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2014년 8월 碩士學位論文

삼차원 폴리카프로락톤 스캐폴드 지지대 형상에 따른 조골모세포의

부착에 관한 연구

조 선 대 학 교 대 학 원

치 의 학 과

손 성 기

삼차원 폴리카프로락톤 스캐폴드 지지대 형상에 따른 조골모세포의

부착에 관한 연구

Study on adhesion of preosteoblast in three dimensional polycaprolactone scaffolds of notch type strut

2014年 8月 25日

조 선 대 학 교 대 학 원

치 의 학 과

손 성 기

삼차원 폴리카프로락톤 스캐폴드 지지대 형상에 따른 조골모세포의

부착에 관한 연구

지 도교수 고 영 무

이 논문 을 치의학 석 사학위 신청 논문 으로 제출 함.

2014年 4月

조 선 대 학 교 대 학 원

치 의 학 과

손 성 기

손성기의 석사학위 논문을 인준함

위원 장 조 선대학 교 교 수 유 상 준 印 위 원 조 선대학 교 교 수 김 병 훈 印 위 원 조 선대학 교 교 수 고 영 무 印

2014年 5月

조선 대학 교 대학 원

ABSTRACT ……… ⅲ 제 1장 서 론 ……… 1 제 2장 실험재 료 및 방법 ……… 3

제 1절 3차원 PCL 스캐폴드 제조

… 3

제 2절 표면분석

… 7

제 3절 조골모세포 배양

… 8

제 4절 조골모세포 증식

… 9

제 5절 조골모세포 분화

… 10

제 6절 조골모세포 부착

… 11

제 7절 통계학적 분석

… 12

제 3장 실험결과 ……… 13

제 1절 표면분석

… 13

제 2절 조골모세포 증식 및 분화

… 14 제 4장 고찰 ……… 20 제 5장 결론 ……… 22 참 고 문 헌 ……… 23

목 차

Fig. 1. 3D Bio-extruder equipment. ･････････････････････････

4

Fig. 2. The structure of round and notch type nozzle.･･･････

5

Fig. 3. The photograph of 3D PCL scaffold sample.･･･････････

6

Fig. 4. SEM observation of PCL scaffold with (a) round strut surface and (b) notch strut surface. ･･････････････

13

Fig. 5. SEM micrographs of the MC3T3-E1 cell seeded on (a1-3) round strut scaffold and (b1-3) notch strut scaffold for 2 hrs. ･････････････････････････････

16

Fig. 6. The proliferations of MC3T3-E1 cell seeded on round strut scaffold and notch strut scaffolds for 1, 3, and 5 days. ･･･････････････････････････････････････

17

Fig. 7. ALP activity of the MC3T3-E1 cell seeded on round strut scaffold and notch strut scaffold s for 4 and 8 days. ･･････････････････････････････････････････

18

Fig. 8. Fluorscence images of the MC3T3-E1 cell seeded on round strut and notch strut scaffold for 2 days. ･･･

19

LIST OF FIGURES

ABSTRACT

Study on adhesion of preosteoblast in three dimensional polycaprolactone scaffolds of notch type

strut

Seong-Ki Son, D.D.S, M.S.D

Advisor : Prof. Yeong-Mu Ko, D.D.S.,Ph.D.

Department of Dental Science

Graduate School of Chosun University

Most 3D scaffolds consist of round strut. Round strut has low cell seeding efficiency. Notch strut morphology enhances cell adhesion and proliferation and leads to the development of successful in vitro tissue-engineered constructs. In this study, 3D PCL scaffolds were fabricated by using notch type nozzle via fused deposition modeling (FDM) to improve the cell adhesion and proliferation. In addition, cell seeding in scaffolds can be promoted by generating strut feature within the 3D constructs. The 3D PCL scaffolds in this study were fabricated by FDM 3D printing. The fabricated 3D scaffold in this study showed good interconnected pores structure compared to conventional porous scaffolds. The notch-type strut of 3D scaffold was successfully fabricated by using notch-type nozzle equipped 3D printing device. 3D scaffolds were characterized by scanning electron microscopy. The proliferation and differentiation of MC3T3-E1 preosteoblast cell cultured on the 3D scaffold surface in vitro were evaluated by fluorescene microscope and alkaline phosphatase activity, respectively.

Compared with the round strut of 3D scaffolds, the notch-type strut of 3D scaffold demonstrated the higher cell proliferation and adhesion. The presented fabrication methods of 3D scaffolds in this study provided potential application for bone tissue engineering.

제 1 장 서 론

조직공학(tissue engineering)이란 생체 조직 및 장기를 대체할 수 있는 인 공 생체 조직의 체내 이식을 통하여 인체의 기능을 유지, 향상 및 복원이 목 적인 분야를 일컫는다(Langer 등, 1993; Minuth 등, 1998). 기능이 상실된 조직이나 기능을 대체함으로써 생체의 기능을 치환하고 복원하는데 쓰이는 재료를 생체재료라 하며, 그 중 폴리카프로락톤(Polycaprolactone, PCL)은 현재 대표적인 생분해성 고분자 가운데 하나로서 기타 고분자들과의 친화성 (compatibility)이 우수하며, 무독성, 기계적 강도가 우수하고 가공성이 용 이하여 조직공학 및 의료분야에 사용되고 있으며 이러한 이유로 model polymer로도 선택되어오고 있다(Yoshimoto 등, 2003; Ratner 등, 1996;

Lindo 등, 2006). 또한 세포지지체는 생체 이식용으로써 사용되기 때문에 무 독성(non-toxic), 생체적합성(biocompatibility), 생분해성 (biodegradability), 체외안전성(in-vitro stability), 멸균 가능성 (sterilization possibility)등의 조건을 만족해야 한다(유지 등, 2010). 지 지체의 제조에 많이 사용되는 방법으로는 염추출법(particulate leaching), 상분리법(phase separation), 이산화탄소를 이용한 고압기체 팽창법(high pressure gas saturation), 유화 동결건조법(Emulsion freeze drying), 섬유 압착법(Fiber bonding)등이 있으며, 이러한 방법은 원하는 자유 형상이나 공 극의 크기 및 모양을 얻기가 어려울 뿐만 아니라 공극끼리의 내부 연결성이 보장되지 않을 수 있다는 단점을 가지고 있고 이용되는 재료나 합성물 간의 독성이 문제시 될 수 있으며 제작방법의 공정이 복잡해질 수 있는 문제점을 지니고 있다(Nam 등, 2000; Oh 등, 2003; Mikos 등, 1994; Luong 등, 2009).

이에 따라 본 연구에서는 다양한 공극률, 규칙적인 삼차원 구조체 그리고 기계적 특성을 부여할 수 있는 fused deposition modeling (FDM) 법을 이용 하여 3차원 PCL 스캐폴드를 제조하여 사용하였다. 이러한 3차원 PCL 스캐폴 드 지지대 형상에 따른 표면개질기술은 세포의 분화 및 부착을 증진시키기 위해 생체재료표면을 물리적으로 변화시키는 기술법으로 현재 생체 의공학 분야에 널리 사용되고 있다(Bettahalli 등, 2013). 조직공학의 체외(in

vitro) 실험 단계에서는 생체 스캐폴드와 세포와의 상호작용을 최상으로 유 지하는 것이 요구된다. 빠르고 효율적으로 균일한 세포의 부착을 이루는 것 은 공학적으로 설계된 조직에서의 임상적용 가능성을 높일 수 있다. 표면개 질 처리된 3차원 PCL 스캐폴드는 조직세포의 용이한 부착과 부착된 세포가 성장할 수 있도록, 그리고 인체 내의 대사물질의 전달이 가능하도록 다공의 크기와 구조를 가져야 하며 동시에 사용용도에 따라 적합한 기계적 강도를 유지 할 수 있도록 제조되어야 한다. 또한 마이크로 및 나노 수준의 표면 형 상도 세포 기능을 제어하는데 고려되어야 한다.

본 연구에서는 둥근 형상의 섬유 지지대와 굴곡 진 섬유 지지대를 제작하여 3차원 PCL 스캐폴드의 생체적합성을 향상시키고 3차원 PCL 스캐폴드에 대한 조골모세포인 MC3T3-E1 세포의 분화 및 부착의 특성을 평가하고자 하였다.

제 2 장 실험재료 및 방법

제 1 절 3차원 PCL 스캐폴드 제조

본 실험에서 사용되는 3차원 PCL 스캐폴드는 쾌속조형기반(Rapid Prototyping: RP) 3 차원 바이오 플로팅 시스템을 이용하여 제조하였다(Fig.

1). 먼저 Polycaprolactone (PCL, Sigma-Aldrich, Mw: 45,000)을 쾌속조형기 반 장치의 실린더에 넣고 고온으로 가열한 후 직경 20 mm, 높이 3 mm, pore size 500 ㎛, strut size 1000 ㎛ 의 Round type strut과 Notch type strut 형태의 스캐폴드를 제조하여 시료로 사용하였다. Fig. 2는 Round type nozzle과 Notch type nozzle을 확대한 그림이다.

Fig. 3은 Round type strut과 Notch type strut으로 제조된 3차원 PCL 스캐 폴드의 광학적인 사진을 나타낸 것이다.

Fig. 1. 3D Bio-extruder equipment.

(a)

(b)

Fig. 2. The structure of (a) round and (b) notch type nozzle.

(a) (b)

Fig. 3. The photograph of (a) round and (b) notch type strut 3D PCL scaffold sample.

제 2 절 표면분석

표면 분석을 하기 위해 주사전자현미경(SEM: scanning electron microscopy, SNE-3200M, SEC, Korea)을 이용하여 Round type strut의 3차원 PCL 스캐폴드 및 Notch type strut의 3차원 PCL 스캐폴드 표면형상을 관찰하 였다.

제 3 절 조골모세포 배양

본 실험에서는 생쥐 두개골에서 유래한 조골모세포 MC3T3-E1을 ATCC에 구 입하여 사용하였고, 세포배양은 α-MEM (alpha minimum essential medium with ribonucleosides, deoxyribonucleosides, 2mM L-glutamine and 1mM sodium pyruvate, but without ascorbic acid/GIBCO, Custom Product, Catalog NO. A1049001)배지에 growth factor를 제공하는 10% (w/v) fetal bovine sereum (FBS, PAA Laboratoris, Inc. A15-751)과 항생제인 penicillin (100 units/ml) 및 streptomycin (100 ㎍/ml) 이 포함된 세포배 양액을 혼합하여 5% CO2가 공급되는 37℃, 100% 습도가 유지되는 CO2

incubator에서 배양하였다. 그리고 3일 마다 80% confluence 할 때 계대 배 양 하여 3세대 세포를 실험에 사용하였다.

제 4 절 조골모세포 증식

조골모세포 증식은 MTT assay를 이용하여 평가하였으며, 다음과 같은 방법 으로 수행하였다. 배양된 MC3T3-E1 세포는 α-MEM 배지를 모두 제거한 후 PBS (Phosphate buffered saline, Sigma, USA)를 이용하여 세척하였으며 trypsin/EDTA를 소량 첨가하여 배양접시로부터 분리시켰다. 분리된 세포에 FBS가 포함된 배지를 첨가하여 반응을 정지시킨 후 원심분리기를 이용하여 세포를 수집하였다. 세포에 배지를 첨가하여 다시 부유 시킨 후 round type strut의 3차원 PCL 스캐폴드 및 notch type strut 의 3차원 PCL 스캐폴드 샘 플이 담겨진 12-well plate에 각각 1 × 10⁵ cells/well을 파종하였다. 1, 3, 5일이 되면 MTT (thiazolyl blue tetrazolium bromide, Sigma-aldrich, M2128)시약을 각 well 당 100 ㎕ 첨가하여 청자색의 결정이 생성되는 것을 확인하였다. 4 시간 후 DMSO (dimethyl sulfoxide, Junsei, 35535-0350)를 1,000 ㎕/well을 넣은 후 실온에서 30 분간 배양하였다.

흡광도를 측정하기 위해 반응액을 96-well plate에 각각 200 ㎕씩 분주한 후 ELISA reader(Thermal Fisher SCIENTIFIC)를 이용하여 540 ㎚에서 흡광도 를 측정하였다.

제 5 절 조골모세포 분화

Round type strut의 3차원 PCL 스캐폴드 및 notch type strut 의 3차원 PCL 스캐폴드 샘플에 담겨진 MC3T3-E1 세포를 배양 24시간 후 분화배지로 교체하 고 2일 마다 분화배지를 교체하였다. 4일과 8일 후 well plate에 cell media를 제거하고 PBS로 2회 세척한 후 세포 lysis buffer를 well당 150 ㎕ 씩 넣어서 20분 간 wise mix를 이용하여 교반하였다. 스크레퍼를 이용하여 well내에 존재하는 세포를 추출하여 microtube에 담근 후 4℃, 2500 rpm에서 10분 동안 원심분리하고 상층액을 새로운 microtube에 옮겨주고 냉동보관 하 였다. 30분 동안 37℃에서 상층액이 담긴 microtube를 배양 후 0.1N Glycine-NaOH buffer와 15mM p-NPP혼합액을 500㎕씩 첨가하여 405 ㎚에서 흡 광도를 측정하여 ALP (alkaline phosphatase) activity를 계산하였다.

단백질 정량에는 Bradford Method가 사용되었다. 1㎎/㎖ bovine serum albumin(BSA)을 사용하여 표준용액을 제조한 후 측정하고자 하는 단백질을 증류수로 희석하여 20 ㎕로 제조하여 5분간 배양 후 592 ㎚에서 흡광도를 측 정하고, 표준정량곡선으로부터 단백질의 농도를 결정하였다.

제 7 절 조골모세포 부착

1. 주사전자현미경에 의한 관찰을 위한 세포 전처리

Round type strut의 3차원 PCL 스캐폴드 및 notch type strut의 3차원 PCL 스캐폴드 샘플이 담겨진 12 well plate에 배양된 MC3T3-E1 세포를 1× 10⁵ cells/mL의 농도로 파종하였다.(n=3) 그리고 2시간 후 2.5%의 Paraformaldehyde(Electron Microscopy Sciences 15714)와 Glutaraldehyde(SIGMA-ALDRICH G5882)의 혼합용액으로 2시간 전 고정을 하여 주었고 10분 동안 PBS을 이용하여 세척하여 준 후 Osmium tetroxide(SIGMA ALDRICH 201030)를 이용하여 30분 동안 후 고정을 진행하였다. 70%, 90%, 95%, 100% 알콜을 준비하여 건조시켜 주었고 HMDS(Fluka 52619)를 이용하여 샘플위에 남아있는 알콜을 제거하였다.

2. 형광현미경에 의한 관찰을 위한 세포 전처리

Round type strut의 3차원 PCL 스캐폴드 및 notch type strut의 3차원 PCL 스캐폴드 샘플이 담겨진 12 well plate에 배양된 MC3T3-E1 세포를 1× 10⁵ cells/mL의 농도로 파종하였다. 세포 파종 후 24시간이 지나면 PBS를 이용하 여 2회 세척하였다. Live and Dead Cell staining kit(Biovision ＃k 501-100)을 사용하여 각 well당 1ml씩 염색시약을 첨가하여 주었고, 37℃에 서 15분 동안 배양하였다. 각각의 3차원 PCL 스캐폴드 샘플을 cover glass 위에 부착하여 형광현미경으로 관찰하기 전까지 4℃에서 보관하였다.

제 8 절 통계학적 분석

모든 실험 데이터는 T-test 분석을 통하여 신뢰도 95% (*p<0.05) 내에서 변수의 비교를 통하여 각각의 유의성 차이를 비교하였다.

제 3 장 실험결과

제 1 절 표면분석

Fig.4는 3차원 PCL 스캐폴드의 표면형상을 관찰하기위해 주사전자현미경으 로 찍은 사진이다. round type의 3차원 PCL 스캐폴드는 매끄러운 둥근 형태 의 표면형상을 보이며, notch type의 3차원 PCL 스캐폴드의 표면은 nozzle 모양에 의해서 주름져 보이는 형태의 표면형상을 관찰할 수 있다.

(a) (b)

Fig. 4. SEM observation of PCL scaffold with (a) round type strut surface and (b) notch type strut surface.

제 2 절 조골모세포 증식 및 분화

Fig.5은 주사전자현미경을 이용하여 round type과 notch type의 PCL 스캐 폴드 표면에서 2일 동안 배양된 조골모세포의 부착을 관찰한 결과이다.

notch type strut 형태의 3차원 스캐폴드에서 대조군의 round type strut 형 태의 3차원 PCL 스캐폴드 표면에서 보다 조골모세포가 많이 부착되어 있는 것으로 보아 세포의 seeding 효율이 좋은 것을 알 수 있었고, 세포 spreading이 대조군의 3차원 PCL 스캐폴드 보다 우수하여 세포환경에 유리 한 표면을 제공한 것을 알 수 있었다.

Fig.6는 각각의 3차원 PCL 스캐폴드 표면이 MC3T3-E1 세포생존율에 미 치는 영향을 평가하기 위하여 MTT assay를 이용하여 관찰하였다. MTT assay는 세포의 미토콘드리아 활성과 직접연관이 있는 방법으로 세포의 생존 율을 측정할 때 일반적으로 널리 사용되는 방법이다. 이 실험에서 대조군은 round type strut 형태의 3차원 PCL 스캐폴드를 사용하였고, notch type strut 형태의 3차원 PCL 스캐폴드를 실험군으로 사용하였다. 조골모세포인 MC3T3-E1 세포 생존율은 대조군과 실험군 모두 1 일, 3 일, 5 일 동안 배 양하였고, 생존율 (%) 계산은 1 일 동안 배양한 대조군의 생세포수를 100 % 로 했을 때 실험군에 생세포수를 비율로 나타낸 것이다. 세포 배양기간에 상 관없이 실험군의 스캐폴드내 세포생존율이 대조군의 스캐폴드내 세포생존율 에 비해 통계적으로 유의하게 더 높음을 알 수 있었고, 세포 배양기간이 증 가됨에 따라 세포생존율이 증가되는 경향이 있었다. 결론적으로 3차원 PCL 스캐폴드의 표면형상이 MC3T3-E1 세포의 증식에 영향을 미치고 있다는 사 실을 알 수 있었다(Declercq 등, 2013).

Fig.7은 대조군의 round type strut 3차원 PCL 스캐폴드와 실험군의 notch type strut 3차원 PCL 스캐폴드 표면에 대한 MC3T3-E1 세포의 ALP 활성도 를 관찰한 결과이다. 관찰결과 4일째에서는 두 그룹간의 차이가 나지 않았지 만, 8일째에서 notch type strut 3차원 PCL 스캐폴드 그룹에서 MC3T3-E1 세포의 ALP 활성도가 증가한 것을 확인할 수 있었다.(*<0.05, **P<0.01)

Fig. 8은 MC3T3-E1 세포의 live and dead cell 사진을 나타낸 것이다. 이

실험을 통해서는 살아있는 세포는 녹색으로 죽은 세포는 빨간색으로 표시가 되어 육안으로 확인할 수 있다. 두 그룹에서 거의 모든 세포가 살아있었으며, 특히 notch type의 그룹에서 현저하게 많은 세포가 살아 있는 것을 확인 할 수 있다. 따라서 3차원 PCL 스캐폴드의 표면개질 방법은 세포의 부착과 성 장에 효과를 나타냄을 알 수 있다(Lee 등 2014).

Fig. 5. SEM micrographs of the MC3T3-E1 cell seeded on (a1-3) round strut scaffold and (b1-3) notch strut scaffold for 2 hrs.

Fig. 6. The proliferations of MC3T3-E1 cell seeded on round strut scaffold and notch strut scaffolds for 1, 3, and 5 days. (*P<0.05,

**P<0.01)

Fig. 7. ALP activity of the MC3T3-E1 cell seeded on round strut scaffold and notch strut scaffold s for 4 and 8 days.

Fig. 8. Fluorscence images of the MC3T3-E1 cell seeded on round strut and notch strut scaffold for 2 days.

제 4 장 고찰

현재 생체 조직공학 분야에서 조직공학용 지지체로 사용되는 대표적인 천연 고분자로는 alginate, chitosan, collagen등이 있으며, 합성 고분자로는 Poly lactic acid, Poly glycolic acid, Polydioxanone, Poly -caprolactone (PCL)등이 있다(유지 등, 2010). 그중 본 연구에서 사용된 polycaprolactone (PCL)은 많은 장점을 가지고 있어 현재 널리 사용되고 있다. 하지만, 소수성 을 지니고 있고, 초기의 세포 부착이 어려워 초기 세포 파종 효율이 매우 떨 어지는 단점을 가지고 있다(Sun 등, 2006). 이런 단점들을 보완하기 위해 스 캐폴드 표면의 물리적 또는 화학적인 표면개질이 필수적으로 필요하다. 생체 재료의 표면개질은 재료표면의 물리적, 화학적 특성을 변화시키는 것으로 생 체 적합성, 젖음성, 마모, 그리고 부식저항성을 향상시키고자 할 때 주로 수 행된다(Chu, 2013; Kingshott 등, 2011). 현재까지 다양한 생체재료의 지지 체에 대한 연구는 활발이 이루어지고 있다. 생체재료의 제작 방법으로는 크 게 전통적인 방법(traditional methods)과 SFF (solid freeform fabrication)방법으로 나눌 수 있으며, 대표적인 전통 방법으로는 염추출법 (particulate leaching), 상분리법(phase separation), 이산화 탄소를 이용 한 고압기체 팽창법(high pressure gas saturation), 유화동결 건조법 (Emulsion freeze drying), 섬유 압착법(Fiber bonding)등이 있으며(Lo 등, 1995; Mooney 등, 1996; Kang 등, 1999), SFF 방법으로는 SLA (stereo lithography), SLS (selective laser sintering), electro-spining, 3D 프린 팅 (3D-printing), 3D 플로팅 (3D-plotting) 등이 있다(Hollister 등, 2005;

Williams 등, 2005; Lohfeld 등, 2010; Shuai 등, 2013; Tan 등, 2003;

Rimell 등, 2000; Shuai 등, 2011; Seitz 등, 2005; Lee 등, 2011; Luo 등, 2013; Son 등, 2008).

본 연구에서 사용된 3차원 PCL 스캐폴드는 쾌속조형기반(Rapid Prototyping: RP) 기법중 하나인 fused deposition modeling (FDM) 3차원 바 이오 플로팅 시스템 기술을 이용하여 제작되어 물리적 표면개질이 이루어졌 고, 이러한 스캐폴드 형상에 따른 조골모세포인 MC3T3-E1 세포의 부착과 증

식에 대한 연구를 하였다. Bettahalli 등은 고분자 스캐폴드의 strut의 표 면이 굴곡이 질수록 세포의 부착 및 증식이 향상되었다고 연구결과를 보고하 였다. (Bettahalli 등, 2013)

현재까지 진행이 이루어진 연구들을 미루어볼 때, 3차원 PCL 스캐폴드의 표 면형상은 세포상호간에 아주 중요한 역할을 하는 것으로 생각이 되며, 주름 진 표면은 조골모세포의 부착 및 증식에 긍정적인 영향을 끼칠 것으로 사료 된다.

제 5 장 결론

3차원 바이오 플로팅 시스템 기술로 제조된 round type strut 3차원 스캐폴 드와 notch type strut 형태의 3차원 PCL 스캐폴드의 표면특성 및 생물학적 평가를 관찰하였고, MC3T3-E1 세포를 이용하여 세포의 부착 및 증식을 조 사하여 다음과 같은 결과를 도출하였다.

(1) 본 연구에서 사용된 3차원 PCL 스캐폴드는 FDM 방식의 3차원 프린팅 기법으로 제작하였다.

(2) 제작된 3차원 PCL 스캐폴드는 이전의 스캐폴드에 비하여 기공 상호간의 연결성이 좋은 것을 확인하였다.

(3) 표면분석결과 notch type의 3차원 스캐폴드에서 일정한 간격으로 주름이 지어진 형태를 알 수 있었다.

(4) Round type의 3차원 PCL 스캐폴드에 비해, notch type의 3차원 PCL 스캐폴드는 굴곡진 표면형태로 인하여 세포부착 환경이 우수하여 보다 높은 세포의 부착과 증식을 확인하였다.

결론적으로 본 연구에서 사용된 notch type strut의 3차원 PCL 스캐폴드의 제작은 조골모세포의 부착 및 증식에 효과적 이였으며, 생체재료의 발전에 유용한 기술로 사료된다.

참고문헌

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