kit, and analyzed by flow cytometry.

체적으로 암세포의 밀도가 감소하였지만 분지형태의 세 포 및 배지위로 부유하는 세포가 거의 관찰되지 않은 반 면에 K-SMT 처리군의 경우에는 밀도의 감소와 더불어 길고 분지를 형성하는 듯한 dendrite-like한 구조의 형성 및 부착력을 상실하고 배지 위로 부유되는 경향성이 증 가하였다. 이상의 결과에서 K-SGJT 및 K-SMT 처리에 의 한 형태적 변화 정도가 증식억제 및 생존율의 감소와 잘 일치하는 것을 알 수 있었다. 하지만 K-SGJT 및 K-SMT 처리에 따른 형태변화의 모양이 다른 것으로 나타났으 므로 각기 다른 기작을 통하여 증식억제 및 생존율의 감 소를 유발한다는 것을 예상할 수 있었다.

4. A549 폐암세포 핵의 형태에 미치는 K-SGJT 및 K-SMT의 영향

K-SGJT 및 K-SMT 처리에 따른 증식억제, 생존율 감소 및 형태변화가 apoptosis 유발과 연관이 있는지를 조사하 였다. 이를 위하여 A549 폐암세포 핵의 형태에 어떠한 영향을 미치는 지를 확인하기 위하여 정상 및 K-SGJT 및 K-SMT가 처리된 배지에서 배양된 암세포를 고정시 킨 후 DAPI 염색을 실시하여 형광현미경하에서 관찰한 결과는 Fig. 4에 나타낸 바와 같다. 결과에서 나타난 바와 같이 K-SGJT 처리군의 경우에는 전체적인 핵의 밀도가 감소하였지만 apoptosis가 일어난 세포에서 전형적으로 관찰되는 염색질 응축에 의한 apoptotic body가 관찰되지 않은 반면에 K-SMT 처리군의 경우에는 핵의 밀도 감소 와 더불어 염색질 응축에 의한 apoptotic body가 관찰되었 다. 이상의 결과에서 K-SGJT 처리에 의한 증식억제, 생

존율 감소 및 형태변화가 apoptosis와 직접적인 연관이 없

는 것으로 나타났지만 K-SMT 경우에는 apoptosis 유발과

밀접한 연관이 있음을 알 수 있었다.

Fig. 6. Induction of apoptosis by K-SGJT and K-SMT in human lung carcinoma A549 cells. (A) The cells were collected and stained with CycleTEST PLUS DNA REAGENT Kit for flow cytometry analysis. The percentages of cells with hypodiploid DNA (sub-G1 phase) contents represent the fractions under- going apoptotic DNA degradation. Data are means average of two separate experiments. (B) Cells were incubated with variable concentrations of K-SGJT and K-SMT for 48 h, then collected and DNA was extracted. The DNA fragmentations were separated on 1.6% agarose gel electrophoresis and visualized under UV light after staining with EtBr.

5. A549 폐암세포의 Sub-G1기 빈도에 미치는 K-SGJT 및 K-SMT의 영향

이상의 결과에서 확인된 K-SGJT 및 K-SMT 처리에 따 른 A549 폐암세포의 apoptosis 유발 정도를 정량적으로 분석하기 위하여 flow cytometry를 이용하여 apoptosis가 유발되었을 것으로 예상되는 세포의 빈도에 해당되는 sub-G1기에 해당하는 세포의 빈도를 측정한 결과는 Fig.

5 및 Fig. 6A와 같다. 정상 배지에서 자란 암세포에서의

자연적 apoptosis 유발 빈도는 매우 낮았지만 K-SMT 처리 군의 경우에는 3 mg/ml의 농도에서 sub-G1의 비율이 급 격히 증가하여 약 34% 정도로 나타났다. 하지만 K-SGJT 처리군에서는 sub-G1의 비율이 약 1%로 나타나 apoptosis 유발과는 아무런 연관이 없었지만 G1기에 해당하는 세 포의 수가 증가하는 것으로 나타났으므로 G1기에서의 세포주기 억제가 유발되는 것으로 관찰되었다.

6. A549 폐암세포의 DNA fragmentation에 미치는 K-SGJT 및 K-SMT의 영향

Apoptotic body 및 sub-G1기 빈도 증가와 함께 apoptosis 유발의 직접적인 증거에 해당하는 DNA fragmentation 여 부를 agarose gel 전기영동으로 조사하였다. 이를 위하여 정상 및 K-SGJT 및 K-SMT이 함유된 배지에서 자란 암세 포를 대상으로 총 DNA를 추출하여 조사한 결과는 Fig.

6B에 나타낸 바와 같다. K-SGJT 처리군의 경우에는 DNA laddering 현상을 뚜렷하게 관찰할 수 없었지만 K-SMT 처리군의 경우에는 3 mg/ml의 농도에서 apoptosis 가 일어난 세포들에서 볼 수 있는 전형적인 DNA laddering을 관찰할 수 있었다. 이는 결국 K-SMT 처리에 의하여 A549 세포의 endonuclease가 활성화되어 chromo- somal DNA가 단편화되었음을 의미하는 것이다. 이상의 결과에서 K-SGJT 처리에 의한 증식억제, 생존율 감소 및 형태변화는 apoptosis와는 아무런 연관이 없었지만 K-SMT 처리에 의한 일련의 변화들은 apoptosis 유발과 밀접한 연 관이 있는 것으로 조사되었다.

고 찰

최근 암의 발병기전에 대한 분자생물학적 연구가 활 발히 진행되면서 암을 일으키는 원인으로 알려진 다양 한 종양유전자에 이어 암의 발생을 억제하는 것으로 생 각되어지는 여러 종류의 암 억제 유전자가 밝혀지면서 암의 발병기준에 대한 이해가 넓어졌다. 세포의 증식과 세포주기 조절의 교란에 의하여 증식이 계속되는 것을 암세포라고 할 수 있으며,

암을 억제하는데 있어서 apoptosis를 유발하는 유전자들의 발현을 조절하는 것과 더불어 세포주기 조절에 연관된 유전자들의 발현을 조 절하는 기전의 해석은 암을 포함한 질병 관련 약제의 개 발에 매우 중요한 의의를 가질 수 있다.

한의학에 폐암이라는 병명은 없지만 폐암과 유사한

내용에 대한 기록은 많이 찾아 볼 수 있다. 난경(難經)

에서는 “肺之積, 名曰息賁, 在右脇下 覆大如杯, 久不已,

令人洒淅寒熱, 喘咳, 發肺壅” 이라 하였고, 제생방(濟生

方)

에서는 “息賁之狀, 在右脇下, 覆大如杯, 久不已, 喘 息奔溢, 是爲肺積; 診其脈浮而毛 其色白, 其病氣逆, 背痛 少氣, 喜忘目瞑, 膚寒, 皮中時痛, 或如虱緣, 或如鍼刺”라 하여 이러한 증상들은 폐암의 증상과 매우 유사하다.

사군자탕(四君子湯) 구성약재의 효능을 살펴보면 인 삼(人蔘)은 감온(甘溫)하여 대보원기 보비익기 생진 영신 익지(大補元氣 補脾益氣 生津 寧神益智)하고 노상허손 (勞傷虛損)을 치료하여 일절 기혈진액부족(氣血津液不 足)에 응용되고 백출(白朮)은 감고미온(甘苦微溫)하여 보 비익기 조습리수 고표지한(補脾益氣 燥濕利水 固表止 汗)하고 비위기약(脾胃氣弱)을 치료한다. 백복령(白茯苓) 은 감담(甘淡)하여 리수삼습 건비보중 영심안신(利水滲 濕 建脾補中 寧心安神)하고 비허식소(脾虛食少)를 치료 하며, 감초(甘草)는 감평(甘平)하여 보비익기 청열해독 조화제약(補脾益氣 淸熱解毒 調和諸藥)한다. 사물탕(四 物湯) 구성약재의 효능을 살펴보면 숙지황(熟地黃)은 감 미온(甘微溫)하여 자음보혈 익정진수(滋陰補血 益精塡 髓)하고 간신음허(肝腎陰虛)를 치료하며, 당귀(當歸)는 감신온(甘辛溫)하여 보혈조화 조경지통(補血和血 調經 止痛)하고 보혈조경(補血調經)의 요약(要藥)으로 월경부 조(月經不調)및 혈허병증(血虛病症)을 치료한다. 백작약 (白灼藥)은 고산량(苦酸凉)하여 양혈유간 평억간양(養血 柔肝 平抑肝陽)하고, 천궁(川芎)은 신온(辛溫)하여 활혈행 기 거풍지통(活血行氣 祛風止痛)하고 풍습비통 질박종 통(風濕痺痛 跌撲腫痛)을 치료한다.

사군자탕(四君 子湯)과 사물탕(四物湯)은 보기보혈(補氣補血)의 대표방으 로서 폐암치료에 효과가 있는 것으로 보고 된 길경(桔梗) 을 가하여 만성 허증(虛症)으로 진행된 폐암에 응용하여 실험하였다.

세포의 죽음은 생화학적 특징에 따라 크게 apoptosis와 necrosis로 구분되는데, necrosis의 경우는 세포를 둘러싼 환경이 급격하게 변하여 세포가 더 이상 적응할 수 없으 면 세포의 팽창, 이온 농도의 변화 및 물의 유입 등과 같은 조절되지 않는 상태로 유발되는 세포의 죽음인 반 면에, apoptosis의 경우는 programmed cell death라고 불리 는 과정으로서 배아의 발생, 조직의 remodeling 및 손상된 세포의 제거 등에 관여를 한다.

Apoptosis의 특징으로는 세포의 수축, 이웃하는 세포와의 결합력 약화, 염색질 응 축, DNA 단편화, 세포 표면에 phosphatidylserine의 발현 및 세포막의 수포화 현상 등과 같은 형태적 또는 생화학 적인 변화를 동반하며, 이러한 apoptosis 과정이 실패하게 되면 암과 같은 여러 가지 질병의 원인이 되므로 apoptosis는 암화 과정의 여러 단계에서 암을 치료하는 중 요한 표적이 되고 있다.

본 연구에서는 인체 폐암세포주인 A549 세포를 대상 으로 K-SGJT 및 K-SMT에 의한 항암기전을 조사하였다.

이를 위하여 먼저 정상배지 및 K-SGJT 및 K-SMT를 처리 한 배지에서 24시간동안 자란 암세포의 증식 및 생존율 의 정도와 그에 따른 형태적 변화정도를 관찰하였다.

Fig. 1 및 Fig. 2에 나타난 바와 같이 정상배지에 비해서 K-SGJT 및 K-SMT를 처리한 배지에서 자란 암세포에서 증식억제 현상 및 생존율의 감소가 뚜렷하게 관찰되었 다. 특히 K-SGJT에 비해서 K-SMT이 증식억제 및 생존율 의 감소현상이 더욱 강하게 나타나는 것으로 조사되었 다. 이러한 증식억제 및 생존율의 감소가 세포의 형태에 미치는 영향을 관찰한 결과 Fig. 3에서 볼 수 있듯이 K-SGJT 처리군의 경우에는 세포의 수가 급격히 감소하 였지만 큰 형태적 변형은 관찰되지 않았지만 K-SMT 처 리군의 경우에는 세포 수의 감소와 더불어 세포질의 응 축 및 부착 능력의 상실에 따라 배지위로 부유하는 세포 가 증가하는 등의 심한 형태적 변형을 유발하였다. 이러 한 증식억제, 생존율 감소 및 형태 변화가 apoptosis 유발 과 연관성이 있는지를 확인하기 위하여 암세포의 핵 형 태 변화를 관찰한 결과는 Fig. 4에 나타난 바와 같다.

K-SGJT 처리군의 경우에는 처리농도 증가에 따라 핵의

밀도가 감소하였지만 염색질 응축 현상은 나타나지 않

은 반면에 K-SMT 처리군의 경우에는 핵의 밀도 감소와

더불어 apoptosis 유발시 전형적으로 관찰되는 염색질 응

축 현상이 관찰되었다.

이는 nucleosome의 linker DNA

부분의 절단에 의한 DNA 단편화의 결과이므로 K-SMT

처리에 의한 암세포의 증식 억제, 생존율의 감소 및 형태

적 변형이 apoptosis 유발과 밀접한 관련이 있음을 시사하

여 주는 것으로 생각된다. 또 다른 apoptosis 증거로서 사

용되는 DNA fragmentation 여부를 agarose gel 전기영동으

로 조사한 결과 Fig. 6B에 나타난 바와 같이 K-SMT 처리

에 의하여 apoptosis가 일어난 세포들에서 볼 수 있는 전

형적인 DNA laddering 현상을 관찰할 수 있었다. 하지만

K-SGJT 처리군의 경우에는 DNA laddering 현상을 거의

관찰할 수 없었다. 이는 K-SMT 처리에 의하여 endonu-

clease가 활성화되어 chromosomal DNA가 단편화되었음을

의미하는 것이다. 이러한 apoptosis 유발정도를 정량적으

로 확인하기 위하여 flow cytometry 분석에 의한 apoptosis

유발 세포군에 해당하는 sub-G1기에 속하는 세포들의

빈도를 조사한 결과는 Fig. 5 및 Fig. 6A에 나타낸 바와

같다. 결과에서 알 수 있듯이 K-SMT 처리군의 경우에는

3 mg/ml의 농도에서 sub-G1의 비율이 현저하게 증가하

는 것을 관찰할 수 있었고 K-SGJT 처리군의 경우에는

sub-G1기에 해당하는 세포의 증가는 관찰되지 않았지만

G1기에 해당하는 세포의 증가가 관찰되었다. 이상의 결 과에서 K-SGJT 처리에 의한 증식 억제, 생존율 감소 및 형태 변화는 G1기에서의 세포주기 억제에 의하여 유발 되는 반면에 K-SMT 경우에는 apoptosis 유발에 의하여 이 러한 현상들이 나타난다는 것을 알 수 있었다.

이상의 결과에서 K-SGJT 및 K-SMT를 인체폐암세포주 인 A549 세포에 처리하였을 경우 농도의존적인 증식 억 제, 생존율 감소 및 형태 변화가 유발되었으며, 이러한 현상들은 K-SGJT의 경우에는 G1기에서의 세포주기 억 제와 관련이 있었으며 K-SMT의 경우에는 apoptosis 유발 과 관련이 있는 것으로 나타났다. 이러한 연구 결과는 K-SGJT 및 K-SMT의 생화학적 항암기전 해석을 이해하 고 향후 지속적인 연구를 위한 귀중한 자료로서 그 가치 가 매우 높을 것으로 생각된다. 또한 두 처방의 실험결과 를 비교해 볼 때 K-SMT이 K-SGJT보다 더 효능이 있는 것처럼 생각되는데 이는 四物湯의 滋陰, 補血하는 효능 으로 血燥하고 津液이 不足한 虛症 양상의 폐암환자에 게 더 나은 효능이 있는 것으로 나타나는 것이 아닌가 생각된다. 하지만 이에 관한 지속적인 연구가 더욱 필요 한 것으로 사료된다.

결 론

사군자탕 및 사물탕에 길경이 가미된 길경사군자탕 (Kilkyoung-Sagunjatang, K-SGJT) 및 길경사물탕(Kilkyoung- Samuyltang, K-SMT)의 열수 추출물이 인체 폐암세포 A549 세포의 증식에 미치는 영향을 apoptosis 유발 측면에서 비 교 조사하였다. K-SGJT 및 K-SMT 모두 처리 농도 의존 적으로 A549 폐암세포의 증식억제 및 생존율 저하 효과 가 나타났지만 K-SMT 처리군이 K-SGJT 처리군에 비교 해서 증식억제효과가 강하게 나타났으므로 A549 세포의 경우는 K-SMT가 K-SGJT에 비하여 감수성이 높은 것으 로 나타났다. K-SGJT 처리에 의한 A549 폐암세포의 증 식억제, 생존율 감소 및 형태변화가 apoptosis와 직접적인 연관이 없는 것으로 나타났지만 K-SMT 경우에는 apoptosis 유발과 밀접한 연관이 있음을 알 수 있었으며, 정량적 비교를 위한 sub-G1의 비율 조사에서 K-SMT 처 리군의 경우에는 3 mg/ml의 농도에서 이 급격히 증가하 여 약 34% 정도로 나타났다.

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