In vitro response of osteoblast-like cell to rough and smooth zirconia-alumina composite

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지르코니아 복합 세라믹의 표면거칠기에 따른 조골세포의 반응

이태식, 채광조, 한중석, 김대준*, 이원준*

서울대학교 치과대학 보철학 교실

*세종대학교 신소재공학과

In vitro response of osteoblast-like cell to rough and smooth zirconia-alumina composite

Abstract

Tae-Sik Lee, Kwang-Jo Choi, Jung-Suk Han, Dae-Joon Kim*, Won-Jun Lee*

Dept. of Prosthodontics, School of Dentistry, Seoul National University

*Dept. of Advanced Materials Engineering, Sejong University

The newly developed high-strength ceramics such as zirconia may offer some advantages over the conventional bioinert materials. Especially, zirconia-alumina composite has excellent physical properties, this might be an alternative material to titanium for dental implant fabrication. This study evaluated the bone cell responses on zirconia-alumina composite discs with different roughness.

A total of 18 zirconia-alumina composite disc (diameter: 19mm and thickness: 1.5mm) were prepared and divided into two groups. The discs of group 1 (n=9) had smooth surface and group2 (n=9) had rough surface(sandblasting with 150µm alumina glass particles). The cell attachment, cell proliferation, cell differentiation on the specimen were evaluated by the Real-Time Polymerase Chain Reaction(RT-PCR), Methylthiazole Sulfate(MTS) analysis, Alkaline Phosphatase(ALP) activity, and scanning electron microscopy (SEM) using osteoblast-like cell (HOS) respectively.

According to result of Elisa analyses, MTS, ALP activity and SEM investigation, there was no significant difference in cell response between two different surface conditions. The analysis of RT-PCR showed that the amount of Cyclin D1(mRNA expression) was not statistically significant different between two groups after 24 hours as well, however markedly decreased in the smooth surface after 72 hours.

These results suggested that, in general, the effect of the surface condition (smooth vs. rough) was not significantly affected on osteoblast like cell response to the zirconia-alumina composite in vitro biological assessment.

본 연구는 한국과학재단 목적기초연구(R01-2003-000-10565-0) 지원으로 수행되었음.

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서 론

매식된 임플란트에 대한 생체조직의 반응을 살펴 보기 위한 유용한 방법으로 세포실험, 동물실 험, 임상실험등이 시용되나 생체 내에서의 반 응은 너무나 많은 세포가 관여하고, 또한 복합적이기 때문 에 정확히 어떤 세포가 관여하고, 어떤 단계를 거쳐서 결 과가 나타났는지를 분석하기가 매우 까다롭다.

^1,2

In vitro 실험은 어떤 물질에 대한 특정세포반응의 분석에 유용하 다. 기질과 세포의 반응은 세포 사이에서 세포외물질 (ECM)을 통해서 상호 작용이 발생하고, 특정 신호가 integrin을 통해, 세포내의cytoplasm과, cytoskeleton, nucleus로 전달되는 것으로 알려졌다.

²

생체 재료의 특성 에 따라서 세포외 물질의 부착과 생성이 달라질 수 있으 며, 그에 따른 신호 체계의 변화가 서로 다른 골 반응을 유 도하므로 신소재에 대한 생체적합성 및 골과의 반응을 검 사하기 위하여 in vitro 세포반응연구가 필수적이다.

⁴

많은 연구에서 티타늄, 티타늄 합금, 그리고 고분자 복합체 등 의 임플란트에 대한 생체 적합성을 평가하는 In vitro test 가 세포의 부착, 증식, 분화에 따른 기능적인 평가와, 세포 의 형태적 관찰에 중점을 두어 행해졌으나 고강도 지르코 니아 세라믹에 대한 연구는 드물었다.

^3-9

본 연구는 지르코니아 복합 세라믹의 표면형상에 따른 조 골세포의 반응정도를 세포부착(adhesion), 증식 (proliferation), 분화(differentiation)의 단계 별로 관찰 하여 비교하였다.

연구재료 및 방법

1) 연구재료

(1) 세포배양 (cell culture)

실험을 위하여, HOS(from a human osteosarcoma, 세 포주 은행, 한국) osteoblast-like cells를 이용하였다. 세 포에 영양공급을 하는 10% fetal bovine serum(FBS)이 들어있는 배지에서 FBS가 들어있지 않은 RPMI 배지로 바꿔주어, 증식시킨 조골세포들을 1시간 동안 starvation 시킨후 phosphate buffer saline(PBS)으로 세척하고, 배 양기에 부착된 세포들을 분리하기 위하여 Trypsin-EDTA 를 넣어 잘 섞은 후, Trypsin inhibitor의 역할을 하는 10% FBS가 들어있는 배지로 갈아주었다. 그리고 E- tube에 넣고 원심분리(1200RPM, 5min)한 후, 침전된 세포들을 RPMI 배지에 녹여 Trypan blue로 착색시켜서 현미경을 이용해 세포 수를 counting 하였다(5x 10

⁵

cells/

㎖). 각 배지에는 1% penicillin (10,000IU)과 streptomycin(10,000㎍/㎖)이 포함되었다.

(2) 시편준비

지름 19㎜, 두께 1.5㎜의 지르코늄 복합 세라믹 시편을 smooth surface 와 rough surface 로 각각 9개를 준비하 였다. smooth surface는 경면처리 하였으며 rough surface는 알루미나를 이용하여 sandblast 하였다. 표면 조도는 Ra 값이 각각 0.1 및 0.9-1.48 이었다.

2) 연구방법

세포부착은 cell adhesion density와 the extra cellular matrix(ECM) protein RT-PCR assay와 scanning

II

I

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electron microscopy (SEM), 세포증식은 cell cycle analysis (Cyclin D1) RT-PCR assay 와 methylthiazole sulfate (MTS) assay, 세포분화는 alkaline phosphatase (ALP)activity measurement를 이용하여 본 연구를 시행하였다.

(1) 세포부착의 분자생물학적 평가 : adhesion assay 지르코니아 복합 세라믹 시편을 1개씩 넣은 12well plate(22φ)를 각각 3개씩 만든 다음, 위에서 준비된 세포 용액을 1㎖(1.0×10

⁵

cells/㎖)씩 넣었다. 각 culture plate에 세포용액을 넣고 약 1시간이 지난 후, 조골세포들 이 지르코니아 복합 세라믹의 표면에 부착 (adhesion)이 되면 , 모든 culture plate의 RPMI 배지를 suction out 하고 PBS로 세척한 다음, 10% formalin 500㎕를 넣고 실온에서 15분간 fixation 시켰다. fixation 이 끝나면 crystal violet을 500㎕ 넣어주고 실온에서 overnight 으 로 착색 시킨 후, suction out 하고 나서 D.W. 로 세척한 다음 cell lysate 를 위해서 2% SDS 를 400㎕ 분주했다.

lysate 된 용액을 새로운 96well plate 에 100㎕씩 옮긴 후 570nm 파장으로 ELISA (PowerWave 340, DI biotech) 분석하였다.

(2) 세포부착의 분자생물학적 평가 : ECM protein RT-PCR assay

지르코니아 복합 세라믹 rough 시편을 4개씩 넣은 12well plate (22φ) 를 2개군 [4개 시편 2(A,B)군 = 8개 시편]을 만든 후, 위에서 준비된 세포용액을 각군의 culture plate 에 1㎖(1.010

⁵

cells/㎖)씩 넣었다. Smooth 시편도 위와 같은 방법으로 준비하였다 [4개 시편 2(C,D)군 = 8개 시편]. 지르코니아 복합세라믹의 rough surface 시편의 A,B 군은 각각 24, 72 시간 동안 incubation (a humidified atmosphere of 95% air, 5%

CO

²

at 37。C)을 한 후, 시편 표면의 조골세포들을 긁어

모아서, 제조사의 지시에 따라 RNeasy mini kit를 이용 하여 RNA 를 추출하였다. smooth surface시편의 C,D군 도 마찬가지로 각각 24, 72 시간동안 incubation 을 한 후, 시편표면의 조골세포들을 긁어 모아 RNA 를 추출하 였다.

각군에서 추출한RNA 에 역전사 효소 (RT enzyme)를 넣 어 42。C로 30분 동안 유지하여, RNA를 cDNA로 바꾼 후, gene-specific primer를 사용하여PCR-Thermal cycler (GeneAmp PCR system 9700, Applied Biosystem) 에서 PCR 증폭시켰다. 그리고 전기영동 (electrophoresis)하여, gel 사진을 촬영하였다. 본 실험에 서는, 부착 관련 단백질인 Osteopontin(OPN) mRNA 를 RT-PCR 로 증폭시켜, 전기영동 하여 gel 사진을 촬영하 였으며, β-actin 은 대조의 의미로 연구에 포함시켰다.

(3) 세포부착의 형태 평가 : SEM

지르코니아 복합 세라믹 rough surface 시편과 smooth surface 시편을 각각 1개씩 넣은 culture plate를 만든 다 음, 위에서 준비된 세포용액을 1㎖씩 넣고 24시간동안 incubation 한 다음, 2% paraformaldehyde (w/v)로 고 정하고, SEM 을 이용하여 1000배로 관찰하였다 (original magnification ⅹ1000).

(4) 세포증식의 분자생물학적 평가 : cell cycle analysis RT-PCR assay

위의 ECM protein RT-PCR assay를 위해 추출한 RNA 를 그대로 이용하여 세포증식과 관련된 단백질인 Cyclin D1 을 비교 측정하였다. Cyclin D1의생성에 해당되는 mRNA를 RT-PCR로 증폭시켜서 전기영동 하여 gel 사진 을 촬영하였다.

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(5) 세포증식의 세포생물학적 평가 : MTS assay 지르코니아 복합 세라믹 시편을 1개씩 넣은 culture plate(22φ)를 각각 3개 만든 다음, 위에서 준비된 세포용 액을 1㎖(1.0×10

⁵

cells/㎖)씩 넣었다. 각 culture plate 에 세포용액을 넣고 약 1시간이 지난 후, 조골세포들이 지 르코니아 복합 세라믹의 표면에 부착 (adhesion)이 되면, 모든 culture plate의 RPMI 배지를 suction out 하고 PBS로 세척한 다음, 두 그룹의 시편들을 새 culture plate(22φ)로 옮겼다. 그리고 10% FBS가 있는 배지를 넣어 주고 나서, 3일 동안 incubation 시켰다. incubation 후 PBS로 세척 후, FBS가 없는 배지로 갈아주었다.

MTS solution (CellTiter 96 Aqueous one solution reagent, Promega-G358A)을 각culture plate에 160㎕

씩 넣은 후, 다시 2시간동안 incubation 시키고, incubation이 끝나면 각각으로부터 100㎕씩 덜어서, 96 well plate 에 옮긴 후, 490nm 파장으로 ELISA (PowerWave 340, DI biotech) 분석을 한다.

(6) 세포분화의 세포생물학적 평가 : ALP activity measurement

세포분화 평가는, 조골세포에서 나타나는 특징인 alkaline phosphatase (ALP)의 activity를 분석하여 얻 어지는데, 이 ALP 는, p-Nitrophenyl phosphate (p- NPP)로 부터 p-Nitrophenol (p-NP)을 release 시키는 데 작용한다.

ALP activity measurement 에서는 지르코니아 복합 세라 믹 시편을 1개씩 넣은 culture plate(22φ)를 각각 3개 만든 다음, 위에서 준비된 세포용액을 1㎖ (0.5×10

⁵

cells/㎖) 씩 넣었다. 각 sample 을 1주일동안 incubation 한 후 culture plate를 PBS로 세척한 후, 25mM glycine-NaOH buffer 과 0.5% TritonX 를 각각 400㎕씩 분주하고 pipeting 으로 세포들을 lysis 시켰다. 100㎕씩 을 96 well plate 로 옮기고 여기에 p-NPP (alkalinephosphatase-

yellow liquid substrate system for ELISA, Sigma A- 3459) 를 50㎕씩 첨가 한 다음, 30분 동안 incubation 을 한 후에, 2N-NaOH (stop buffer)를 50㎕씩 첨가하여 반 응 을 정 지 시 킨 후 , 400nm 파 장 으 로 ELISA (PowerWave 340, DI biotech) 분석을 하였다

연구 결과

(1) 세포부착의 분자생물학적 평가 : adhesion assay 결과

Cell adhesion assay에서 ELISA 분석결과 [각 group 당 3개 시편의 optical density (O.D.)의 평균값을 repeat 한 data 의 평균값], 지르코니아 복합 세라믹 smooth 시 편과 rough 시편에서 1시간 후의 adhesion 정도는 차이 가 없었다 (Fig. 1).

(2) 세포증식의 세포생물학적 평가 : MTS assay 결과

MTS assay에서 ELISA 분석결과 [각 group 당 3개 시편 의 optical density (O.D.)의 평균값을 repeat 한 data 의 평균값] 지르코니아 복합 세라믹 smooth 시편과 rough 시편사이에서 차이가 없었다 (Fig. 1).

(3) 세포분화의 세포생물학적 평가 : ALP activity measurement 결과

ALP assay에서 ELISA 분석결과 [각 group 당 3개 시편

III

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의 optical density (O.D.)의 평균값을 repeat 한 data 의 평균값]에서도 두시편간의 차이가 없었다. 다만 O.D. 값 이 현저히 낮으므로 두 시편에서 세포의 분화정도는 그리 크지 않다고 할 수 있다. (Fig. 1)

(4) 세포부착의 분자생물학적 평가 : ECM protein RT-PCR assay 결과

석회화된 결합조직에 존재하는 비아교단백질로서, 세포부 착성질을 가지는 RGD (Arg-Gly-Asp) 배열구조를 가지 며, 세포 부착능력이 있으며, 수산화인회석을 매개시키는 poly Amino Domain을 가지는 Osteopontin(OPN)의 gel 사진 (mRNA expression)을 보면 (Fig. 2) 3일째에 서 smooth 와 rough 에 상관없이 증가함을 볼 수 있다.

역시 시간이 조금 지나서 충분히 부착할 수 있는 시간이 주어지면 그 단백질양도 증가하는 것을 볼 수 있다. 하지 만 smooth와 rough의 차이는 1일째와 3일째 모두 큰 차

이를 보이지 않는다. Β-actin은 OPN 과 cyclin-D1의 대 조의 의미로 실험을 하였다 (Fig.3).

(5)세포부착의 형태 평가 : SEM 결과

모든 지르코니아 복합 세라믹 surface에서 부착된 조골세 포의 irregular morphology를 볼 수 있었으며) rough한 표면에서 약간 더 spread 된 양상을 보였다. (Fig.4, 5)

(6) 세포증식의 분자생물학적 평가 : cell cycle analysis RT-PCR assay 결과

세포 증식과 관련된 단백질인 Cyclin D1 의 gel 사진 (mRNA expression)을 보면 (Fig. 6), 1일째의 smooth sample 과 rough sample 간의 차이가 없었으나 3일째는 smooth surface 시편에서 그 양이 현저히 줄어들었다.

Fig. 1.

cell adhesion assay, MTS assay and ALP assay (O.D.=optical density)

Smooth Rough ration(S/R)

cell attachment assay MTS ALP

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Fig. 2.

mRNA expression of Osteopontin

Fig. 4.

SEM of HOS cell on rough surface of Zc

Fig. 5.

SEM of HOS cell on smooth surface of Zc

Fig. 6.

mRNA expression of Cyclin-D1

Fig. 3.

mRNA expression of Β-actin

Cyclin-D1

1 day 3 day

OPN

1 day

R S R S C R S R S C

B-actin

1 day

3 day 3 day

R S R S C

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총괄 및 고찰

생체와 치과용 임플란트 계면에서 신속하고 안정적인 골 형성을 위한 생체 적합성이 뛰어난 신소재를 찾기 위한 많 은 연구가 행해졌으나 대부분이 조골세포와 티타늄 또는 티타늄 합금과의 반응에 대해 이루어졌고

^3-9

지르코니아 세라믹에 대한 조골세포 활동에 대한 연구는 드물었

다.

^8,10,11

골과 임플란트 재료의 계면에서 직접적이며 긴밀

한 부착은 장기간의 임상적인 성공을 위한 주요한 요소이 며 골형성에 직접적으로 조골세포의 부착 , 증식 및 분화 와 관련된 대사 활동이 관여하게 된다. 또한 재료의 표면 성상에 따라 조골세포의 반응도 차이가 있음이 동물 및 임 상실험에서도 제시된 바 있다. 이번 실험은 거친 또는 평 활한 지르코니아 복합체에 대한조골세포의 반응을 in vitro에서 평가하였다. 실험 결과 지르코니아 복합세라믹 의 표면에서 좋은 생체적합성을 나타냈으며 지르코니아 세라믹의 rough surface와 smooth surface간에서 유의성 있는 차이는 관찰할 수 없었다. 즉 표면 거칠기에 따른 조 골세포의 반응은 단기간 동안에 차이가 없었다. 이 결과를 확인하기 위하여 다양한 시간대별의 조골세포반응에 대한 추가실험이 필요하게 생각되며 동물실험을 통한 확인 연 구도 필요하게 사료된다.

결 론

지르코니아 복합 세라믹의 생체 적합성 및 임플란트 매식 체로서 그 재료의 표면양상에 따른 조골세포(HOS osteoblast-like cell)의 반응에 대한 실험을 통하여 본 실 험의 한계내에서 아래와 같은 결론을 얻었다.

세포부착은 cell adhesion density와 the extra cellular matrix(ECM) protein RT-PCR assay와 scanning electron microscopy (SEM), 세포증식은 cell cycle analysis (Cyclin D1) RT-PCR assay 와 methylthiazole sulfate (MTS) assay, 세포분화는 alkaline phosphatase (ALP) activity measurement를 이용하여 본 연구를 시행하였다.

1. 지르코니아 복합 세라믹 smooth 시편과 rough 시편에 서 1시간 세포배양 후에 측정한 세포 부착능에 차이가 없었다. .

2. 세포 증식을 비교하기 위한 MTS assay에서도 두 시편 간의 차이가 없었다.

3. ALP assay에서도 두시편간의 차이는 없었으나 O.D.

값이 현저히 낮아 두 시편에서 세포의 분화정도는 그리 크지 않다고 할 수 있다.

4. 부착관련 단백질인 Osteopontin(OPN)도 3일째에서 smooth 와 rough 에 상관없이 증가함을 볼 수 있다.

5. SEM 결과를 보면 조골세포의 수나 모양에서 smooth surface 와 rough surface에서 큰 차이를 나타내지 않 는 것으로 관찰 되었다.

V

IV

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6. 세포 증식과 관련된 단백질인 Cyclin D1 은 1일째는 차이가 없었으나 3일째에는 rough surface에서 세포증 식이 활발하였다.

참고문헌

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교신저자 : Jung-Suk Han

주소: Dept. of Prosthodontics, School of Dentistry Seoul National University 28-1 Yongon-Dong, Chongno-Gu, 110-749, Seoul Korea E-mail : [email protected]