각종 고정액에 따른 면역조직화학적 반응 양성의 변화에 관한 실험적 연구

(1)

대한임상병리사회지

:

제 20권 제

1

호

1988

각종 고정액에 따른 면역조직화학적 반응 양성의 변화에 관한 실험적 연구

고려대학교 의과대학 병리학 교실

·

신 용 칠 인천간호보건전문대학 임사병리과

·

김 주 성

1. 서 론 희석하여 사용하였다.

현재 사용하고 있는 조직고정액의 종류는 매우 많으

C.

시약

·나 용도에 따라 선별하여 사용된다. 흔히 사용되는 alcohol

1) Tris buffer saline(TBS)(0.05 M tris-Hcl, pH7.

과 10 % formalin고정액은 통상적인 염색방법인 hema-

6:0.15 M

Nacl): 이 완충용액은 항체의 희석과 세척과

toxylin-

eosin 염색에는 커다란 문제점이 없으나 특수 정에 이용된다.6gm 의 Tris분말을

500 ml

증류수에 녹

염색이나 최근 많이 이용하는 조직면역화학적염색에는 히고

1N

Hcl을

37.6 ml

넣고 완전히 용해시킨후

NaCl

어떤 항원 성분을 검출하느냐에 따라 부적합한 경우가

8

gm을 첨장고

1000

ml가 되도록 증류수로 희석한다.

흔히 있다. 그 원인은 개개의 고정액이 세포막 및 세 포질내의 화학물질의 변성내지는 변화를 초래하여 우 리가 원하는 화학성분 및 항원의 존재를 조직화학적 및 변역조직화학적 방법으로 확인하는데 위음성 또는 위양성으로 나타날수 있기 때문이다. 따라서 저자들은 면역조직화학적 검사에 흔히 이용되는

ABC (A vidin-

Biotin

comples) 를 이용하여 고정액이 조직에 미치는

생화학적 변화를 관찰하기 위하여 세포막에 주로 분포 되어 있는 수종의 Lectin을 선택하여 아래와 같이 면 역조직화학적 검사를 시행하고 다음과 같은 의의있는

결과를 얻였기에 이를 보고하는 바이다.

II. 실험재료 및 방법

A. 실험대상 세포

실험조직으로는

Sarcoma

180을 쥐의 복강에 주사하 여 증식시킨것을 주사기로 채취하여 slide에 도말 건조 후 각 고정액에 24 시간 고정시켜서 사용하였다.

B. 고정액

1) Formalin:

formalin은

Duksan chemical Co

제 품의 formaldehyde에 증류수로 10 배 희석하여 사용하였다.

2) Ethanol: Duksan chemical Co

제 품 의 순도

99.9%

을 사용하였다.

3) 10 % paraformaldehyde 20

ml와

25 % glutaraldehyde lOml

그리고

phosphate buffer 50

ml에 증류수 20ml를

2)

2) H2

0

2 -Methanol Methanol 200

ml에

30% H2

0

2 5 ml

희석 :내인성 peroxidase 활성을 억제 시키기 위해

사용된다.3_5)

3) DAB-Substrate(3,3’-dianino benzidine tetrariyd- rochloride) mg, TBS 10

ml에

3%

H 2α

4 drops

회 석

: peroxidase

효소반웅의 기질로 사용하며 영구적인 갈

색을 띄우게 된다 6) 이시약은 사용하기 직전에 만들어 야 한다.

4) Normal Swine serum(NSS) 1:20

:면역글로블린 이 검체에 비특이성으로 결합되는것을 억제하기 위하 여 이용된다 7) Vector사제품의

Normal Swine

Serum을 TBS로 20 배 희 석 한다.

5)

식물 응집소:실험에 사용한 식물 웅집소는

Vector Lab.

Inc. 에서 생산한

Biotinylated lectin

kit 에 포함된

soybean agglutinin(SBA), Concanavalin A(con A),

야anut

agglutinin (PN

A) 를 각각

1:200

으로 회석하여 사용하였다.

D. 염색 방법

1. Sarcoma

180을 slide에 도말 건조

2. Formalin, ethanol. EM

고정 액 에 24 시 간 고정

3.

수세

4.

내인성 과산화효소를 차단 30분간

5.

수세 3분간

6.

TBS로 수세 10분간

(2)

7.

NSS 에서 30분간

8.

TBS로 수세 3분간

9. Biotinylated. RNA. SBA.

ConA쿄 1 시 간 반웅

10. TBS로 30분간 3회 수세 함

11.

ABC로 30분간 반웅함

12.

TBS로 30분간 3회 수세함

13. DAB로 5분간 반웅

14. 5분간 수세함

15. 70, 80, 90, 99

% Alc이101로 각 3분씩 탈수함

16. Xylene 1, 2, 3,

단계로 각 3분씩 청 명 함.

17.

Malinol로 몽입함.

18.

현미경으로 관찰함.

ill. 실험 성적

Sarcoma

180의 핵， 세포질 및 세포막을 관찰할 결과

다음과 같다. (표

1

참조)

PNA 는 formalin에 고정한 세포에서 세포질과 세포 막은 원혀도 잘 보존된 편이고 염색상도 강한 양성반 웅을 나타냈으며(그림

1)

ethanol에 고정한 것에서는 세포막이 확산되면서 강하지는 못하나 세포막에만 양 성반웅을 나타냈다(그림

2). paraformalin -glutaraldehyde

용액에 고정한 것에서는 세포막은 원형이 잘 보존된 편이나 간휴 미약하게 양성반응을 보였으며 전 시야를 관찰한 결과 음성이 더 많이 보였다(그림

3).

반면에

SBA,

ConA는 모든 고정액에서 차이를 발견할 수 없 이 음성반응을 보였다.

N. 고 찰

이상적인 고정액의 조건으로는 신속한 고정으로 세

포의 형태를 잘 유지시키면서 세포구조물의 생화학적 변화를 초래시키지 않아야 한다. 일찌기 일반 조직검 사 및 면역조직화학 검사에서 가장 유용하다고 알려져 있는 고정 액 은 Alcohol 과 formaldehyde 였 다. 이 고 정 액은 현재까지도 가장 흔히 쓰이는 것으로 신속한 고 정으로 인하여 세포의 형태를 생체내에 있을때와 같이 가장 근접하게 고정시킨다고 한다. 그러나 최근들어 급속도로 발전하고 있는 항원 항체 반응을 이용한 면 역세포조직화학적 검사에는 때로 부적합한 경우가 있 으며， 이를 위한 이상적인 고정액을 찾는 것은 매우 의의있는 면역조직화학적 염색에서 alcohol은 세포막 내의 지방성분을 제거시키고， 단백성분을 침전시키므 로 세포막에 있는 항원을 검출하는데는 좋으나， 세포 질내에 있는 성분을 검출하는데는 부적합한 것으로 되 어 있다 8) formaldehyde 역시 장기에 따라서는 세포질 내에 존재하는 항원성 물질이나， 간질내에 있는 항원 물질을 감추므로 (masking) 특별히 단백분해효소로 처 리하기 전에는 염색이 되지 않는다는 단점이 있다. 또 한 최첨단의 방법인 면역 -gold t..l- 면역효소를 부착시키 는 면역 전자현미경 검사에서는 각 항원의 특수성 및 조직의 특수성에 따른 고정액의 선택이 아주 중요하여 (critical) 염색의 위임성이나 위양성이 확연히 달라진다 고도 한다.

Formalin

고정액으로 젤라틴을 고정하거나

alcohol

^{고정액으로}

peptide

hormone둥을 고정했을 때 는 항원성이 활성을 잃거나 없어진다. 또한 paraffin포 매에 의해서도 지용성 물질이나 세포표면항원둥도 항 원성이 활성을 잃게된다. 면역조직화학 염색에 선택한 Lectin은 식물의 뿌리， 줄기， 및 열매에서 추출한 단백 또는 당단백의 식물 웅집소로 Stillmark에 의해 처음 발견되었으며， 동물의 적혈구와 웅집하는 특성을 이용 하여 초기에는 혈액형 분류에 이용되었으나9_11) 이후 곰팡이， 무척추동물 및 척추동물의 조직에서도 발견 표

1. Pattem of lectin binding on Sarcoma 180 fixed in various fixative.

고정액

Lectins Cell type Reaction

Nucleus, Cytoplasm, Cell rnernbrane

Formalin PNA Sarcoma 180

Formalin SBA Sarcoma 180

Formalin ConA Sarcoma 180 ^_r-

Eth없101

PNA Sarcoma 180

Ethanol SBA Sarcoma 180

Ethanol ConA Sarcoma 180

-

EM PNA Sarcoma 180

土

EM SBA Sarcoma 180

- -

EM ConA Sarcoma 180

(3)

되었다. 이러한 Lectin 이 특수한 탄수화불기와 결합함

이 밝혀진후12~ ¹⁵⁾ 최근에는 Lectin을 이용하여 1)종양

세포내의 생화학적 변화 2) 세포분열 몇 태생장기에서 의 생화학적 변화

3)

세포막의 구조를 균명하는데 이 용되고 있다.

따라서 고정액에 따른 세포막의 구조 및 변화를 면 역조직화학적 방볍으로 검출하는 것은 저자의 실험 목 적에 잘 부합되는 것으로 이를 선택 하였다. 차후에는 좀더 많은 실험검체의 선택과 Lectin 의 종류를 늘려서 부족하고 미숙한 점에 대해서 연구를 계속할 계획이다.

v. 결 론

조직 및 세포를 이용하여 면역효소화학적 검사를 시 행함에 있어서 고정액에 따른 반응 양상의 변화를 보 기 위 하여 배 양된

sarcoma 180

세 포를 slide 에 도말한 후

10 formalin,

무수

ethanol

및

glutaraldehyde, -paraformaldehyde

용액에서 3종의 Lectin을 이용하여 면역 효소조직화학적 염색을 실시한후 다음과 같은 결론을 얻었다.

1.

배 양된

Sarcoma 180

세 포에 서

SBA,

ConA 는 음 성반응을 보였으며 PNA 는 양성 반응을 보였다.

2.

PNA 에 대한 양성반응은 formalin 고정액에서는

4. Glutaraldehyde- Paraformaldehyde

고정 액 에 서 는 부분적으로 약하게 양성반응을 보였다.

위의 결과로 미루어 세포맥과 세포질에 존재하는 항 원성 불질을 면역조직화학 염색으로 검출할 때는

10%

formalin

용액이 가장 좋으며， 세포막에만 존재하는 항

원인 경 우는 ethanol도 무방할 것이나，

glutaraldehyde-

paraformaldehyde

용액은 양자에 모두 부적합하다는

결론을 얻을 수 있었다.

세포액과 세포철에 아주 강한 양성반응을 보였다. 그림. 2. Weak positive heaction for PNA on the cell

3.

PNA 는

ethanol

고정액에서 세포막에 약한 양성

membranes of sancoma 180 in the ethamol fired

반응을 보였다 (ABC X18이

그림.

1. Strong positive heaction for PNA both in the

그림.

3. Scamty positive hasction for PNA both in cytoplasms and on the cell membaanes of the cytoplasms and the cell membhames of sancoma 180 in the formalcn fied(ABC X800) sarcoma 180 in the glutahaldehyde-parafor-

maldehyde fixed.

(4)

Experimental study on the changes of immunohistochemical reaction patterns depending on the various fixatives.

Yong Chil Shin· Ju Sung Kim

nursing

Dept of clinical pathology Inchon junior College & Allied health Sciences

Abstract

Recently immunohistochemical techniques have rapidly developed to diagnose And spacialize the cell types in the tissves.

But positive rates and positive raction patterns of a cartain antigen by the immunohistochemical stains are different in depsnding on the various fixatives.

In 0rder to study the changessas of immunocytochemical reaction patterns depending on the various fixatives, the authors performed immvnocytochemical staining for peanut agglutinin(PNA), soybean agglvtinin, (SBA) and concanavalin A (Con A) on cultvred sarcoma 180 cells.

The cells were fixed in different fixatives svch as 10% formalin, alsoute ethanol and 25% glutaraldehyde- 10 % paraformadehyde solvtion, respactively.

The resuls were as followings:

1.

Amongg PNA, SBA and ConA only PNA revealed

positive reaction on the Sarcoma 180 cells:

2. Sarcoma 180 cells, fixed in 10 % formalin, showed strong positive reactions for PN A both in the cytoplasm and on the cell membranes.

3. Sarcoma 180 cells, fixed in absolvte ethanol, showed weak positive reaction for PNA only on the cell membranes.

4. Sarcoma 180 cells, fixed in 25% glutaraldehyds-10

% paraforrnadehyed, showed focal scanty positive reaction for PN A both in the cytoplasms and on the cell membranes.

With the above resvlts, we concluded 10 % formlin was the best fixative for Immunohistochemical stains to demonstrate the cytoplasmic and cell membrane antigens comparing to ethanol and glutaraldehyde-pa- raformadehyde. However 95 % ethanol may

be

good to display the cell membrane antigens, but 2.5 % glu- taradehyde- 1.0% paraformadehyde slovtion is not good for goth cytoplasmic and cell membrane antigens.

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