식중독 세균에 대한 소목 추출물의 항균 활성김이슬

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식중독 세균에 대한 소목 추출물의 항균 활성

김이슬․심혜미․김광엽 충북대학교 식품생명공학과

Antimicrobial Effect of Caesalpinia sappan L. Extract on Foodborne Bacteria

Yi-Seul Kim, Hye-Mee Shim, and Kwang-Yup Kim

Department of Food Science and Biotechnology, Chungbuk National University

ABSTRACT To develop a natural antimicrobial agent, we investigated the antimicrobial activities of 13 species of edible herbal plant extracts against major Gram-positive foodborne bacteria. Among the 13 screened edible herbal plants, Caesalpinia sappan L. showed the highest antimicrobial activity. In the paper disc agar diffusion assay, Caesalpinia sappan L. extracts had strong antibacterial activities against most Gram-positive bacteria but did not have antibacterial activities against most Gram-negative bacteria. Minimum inhibitory concentrations of the ethanol extract were 0.06 mg/mL against Clostridium difficile and Listeria monocytogenes and 0.03 mg/mL against Staphylococcus aureus. Their inhibitory activities were not reduced by heat treatment or pH adjustment against C. difficile, L. mono- cytogenes, and S. aureus. Antimicrobial activities were higher in ethanol extract than in distilled water extract. These results support the potential use of Caesalpinia sappan L. ethanol extract as an antimicrobial agent or functional food components against Gram-positive bacteria.

Key words: Caesalpinia sappan L., antimicrobial effect, Clostridium difficile, Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus

Received 5 February 2016; Accepted 27 May 2016

Corresponding author: Kwang-Yup Kim, Department of Food Sci- ence and Biotechnology, Chungbuk National University, Cheongju, Chungbuk 28644, Korea

E-mail: [email protected], Phone: +82-43-261-2568

서 론

평균 수명의 연장과 더불어 성인병 발생이 더욱 증가하고 있고, 생활환경의 변화와 함께 건강에 대한 관심도 더욱 고 조되고 있다. 세계적인 이상 기후 현상으로 인해 간단한 먹 거리에서부터 각종 식량 자원의 공급 등이 불안정해지고 있 고, 이로 인해 해외에서 값싼 식품 재료 등의 수입을 점차 증가시키고 있다. 축산물을 수입하는 경우 이들의 유통 기한 과 저장 등의 과정 중 콜레라, 이질 및 각종 식중독 유발 미생물 등의 오염이 일어날 확률이 높아지고 있으며, 기타 수입 식품의 범람으로 우리의 식탁이 여러 가지 위생학적인 위험성에 노출되어 있다(1). 우리나라 식중독 발생의 경우 주 원인균으로 살모넬라균이나 포도상구균, 세균성이질균 등을 들 수 있는데(2), 인간은 이와 같은 식중독 유발 세균을 통제하기 위해 수많은 항생물질을 개발했다. 그러나 최근 화학 합성 항생제에 내성을 가지는 균주가 증가함으로써 새 로운 문제로 대두하고 있으며, 이를 극복할 수 있는 새로운 천연 항생물질의 개발이 요구되고 있다. 즉 기존의 항생제와 는 다른 작용 메커니즘을 통하여 항생제 내성 균주에 항균

효과를 나타내야 하며, 사용 후 분해가 잘 되어 체내나 자연 계에서 잔류성의 위험이 없는 환경친화적 항균제 개발이 필 요하다(3-5).

천연물질의 경우 일부 미생물 유래 천연물질을 제외하고 대부분이 그 항균 효과를 검정하는 데 그치고 있으며 실제 실생활에 응용되어 상품화된 것은 그리 많지 않다. 이는 일 부 물질의 경우 인체에 대한 안정성을 확보해야 하는 문제점 이 있을 수 있겠으며 그 유효 물질을 추출 정제하는 과정에 많은 시간과 노력을 해야 하기 때문으로 생각된다. 한편 다 양한 천연물질 중에서도 식물체, 특히 식용으로 이용되어 온 약용식물의 경우 항균 효과뿐만 아니라 다양한 생리활성 을 가지고 있어 이를 굳이 정제하거나 순수 분리하는 과정을 거치지 않고도 식품에 직접 첨가가 가능할 것으로 생각되며, 그 경우 항균 효과뿐만 아니라 인체에 유용한 다양한 생리활 성을 동시에 얻는 효과가 있을 것으로 생각된다(6).

소목(Caesalpinia sappan L.)은 인도, 말레이시아, 중국 남부 등의 열대 아시아에 분포하는 낙엽 관목의 콩과(Legu- minosae) 식물로 밝은 홍색을 띠는 심재를 약용 및 홍색염 료로 사용한다.

소목 추출물에 관한 생리활성 연구로는 항통증(analge- sic), 항염증(antiinflammatory)(7), 조혈강장(blood tonic), 거담(expectorant), 통경(emmenagogue)(8), 진정(spasmolytic activity), 항경련(anticonvulsant), 진경(spasmo-

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Table 1. List of herbal plants used for experiments Scientific name (abbreviation) Used part Therminalia chebula Retz (Tc)

Rosa laevigata Michx (Rl)

Platycodon grandiflorum ADC (Pg) Ledebouriella seseloides Wolff (Ls) Rubus coreanus Miquel (Rc) Caesalpinia sappan L. (Cs) Rhus javanica (Rj)

Forsythia koreana Nakai (Fk) Achyranthes japonica Nakai (Aj) Myristica fragrans Houtt (Mf) Citrus aurantium L. (Ca)

Phellodendron amurense Ruprecht (Pa) Siegesbeckia glabrescens Makino (Sg)

Fruit Fruit Root Root Fruit Wood

Fruit Fruit Root Fruit Fruit Root Whole lytic activity)(9), 혈관이완(vasorelaxation)(10), 항동맥

경화(antiatherogenic), 항보체활성(anticomplementary) (11), 면역조절(immunomodulation)(12), 면역작용의 유도 (induction of immmunomodulation)(13), 항균(antimicrobial)(14,15), 세포독성(cytotoxic)(16,17), 항바이러스 (antiviral)(18), 혈당저하(hypoglycemic)(19,20), 항산화 효과(antioxidation)(21) 등이 보고되었다.

소목의 주성분 가운데 약 2%를 차지하는 염료성 화합물 은 무색의 flavonoid 구조를 갖는 brazilin이며, 이는 공기 중에 산화되어 brazilein이 된다. Brazilin은 Benz(b)-ind- eno(2,1-d)pyran 유도체로 주로 염료나 산 및 알칼리 지시 약 또는 식품첨가물 등으로 사용해 왔다. 또한, 한방에서 brazilin은 타박 손상에 의한 어혈, 월경통, 월경폐색, 현훈, 출산 후 각종 증상에 사용해 왔다(22-24). Moon 등(25)은 brazilin이 고혈압에 효과가 있음을 보고하였고, Hwang 등 (26)은 brazilin이 혈소판에서 칼슘농도를 조절함을 보고하 였으며, Kim 등(27)은 혈액에서 brazilin의 혈당저하 작용을 보고하였다. 또한, Kwon 등(28)은 brazilin이 식중독의 주 된 원인균일 뿐만 아니라 화농성 질환의 원인균인 Staphy- lococcus aureus와 치아우식증을 유발하는 Streptococcus mutans에 대해 항균 효과가 있다고 보고하였다.

본 연구에서는 식용 가능한 약용식물 중 문헌조사를 통해 항균 효과가 알려진 13가지의 약용식물을 선정하여 미생물 에 대해 생육을 억제하는 효과를 알아보고, 가장 높은 활성 을 갖는 소목 추출물의 미생물에 대한 기초자료 확보와 이러 한 소목 추출물의 효능을 이용한 천연 항균제제 또는 기능성 식품을 상품화하기 위한 기초자료로 사용하고자 한다.

재료 및 방법

실험재료

본 연구에 사용된 13종의 약용식물은 서울 경동시장 약재 상가에서 구입하여 사용하였다. 항생제로는 vancomycin- HCl(Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA)을 구입하여 대조군으로 사용하였다. 실험에 사용된 13종의 시료들은 Table 1에 나타내었다. 시료의 용매는 75% 에탄올을 사용 하였으며 25°C에서 24시간 200 rpm으로 교반 추출하였다.

추출된 시료들은 paper disc agar diffusion method와 broth micro-dilution method를 통해 항균 활성을 검색하였고, 13종의 시료 중 소목의 75% 에탄올 추출물이 강한 항균 활성을 나타내어 소목을 선발하여 실험에 사용하였다.

사용균주 및 배지

본 연구에서는 한국생물자원센터(Jeongeup, Korea)에 서 분양받은 Clostridium difficile KCTC 5009, Clostrid- ium perfringens KCTC 3269, Eubacterium limosum KCTC 3266, Bacteroides fragilis KCTC 3688, Bifido- bacterium bifidum KCTC 3472, Lactobacillus acid-

ophilus KCTC 3164, Lactobacillus lactis KCTC 3926, Streptococcus thermophilus KCTC 2190, Enterobacter aerogenes KCTC 2190, Escherichia coli KCTC 1039, Pseudomonas aeruginosa KCTC 2004, Salmonella Ty- phimurium KCTC 2515, Salmonella Enteritidis KCTC 12021, Staphylococcus aureus KCTC 1916과 한국미생 물보존센터(Seoul, Korea)에서 분양받은 Leuconostoc mesenteroides ATCC 8293, Listeria monocytogenes ATCC 19115와 충북대학교 식품공학과 식품미생물학 실험실에서 자체 보유하고 있는 Bifidobacterium adolescentis, Lac- tobacillus fermentum YL-3을 실험에 사용하였다. 전배양 및 본배양을 위한 생육배지로 장내유해균은 Reinforced Clostridial Medium(RCM) broth(Difco, Detroit, MI, USA), 유산균은 Lactobacilli MRS broth(Difco), 그 외의 균은 Tryptic soy broth(Difco)를 사용하였다. 이들 균주는 50%

글리세롤이 포함된 배지에 넣어 -80°C에 보관하여 사용하 였으며, 실험에 사용하기 전 3회 이상 계대 배양하여 활성화 한 후 사용하였다.

시료 추출 및 분획

시료 25 g에 20배의 75% 에탄올과 증류수를 각각 가하여 교반 추출기(VS-8480, Vision Scientific Co., Ltd., Seoul, Korea)에서 25°C로 24시간 동안 200 rpm으로 추출하여 여과지(Whatman No. 3, GE Healthcare, Buckingham- shire, UK)로 여과한 다음 회전진공농축기(EYELA CCA- 1110, Tokyo Rikakikai Co., Tokyo, Japan)를 이용하여 40°C에서 용매를 완전히 제거한 후 추출물로 사용하였다.

제조된 각각의 에탄올, 열수 추출물을 50 mL로 정용하여 분획깔때기에 넣고 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트 및 부 탄올을 150 mL씩 3회 순차적으로 가하여 분획한 후 각각의 용매 분획물을 얻은 다음 최종 남은 용액을 물 분획물로 하 였다. 각각의 용매 분획물들은 질소 농축 및 감압 농축한 다음 실험에 사용하였다.

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Table 2. Antimicrobial activity of Caesalpinia sappan L. 75% ethanol extract and distilled water extract by the paper disc agar diffusion method

Strains

Caesalpinia sappan L.

75% ethanol extract Caesalpinia sappan L.

distilled water extract

50 mg/mL 100 mg/mL 200 mg/mL 50 mg/mL 100 mg/mL 200 mg/mL Clostridium difficile KCTC 5009

Clostridium perfringens KCTC 3269 Bacteroides fragilis KCTC 3688 Eubacterium limosum KCTC 3266 Bifidobacterium adolescentis Bifidobacterium bifidum KCTC 3472 Lactobacillus acidophilus KCTC 3164 Lactobacillus lactis KCTC 3926 Lactobacillus fermentum YL-3

Leuconostoc mesenteroides ATCC 8293 Streptococcus thermophilus KCTC 3658 Enterobacter aerogenes KCTC 2190 Escherichia coli KCTC 1039 Listeria monocytogenes ATCC 19115 Pseudomonas aeruginosa KCTC 2004 Salmonella Enteritidis KCTC 12021 Salmonella Typhimurium KCTC 2515 Staphylococcus aureus KCTC 1916

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1)Growth inhibition size of clear zone: －, not detected; +, smaller than 8∼12 mm; ++, 12∼16 mm; +++, 16∼20 mm; ++++, 20∼25 mm; +++++, large than 25 mm.

Paper disc agar diffusion method

항균 활성 검색은 paper disc agar diffusion 법(29)을 응용하였다. 10⁵CFU/mL로 배양된 시험 균주들을 멸균된 각각의 agar 배지에 2~3% 접종하여 배지를 조성하였다.

여기에 paper disc를 배지 위에 떨어지지 않도록 부착시킨 후 농도가 50, 100, 200 mg/mL인 시료의 추출물을 30 μL 주입하여 배양장치(BF-250IN, BioFree, Seoul, Korea)에 넣고 37°C에서 24시간 배양한 다음 생육 억제환 생성 유무를 확인하였다. 추출물을 녹인 용매에 대한 영향을 알아보기 위해 대조군으로는 30% DMSO를 사용하였다.

최소저해농도(minimum inhibitory concentration, MIC) 측정

미생물의 최소저해농도는 broth micro-dilution method (30)를 응용하여 다음과 같이 측정하였다. 18~24시간 배양 된 세균 배양액을 650 nm에서 흡광도가 0.3이 되게 조절한 후 96 well plate에 각 시험균 배양액을 100 μL씩 분주하고, 시료 추출물을 최고농도 20 mg/mL에서부터 2배씩 희석하 여 최저농도로 100 μL씩 처리하여 24시간 배양한 후 시료 추출물이 세균의 증식에 미치는 영향을 650 nm에서 ELISA Reader를 통해 측정하여 비교 분석하였다.

열 및 pH 안정성 측정

소목 추출물의 항균 활성 물질에 대한 열 안정성 측정은 시료를 60, 80, 100°C에서 30분 동안 열처리하고 121°C에 서는 15분 열처리한 후 대조구와 같이 paper disc agar diffusion 법으로 생육 억제환의 지름을 측정하여 비교하였고,

대조구로는 열처리하지 않은 소목 추출물을 사용하였다.

pH 안정성은 pH meter를 사용하여 시료를 0.1 N HCl과 0.1 N NaOH로 pH 2, 4, 8로 조절한 후 대조구와 같이 paper disc agar diffusion 법으로 생육 억제환의 지름을 측정 하여 비교하였고, 대조구로는 0.1 N HCl, 0.1 N NaOH와 pH를 조절하지 않은 소목 추출물을 사용하였다.

결과 및 고찰

Paper disc agar diffusion method에 따른 항균 활성 소목의 75% 에탄올 추출물과 열수 추출물을 각각 200 mg/mL, 100 mg/mL, 50 mg/mL의 농도로 하여 paper disc agar diffusion assay로 항균 활성을 검색한 결과는 Table 2에 나타내었다. 그람 양성균인 C. difficile KCTC 5009, L.

monocytogenes ATCC 19115와 S. aureus KCTC 1916 은 소목의 75% 에탄올 추출물의 처리구에서 열수 추출물보 다 강한 항균 활성 효과를 나타내었고 추출물의 농도가 높아 질수록 높은 항균 활성을 보였다. 소목의 열수 추출물의 처 리구에서는 항균 활성 효과가 나타났으나 75% 에탄올 추출 물보다는 그 항균 활성이 적었다. 특히 그람 양성균인 C.

difficile KCTC 5009, L. monocytogenes ATCC 19115와 S. aureus KCTC 1916은 소목의 75% 에탄올 추출물 50 mg/mL의 처리구에서도 다른 식중독 세균과는 달리 억제환 의 크기가 20 mm 이상의 항균 활성 효과를 나타내었다(Fig.

1). Shin 등(31)은 소목의 에탄올 추출물에 대해 S. aureus 와 L. monocytogenes에서 가장 뛰어난 항균 활성을 나타 내었고 에탄올 추출물의 첨가 농도에 관계없이 생육이 정지

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2 3 C 1

A B

C 1

2 3

Fig. 1. Antimicrobial activity of Caesalpinia sappan L. 75%

ethanol extract on L. monocytogenes ATCC 19115 (A) and S. aureus KCTC 1916 (B). C, Control (30% DMSO); 1, 50 mg/mL extract; 2, 100 mg/mL extract; 3, 200 mg/mL extract.

된 상태를 보이다가 10 ppm 첨가 후 배양 48시간이 되어서 야 비로소 증식한다는 것을 보고했다. 이것은 본 실험에서 L. monocytogenes ATCC 19115와 S. aureus KCTC 1916이 소목 에탄올 추출물에서 우수한 항균 효과를 보인 것과 유사한 결과를 보였다. 반대로 그람 음성균인 E. coli KCTC 1039, Sal. Enteritidis KCTC 12021, Sal. Typhi- murium KCTC 2515에서는 소목의 75% 에탄올 추출물과 열수 추출물 처리구 모두에서 항균 활성 효과가 나타나지 않았다. Kwon과 Park(32)의 실험에서 그람 음성균인 E.

coli와 Sal. Typhimurium에 대해 오미자 추출물의 항균 활 성이 나타나지 않았고, Kwon 등(33)의 실험에서도 그람 음 성균보다 그람 양성균에 대해 높은 활성을 보였다는 결과와 일치하였다. 하지만 본 실험의 결과와는 달리 Chang과 Choi (34)는 소목 에탄올 추출물에서 E. coli에 대해 5 mg/mL 수준에서 항균 활성을 나타내었는데 이는 사용한 균주의 차 이로 생각되며, 또한 Park 등(35)은 항균성 물질을 추출할 때 추출 온도, 용매 농도 및 용매의 종류에 따라 항균력이 차이가 난다고 하였다. 이를 통하여 소목 에탄올 추출물이 특히 그람 양성균인 C. difficile KCTC 5009, L. monocytogenes ATCC 19115와 S. aureus KCTC 1916에 대해 우수 한 항균 활성을 나타내 항균제제로 활용할 가능성이 있다고 판단된다.

이에 더하여 소목 추출물의 헥산, 클로로포름, 에틸아세 테이트, 부탄올 및 물 분획물들에 대하여 항균 활성을 검색 하였다. 각 분획물을 50 mg/mL의 농도로 하여 paper disc agar diffusion assay로 항균 활성을 검색한 결과 75% 에탄 올 추출물의 분획물의 경우 그람 양성균인 C. difficile KCTC 5009는 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부탄올 층에서, L. monocytogenes ATCC 19115는 클로로포름, 에틸아세 테이트, 부탄올 층에서, S. aureus KCTC 1916은 헥산, 클 로로포름, 에틸아세테이트, 부탄올 층에서 억제환이 생성되 어 항균 활성을 나타내었고, 열수 추출물의 분획물의 경우 C. difficile KCTC 5009는 부탄올 층에서, L. monocytogenes ATCC 19115는 에틸아세테이트, 부탄올 층에서, S.

aureus KCTC 1916은 에틸아세테이트, 부탄올 층에서 억

제환이 생성되어 항균 활성을 나타내었다. 추출물의 결과와 같이 75% 에탄올 추출물의 분획물이 열수 추출물의 분획물 보다 높은 항균 활성을 나타내었다. 그람 음성균인 E. coli KCTC 1039, Sal. Enteritidis KCTC 12021, Sal. Typhi- murium KCTC 2515는 소목의 75% 에탄올 추출물과 열수 추출물 처리구 모두에서 항균 활성 효과가 나타나지 않았다.

이에 대한 결과는 Table 3, 4에 나타내었다.

일반적으로 식물의 에틸아세테이트 분획층에서는 사포닌 성분, 유기산류, 탄닌당, 배당체 및 기타 알칼로이드류가 주 로 용출되는 것으로 알려져 있고, phenol류 및 flavonoid 등의 성분이 용출되는 클로로포름 분획물에도 상당한 항균 력이 확인되었다고 하였다(36). Shin 등(31)은 소목의 에틸 아세테이트 분획층에서 10종의 유해균에 대해 뛰어난 항균 력을 보였다고 하였다. Kwon 등(28) 역시 소목의 에틸아세 테이트 분획층에서 식중독 유발 세균인 S. aureus와 치아우 식증의 주요 원인균인 Str. mutans에 대하여 강한 항균력을 보여주었고 그 항균 물질로 brazilin을 분리 동정하였다. 본 연구 결과에서는 소목의 클로로포름, 에틸아세테이트, 부탄 올 층에서 강한 항균 활성을 나타낸바 항균성 물질은 특정 용매에만 국한되어 용출되는 것이 아니라 여러 가지 성분이 복합적으로 작용하여 여러 용매에도 용출될 수 있음을 암시 해 주었다.

Vancomycin과의 항균 활성 비교

그람 양성균과 관련된 경험적 치료에 사용되는 현재까지 가장 강력한 항생제로 알려진 vancomycin과의 항균 활성을 비교한 결과 50 mg/mL 농도에서 소목 75% 에탄올 추출물 의 항균 활성은 vancomycin 2.5 mg/mL를 사용하였을 때 와 유사한 항균 활성을 나타냈고, 소목 열수 추출물의 항균 활성은 C. difficile KCTC 5009, L. monocytogenes ATCC 19115에서는 vancomycin 0.04 mg/mL, S. aureus KCTC 1916에서는 vancomycin 1.3 mg/mL를 사용하였을 때와 항균 활성이 유사하게 나타났다(Table 5). 이러한 결과로 소목 에탄올 추출물은 vancomycin보다 낮은 항균 활성을 보였지만 그람 양성균에 대한 항균 활성이 우수하다고 할 수 있으며 vancomycin과 같은 항생제에 내성을 가진 식중 독 원인균에 대해서도 천연 항균제로서의 적용 가능성을 기 대한다.

최소저해농도

소목의 에탄올 추출물을 가지고 미생물에 대한 최소저해 농도를 측정한 결과는 Table 6에 나타내었다. C. difficile KCTC 5009, L. monocytogenes ATCC 19115의 최소저 해농도는 0.06 mg/mL였고, S. aureus KCTC 1916에 대한 최소저해농도는 0.03 mg/mL였다. Jung 등(37)의 연구 결 과에 따르면 vancomycin의 유효혈청농도는 0.005~0.04 mg/mL로 보고하였는데, 본 실험 결과 정제되지 않은 소목 에탄올 추출물이 vancomycin에 견줄만한 항균 활성을 나타

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Table 3. Antimicrobial activity of solvent fractions of Caesalpinia sappan L. 75% ethanol extract by the paper disc agar diffusion method

Strains Hexane fraction (50 mg/mL)

Chloroform fraction (50 mg/mL)

Ethyl acetate fraction (50 mg/mL)

Butanol fraction (50 mg/mL)

Water fraction (50 mg/mL) Clostridium difficile KCTC 5009

Clostridium perfringens KCTC 3269 Bacteroides fragilis KCTC 3688 Eubacterium limosum KCTC 3266 Bifidobacterium. adolescentis Bifidobacterium bifidum KCTC 3472 Lactobacillus acidophilus KCTC 3164 Lactobacillus lactis KCTC 3926 Lactobacillus fermentum YL-3

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1)Growth inhibition size of clear zone: －, not detected; +, smaller than 8∼12 mm; ++, 12∼16 mm; +++, 16∼20 mm; ++++, large than 20 mm.

Table 4. Antimicrobial activity of solvent fractions of Caesalpinia sappan L. distilled water extract by the paper disc agar diffusion method

Strains Hexane fraction (50 mg/mL)

Chloroform fraction (50 mg/mL)

Ethyl acetate fraction (50 mg/mL)

Butanol fraction (50 mg/mL)

Water fraction (50 mg/mL) Clostridium difficile KCTC 5009

Clostridium perfringens KCTC 3269 Bacteroides fragilis KCTC 3688 Eubacterium limosum KCTC 3266 Bifidobacterium adolescentis Bifidobacterium bifidum KCTC 3472 Lactobacillus acidophilus KCTC 3164 Lactobacillus lactis KCTC 3926 Lactobacillus fermentum YL-3

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내는 것을 알 수 있었다. 이러한 결과는 Choi 등(38)의 소목 에탄올 추출물의 항균 활성에 대한 연구에서 S. aureus에 대한 MIC를 측정한 결과 1.2 mg/mL, Lee와 Min(39)이 소 목 메탄올 추출물에서 S. aureus, L. monocytogenes에 대 한 MIC를 측정한 결과 각각 1.563 mg/mL, 1.563 mg/mL보 다 낮은 농도에서 높은 항균 활성을 나타냄을 알 수 있었다.

소목의 열수 추출물을 가지고 미생물에 대한 최소저해농 도를 측정한 결과는 Table 7에 나타내었다. C. difficile KCTC 5009, L. monocytogenes ATCC 19115의 최소저해농도 는 1.00 mg/mL였고, S. aureus KCTC 1916에 대한 최소저 해농도는 0.50 mg/mL였다.

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Table 5. Antimicrobial activity of vancomycin by paper disc agar diffusion method Clostridium difficile

KCTC 5009 Listeria monocytogenes

ATCC 19115 Staphylococcus aureus KCTC 1916 2.5 mg/mL

1.3 mg/mL 0.65 mg/mL 0.33 mg/mL 0.16 mg/mL 0.08 mg/mL 0.04 mg/mL

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EtOH extract (50 mg/mL) ++++ ++++ ++++

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Table 6. Minimum inhibitory concentration (MIC) of 75% ethanol extract of Caesalpinia sappan L.

Strain Growth of various concentration (mg/mL)

20.00 10.00 5.00 2.50 1.00 0.50 0.25 0.13 0.06 0.03 0.02 0 MIC Clostridium difficile KCTC 5009

Clostridium perfringens KCTC 3269 Bacteroides fragilis KCTC 3688 Eubacterium limosum KCTC 3266 Bifidobacterium adolescentis

Bifidobacterium bifidum KCTC 3472 Lactobacillus acidophilus KCTC 3164 Lactobacillus lactis KCTC 3926 Lactobacillus fermentum YL-3

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－ + + + + + + + + + + + + + + + + + +

+ + + + + + + + + + + + + + + + + +

0.06 0.06 1.00 0.50 1.00 1.00 1.00 2.50 1.00 0.50 0.25 2.50 0.50 0.06 1.00 2.50 2.50 0.03

1)No growth. ²⁾Growth.

열 및 pH 안정성

식품 등의 제조 시에는 일련의 공정에서 열처리와 pH의 변화를 수반하기도 한다. 때로는 이러한 열처리 및 pH의 변 화로 인하여 유효성분들이 분해되는 문제가 발생하며 공정 상의 제약 요인이 된다. 따라서 소목의 75% 에탄올 추출물과 열수 추출물의 열 및 pH에 대한 안정성을 조사하였다(40).

소목 75% 에탄올 추출물과 소목 열수 추출물을 가지고 열 안정성을 측정한 결과는 Table 8과 같다. 시료를 60°C, 80°C, 100°C에서 30분, 121°C에서 15분간 열처리한 후 항균력을 살펴본 결과 C. difficile KCTC 5009, L. monocytogenes ATCC 19115, S. aureus KCTC 1916에 대한 항균력은 60°C, 80°C, 100°C, 121°C에서 모두 대조구와 비슷하게 억제환이 생성되어 소목 추출물의 항균성 물질은 열에 대체로 안정한 결과를 보여주었다.

소목 75% 에탄올 추출물과 소목 열수 추출물을 가지고 pH 안정성을 측정한 결과는 Table 9와 같다. 시료를 pH

2, 4, 8로 조정한 후 항균력을 살펴본 결과 0.1 N HCl(pH 1.06)과 0.1 N NaOH(pH 12.93)에 대해서는 영향을 받지 않았고, 항균력은 C. difficile KCTC 5009, L. monocytogenes ATCC 19115, S. aureus KCTC 1916에서 모두 pH 를 조절하지 않은 소목 추출물의 결과와 비슷하게 억제환이 생성되었다. 소목 추출물의 항균성 물질은 pH에 대체로 안 정한 결과를 보여주었으며 본 결과로 열 및 pH의 변화에 안정적인 소목 추출물에 함유된 항균물질을 이용하여 기능 성 식품의 소재 및 식품의 제조 공정에 적합한 첨가물로서도 유용하게 이용될 수 있다고 기대된다.

요 약

본 실험은 식용 가능한 약용식물을 대상으로 하여 항균 활성 을 검색하였다. 미생물에 대하여 약용 식물을 50 mg/mL, 100 mg/mL, 200 mg/mL의 농도로 하여 paper disc agar

(7)

Table 7. Minimum inhibitory concentration (MIC) of distilled water extract of Caesalpinia sappan L.

Strain Growth of various concentration (mg/mL)

20.00 10.00 5.00 2.50 1.00 0.50 0.25 0.13 0.06 0.03 0.02 0 MIC Clostridium difficile KCTC 5009

Clostridium perfringens KCTC 3269 Bacteroides fragilis KCTC 3688 Eubacterium limosum KCTC 3266 Bifidobacterium adolescentis

Bifidobacterium bifidum KCTC 3472 Lactobacillus acidophilus KCTC 3164 Lactobacillus lactis KCTC 3926 Lactobacillus fermentum YL-3

－¹⁾

－

－ +

－ + + +

－

－ +

－

－ +

－ + + + + +

－ + + +

－ +²⁾

－ +

－ + + + + + + + + + + + + +

－ +

－ + + + + + + + + + + + + + + + +

+ + + + + + + + + + + + + + + + + +

1.00 0.25 1.00 0.50 1.00 1.00 5.00 1.00 5.00 2.50 5.00 5.00 5.00 1.00 2.50 2.50 5.00 0.50

1)No growth. ²⁾Growth.

Table 8. Heated stability of 75% ethanol extract and distilled water extract of Caesalpinia sappan L.

Strain Caesalpinia sappan L. 75% ethanol extract Caesalpinia sappan L. distilled water extract 60°C 80°C 100°C 121°C Control²⁾ 60°C 80°C 100°C 121°C Control³⁾ C. difficile

L. monocytogenes S. aureus

++++¹⁾ ++++

++++

+ ++

+++

+ ++

+++

+ ++

+++

+ ++

+++

+ ++

+++

2)Control: Not heated treatment on Caesalpinia sappan L. 75% ethanol extract.

3)Control: Not heated treatment on Caesalpinia sappan L. distilled water extract.

Table 9. pH stability of 75% ethanol extract and distilled water extract of Caesalpinia sappan L.

Strain

Caesalpinia sappan L. 75% ethanol extract Caesalpinia sappan L. distilled water extract pH 2 pH 4 pH 8 Control²⁾ 0.1 N

NaOH 0.1 N

HCl pH 2 pH 4 pH 8 Control³⁾ 0.1 N NaOH 0.1 N

HCl C. difficile

L. monocytogenes S. aureus

++++¹⁾ ++++

++++

－

－ + + ++++

+ + ++++

－

2)Control: not pH variation on Caesalpinia sappan L. 75% ethanol extract.

3)Control: not pH variation on Caesalpinia sappan L. distilled water extract.

diffusion assay로 항균 활성을 검색한 결과 소목 추출물에 서 가장 높은 항균 활성을 나타내었다. 이에 따라 소목의 에탄올 추출물과 열수 추출물을 각각 200 mg/mL, 100 mg/

mL, 50 mg/mL의 농도로 하여 paper disc agar diffusion assay로 항균 활성을 검색한 결과 소목 추출물은 그람 양성 균에서 높은 항균 활성을 나타내었고, 소목의 에탄올 추출물 이 소목의 열수 추출물보다 높은 항균 활성을 나타내었다.

소목 에탄올 추출물과 열수 추출물의 각 분획물을 50 mg/

mL의 농도로 하여 paper disc agar diffusion assay로 항균

활성을 검색한 결과 그람 양성균은 클로로포름, 에틸아세테 이트, 부탄올 층에서 항균 활성을 나타내었고, 그람 음성균 은 항균 활성을 나타내지 않았다. 소목의 항균 물질로 추정 되는 brazilin은 주로 에틸아세테이트 분획층에 존재하므로 소목 에탄올 추출물에서 클로로포름, 에틸아세테이트, 부탄 올의 항균 활성이 유사한 점으로 미루어 brazilin 외에도 다 양한 항균 물질이 존재하여 이들이 복합적으로 작용하여 항 균 활성을 나타내는 것으로 생각한다. 현재까지 가장 강력한 항생제로 알려진 vancomycin과의 항균 활성을 비교한 결과

(8)

50 mg/mL 농도에서 소목 75% 에탄올 추출물의 항균 활성 은 vancomycin 2.5 mg/mL를 사용하였을 때와 유사한 항 균 활성을 나타내었다. 소목의 추출물을 가지고 미생물에 대한 최소저해농도를 측정한 결과 C. difficile KCTC 5009, L. monocytogens ATCC 19115의 최소저해농도는 0.06 mg/mL였고, S. aureus KCTC 1916에 대한 최소저해농도 는 0.03 mg/mL였다. Vancomycin의 유효혈청농도는 0.005

~0.04 mg/mL로 견줄만한 항균 활성을 나타내었다. 소목 추출물을 가지고 열 및 pH 안정성을 측정한 결과는 항균력 은 C. difficile KCTC 5009, L. monocytogens ATCC 19115, S. aureus KCTC 1916에서 모두 대조구와 비슷하 게 억제환이 생성되어 소목 추출물의 항균성 물질은 열 및 pH에 대체로 안정한 결과를 보여주었다. 상기 결과들을 종 합해 볼 때 소목 에탄올 추출물이 그람 양성균에 대해 항균 활성이 뛰어난 것으로 보아 소목을 그람 양성의 병원성 미생 물을 억제하기 위한 항균제제 및 기능성 식품의 소재로써 활용할 수 있다고 판단된다.

감사의 글

이 논문은 2013년도 충북대학교 학술연구지원사업의 연구 비 지원에 의하여 연구되었음.

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