학 술 논 문
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CRISPR/Cas 진단의 원리와 현황
박지웅* · 강봉근 · 신화희 · 신준근
대구경북첨단의료산업진흥재단, 첨단의료기기개발지원센터, 진단의료기기팀
The Principle and Trends of CRISPR/Cas Diagnosis
Jeewoong Park*, Bong Keun Kang, Hwa Hui Shin and Jun Geun Shin
Medical Device Development Center, Daegu-Gyeongbuk Medical Innovation Foundation, Daegu 41061, Korea (Manuscript received 4 June 2021 ; revised 28 June 2021 ; accepted 30 June 2021)
Abstract: The POCT (point-of-care test) sensing that has been a fast-developing field is expected to be a next gen- eration technology in health care. The POCT sensors for the detection of proteins, small molecules and especially nucleic acids have lately attracted considerable attention. According to the World Health Organization (WHO), the POCT methods are required to follow the ASSURED guidelines (Affordable, Sensitive, Specific, User- friendly, Robust and rapid, Equipment-free, Deliverable to all people who need the test). Recently, several CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) based diagnostic techniques using the sensitive gene recognition function of CRISPR have been reported. CRISPR/Cas (Cas, CRISPR associated protein) systems based detec- tion technology is the most innovative gene analysis technology that is following the ASSURED guidelines.
It is being re-emerged as a powerful diagnostic tool that can detect nucleic acids due to its characteristics that enable rapid, sensitive and specific analyses of nucleic acid. The first CRISPR-based diagnosis begins with the discovery of the additional function of Cas13a. The enzymatic cleavage occurs when the con- jugate of Cas protein and CRISPR RNA (crRNA) detect a specific complementary sequence of the target sequence. Enzymatic cleavage occurs on not only the target sequence, but also all surrounding non-target single-stranded RNAs. This discovery was immediately utilized as a biosensor, and numerous sensor studies using CRISPR have been reported since then. In this review, the concept of CRISPR, the char- acteristics of the Cas protein required for CRISPR diagnosis, the current research trends of CRISPR diag- nostic technology, and some aspects to be improved in the future are covered.
Key words: CRISPR/Cas, Diagnosis, POCT, Nucleic acid
I. 서 론
현장 진단 기술은 급속히 발전하고 있으며 헬스케어에 있어서 진단 부문의 미래로 여겨지는 분야이다. 혈당 센서와 같은 현장진단 센서가 가장 널리 알려져 있고, 최근에는 단백질, 저분자 물질, 핵산 등에 대한 검출 기기가 개발되고 있다.
세계건강기구(World Health Organization, WHO)에서는
현장 진단은 ASSURED 가이드라인(Affordable, Sensitive, Specific, User-friendly, Robust and rapid, Equipment-free, Deliverable to all people who need the test) 을 따를 것을 권 고한다[1]. 가이드라인에 따르면 비전문가도 진단을 수행하고 결과를 판독할 수 있어야 한다.
이상적인 현장 진단은 검체에서부터 판독 신호 생성까지 의 단계가 최소화 되어야 하고, 전문인력이 아니더라도 분 석을 할 수 있어야 한다. 이를 위해서는 샘플 전처리, 표적 인식, 신호 획득이 하나의 장치에서 가능한 완전 분석이 가 능한 장치가 필요하다. 분석 시스템은 방법이 간단해야 하 고, 신호 판독이 가능한 미세 유체 칩과 종이 기반의 센서 또는 단일 튜브 반응 등으로 이루어 질 것이다.
크리스퍼(CRISPR, Clustered Regularly Interspaced
*Corresponding Author : Jeewoong Park
Medical Device Development Center, Daegu-Gyeongbuk Medical Innovation Foundation, Daegu 41061, Korea
Tel: +82-53-790-5592 E-mail: [email protected]
이 성과는 정부(과학기술정보통신부)의 재원으로 한국연구재단의 지원을 받아 수행된 연구임(No.2021R1F1A1051971) (No.2021R1A2C2013396).
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Short Palindromic Repeats) 유전자 가위 기반의 검출 기 술은 현장 진단에 활용될 수 있는 가장 혁신적인 유전자 분 석 기술로서, 최근 5년간 CRISPR/Cas 시스템은 자체의 민 감도, 특이도, 유연함, 단순함 등의 특징으로 인해 핵산을 검 출할 수 있는 강력한 진단 도구로 재조명을 받고 있다.
최초의 크리스퍼 진단은Cas13a의 부수적 서열 절단 활 성의 발견에서 시작된다. 이는 Cas 단백질과 CRISPR RNA (crRNA) 과의 결합체가 표적 서열과 특이적 상보 서열을 이 루면 나타나는 효소적 절단을 이용한다. 효소적 절단 대상은 표 적 서열 뿐만 아니라 표적이 아닌 주변의 모든 단일 가닥 RNA 가 된다[2]. 이 발견은 바로 바이오 센서로 활용 되었 으며[3] 최초로 적용 가능한 형태로 개발된 검출 기술이 SHERLOCK(specific high-sensitivity enzymatic reporter unlocking)이다[4]. 이는 표적물질과 결합하면 소강 상태였 던 형광 프로브 염기서열이 부수적으로 절단되는 원리를 이 용하는데, 원래의 표적 서열의 농도 대비 10,000 배 증폭된 효 과를 볼 수 있다. 이후 다양한 미생물 종으로부터 Cas9, Cas12, Cas13, Cas14 등 다양한 Cas 단백질을 동정하여 zM(10
-21M) 수준의 민감도와 특이도를 가진 검출 기술을 개 발하게 된다. 그리하여 크리스퍼 유전자 가위 기반의 검출 기술은 초고감도 핵산 검출에 있어서 최적의 대안이 되었다. 본 리뷰에서는 크리스퍼의 개념, 크리스퍼 진단에 필요한 Cas 단백질의 특성, 다양한 센싱 기술에 적용된 크리스퍼 진단기술 의 현황, 향후 개선 되어야 하는 점 들에 대해서 살펴본다.
II. 본 론
1. CRISPR/Cas의 개념
약 30여년 전, 최초의 CRISPR/Cas 시스템이 박테리아 유전체에서 보고된 이래로[5] CRISPR/Cas 시스템이 미생 물의 면역 시스템으로서, 외부의 핵산에 대한 방어적 기제를 가지고 있다는 사실이 밝혀졌다[6,7]. CRISPR/Cas 시스템은 바이러스나 플라스미드와 같은 침입 물질에 대한 박테리아나 고세균의 적응 면역 시스템으로, CRISPR/Cas 시스템의 주 요 목적은 박테리오페이지, 바이러스의 공격으로부터 박테 리아를 보호하는 것이다. 박테리아가 핵산에서 비롯된 감염 으로부터 생존하게 되면 Cas 단백질이 절단시킨 바이러스 DNA 의 정보를 크리스퍼 어레이에 추가한다. 박테리아는 이 제까지의 감염에 대한 정보를 저장하여 이후의 바이러스 감 염에 대항할 수 있게 된다.
적응 면역 기작에 따르면, 침입 물질에서 기인하는 짧은 조각(protospacer, 프로토스페이서라 칭함)이 반복적으로 크리스퍼 어레이에 통합되어 유전적 정보를 축적하고 이러 한 DNA 요소들이 crRNA로 전사되어 Cas 단백질과 복합 체를 만든다(그림 1). CRISPR/Cas 시스템은 하나의 Cas
단백질이 RNA 서열과 반응하여 구성한 리보핵 단백질 (RNP, Ribonucleoprotein) 을 활용한다. 이 RNP가 crRNA의 가이드 서열(spacer, 스페이서로 칭함)에 상보적인 표적 유 전자, 프로토스페이서를 식별하고 절단하게 된다.
리보핵 단백질의 RNA를 guide RNA(gRNA)로 칭하는데 이는 용도에 맞게 변경이 가능한 crRNA와 유전정보는 포 함하지 않은 상태로 RNA의 2차 구조에만 영향을 주는 부 분(tracrRNA)으로 이루어 진다. crRNA 의 스페이서 서열은 표 적 유전자의 프로토스페이서 서열에 맞게 상보적으로 설계를 할 수 있다. crRNA에 의해 표적 DNA에 대한 민감도와 특 이도가 결정된다. 유전정보를 포함하지 않은 tracrRNA는 gRNA 와 Cas 단백질 간의 결합에 영향을 주는데, gRNA와 Cas 단백질 간의 수소 결합과 aromatic stacking을 활용 한다[8]. gRNA와 단백질간의 상호작용은 단백질의 구조적 변화를 유도하며[9,10], 이 구조적 변화가 Cas 단백질을 활 성화 하게 된다. Cas 단백질의 활성화는 리보핵단백질을 형 성하고, crRNA와 상보적인 표적 서열을 스캔하여 효소적 절단을 수행한다.
또한 가지 CRISPR/Cas 시스템이 작동하기 위해서 고려 해야 할 사항은 PAM(protospacer adjacent motif) 이다. 단 백질의 활성화를 위해서는 Cas가 PAM 서열을 식별해야 한다.
PAM 서열은 표적 서열의 프로토스페이서 상에 위치하게 된다.
PAM 서열의 인식으로부터 CRISPR 시스템의 면역 기능이 시작되는 것이다.
기존의 제한 효소나 TALEN(Transcription activator- like effector nucleases) 이나 징크핑거 등의 유전자 편집 기술과는 달리, RNA의 인식에 의해 Cas 단백질이 절단을 하기 때문에, CRISPR/Cas 시스템은 다른 표적 유전자를 식별하도록 설계해야 하는 경우Cas 단백질은 그대로 유지 하고, 간단히 스페이서 서열을 재설계 하여 널리 활용을 할 수 있다.
다양한 Cas 단백질은 크기나 구조, 조성, 표적 물질의 면에서 차이를 보인다. CRISPR 연구에서는 여전히 새로운 Cas 단
그림 1. 이중 가닥 DNA를 인식하는 리보핵단백질
Fig. 1. Schematic of Ribonucleoprotein during the recognition of dsDNA
127 백질을 개발하고 최적화 시키려는 노력을 기울이고 있다.
종합적으로, 새로운 CRISPR/Cas 시스템은 고성능 진단 도구의 이상적 후보군이 된다. 크리스퍼 진단은 아직 초기 개발단계에 있으나 현장진단 기기로서의 잠재력은 단기간에 많은 논문으로 이미 검증 된 바 있다. 다음 장에는 크리스 퍼 진단의 큰 부분인 Cas 단백질에 대해서 알아본다.
2. Cas 단백질의 특성
본 장에서는 크리스퍼 유전자 가위 진단 기술에 있어서 Cas 단백질별 특성 및 검출 기술의 적용 사례를 중심으로 살펴 본다. CRISPR/Cas 시스템 및 Cas 단백질을 소개하고, 최근 개 발 내용을 설명하도록 한다.
(1) Cas9
Cas9 단백질은 이중 가닥 DNA를 표적으로 한다. Cas9 가 PAM 서열을 인식하면 표적 DNA의 이중나선이 풀리고, 스 페이서와 프로토스페이서의 상보적인 결합이 일어난다. 가 이드 RNA와 Cas9 단백질은 DNA 표적 유전자의 20개의 염기서열과 PAM 서열을 식별하고,이중 가닥 DNA를 절단 하게 된다[9,11]. Cas 단백질의 효소적 절단은 표적 유전자를 blunt-end 로 자르게 된다. 효소적 절단을 수행한 후, 절단 기능이 비활성화 된 Cas9 단백질은 서열인식 기능을 한다. 효 소적으로 비활성화된 Cas9 단백질은 표적 유전자 인식은 가능하나 표적 유전자를 절단하는 기능은 없다.
PAM 서열은 Cas 단백질과 발현된 종에 따라서 다르다.
널리 활용되는 spCas9 Streptococcus pyogenes의 경우, PAM 서열은 프로토스페이서의 5′-NGG-3'이다.
한편, Cas9는 박테리아의 핵산분해에 관여하는 단백질 RuvC 및 HNH를 포함하는데[12], 이 단백질의 도메인 중 D10A 나 H840A를 비활성화 시킴으로서 Cas9nickase (Cas9n)을 발현할 수 있어서 표적 유전자를 벌려둘 수도 있고, 이 두 개의 도메인을 동시에 비활성화 시키면 핵산 인식기능은 유 지하면서 핵산 분해효소 기능이 없는 dCas9(nuclease-deficient Cas9) 를 만들 수도 있다[13,14]. 이와 같은 Cas9 변이체 들은 유전자 편집과 전사 제어에 다방면으로 활용되고 있으 며[13,15,16], 표적 유전자를 인식하고, 이후의 반응을 유발 시키는 데에 활용되는 방식의 분자 진단에 활용되고 있다[17].
변형 가능성, 유연함, 특이도, 극민감도, 고효율도[18,19] 등의 특성으로 인해 Cas9 기반의 기술은 RNA에 의한 식별 및 절단 기능을 이용하여 손쉽고 우수한 진단 기술의 개발[17], 시퀀싱 분석에 필요한 표적 유전자 농축, 라벨링 등에 활용 되고 있다.
(2) Cas12
Cas12 는 이중 가닥 DNA를 표적으로 한다. Cas12는
Cas9 다음으로 유전자 편집에 많이 활용된다[20]. Cas12 는 프 로토스페이서의 인식에 따른 표적 유전자 절단 외에도 표적 이 아닌 주변의 단일가닥 DNA(single stranded, ssDNA)의 부 수적 절단을 유발한다[21]. Cas12 는 부수적인 절단 기능을 이 용하여 다양한 휴대용 진단 기술의 개발에 활용된다. Cas12a- crRNa 복합체는 부수적으로 단일 가닥 DNA를 분해하는 데, 표적 이중 가닥 DNA에 결합을 하면 1초에 대략 1250 회의 부수적 절단을 일으키기 때문에, 핵산 검출 및 신호 증 폭을 동시에 할 수 있는 효소로서 Cas12a를 주목하고 있다.
Cas12 는 5’-(T)TTN-3’의 PAM 서열을 가지는 이중가닥 구조의 서열을 특이적으로 인식 하는데, 일반적으로 사용되는 Cas12 는 Cas12a와 Cas12b이다. 표적이 단일가닥 DNA인 경우에는 PAM의 서열이 100% 일치하지 않고, 변화가 있 더라도 효소적 절단을 하는 것으로 알려져 있다[22].
Cas12b 는 반응에 있어서 고온이 필요하나(Cas12b는 48
oC, Cas12a 는 37
oC). Cas12b 의 유전적 변형을 통해서 저온에 서 활용하려는 연구가 진행된 바 있다[23].
Cas12 를 이용한 진단 기술 중 가장 대표적인 것이 DETECTR (DNA endonuclease-targeted CRISPR trans reporter) 기술 인데[22], Cas13을 사용한 SHERLOCK과 더불어 가장 널리 알 려져 있다. DETECTR에서는 SHERLOCK과 마찬가지로 표적 유전자 증폭을 위해 RPA(Recombinase Polymerase Amplification)를 사용하여 1 aM까지 검출을 할 수 있다.
DETECTR 의 crRNA를 설계하여 인유두종바이러스 16과 18 을 구분할 수 있는데, 두 종은 6개의 염기서열의 차이를 가지고 있 다. 신속함, 민감도, 특이도 면에서 SHERLOCK과 유사하지만 RNA 리포터를 사용하는 SHERLOCK에 비해 임상적 안정도 가 높다고 할 수 있다. RNA리포터는 주변환경의 RNA 분 해효소에 취약하기 때문이다.
별도의 전사과정이 필요하지 않아 더욱 간편하다는 점 역시 DETECTR 의 장점이라 할 수 있다. 하지만 단일 염기 변 이를 검출 할 수 없고, RNA를 분석할 수 없다는 한계는 존 재한다.
HOLMES(one-hour low-cost multipurpose highly
efficient system) 는 Cas12a를 이용한 또다른 기술인데 여
기서는 PCR을 하여 유전자를 증폭 한다. 증폭을 PCR로 한
다는 점 외에는 DETECTR와 유사하지만 HOLMES는 단
일염기변이를 식별할 수 있고, PAM서열에 변이가 존재하
더라도 구분할 수가 있다[24]. 이러한 높은 특이도는 16-17
개의 염기로 이뤄진 스페이서를 가진 crRNA의 설계를 통
해 가능하다[25]. 또한 HOLMES에서는 PAM 서열을 PCR
프라이머에 포함시킬 수 있기 때문에 이론적으로는 표적 유
전자 상에 PAM 서열의 존재 여부와 관계 없이 어떤 서열
이라도 검출을 할 수 있다. 또한 역전사 과정을 포함시켜서
RNA 를 cDNA로 전환시키면 RNA 검출까지 수행할 수 있다.
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HOLMES 는 이론적으로 서열에 제한이 없이 광범위하게 활 용될 수 있지만, 열처리 단계 등의 복잡한 과정을 한계로 가 지고 있다.
(3) Cas13
Cas13 그룹은 표적 유전자를 인식할 수 있는 28-30 bp (base pair) 의 스페이서로 이루어진 gRNA와 리보핵단백질을 형 성한다. Cas13 단백질은 DNA 분해 효소가 아닌 RNA 분해 효 소로 작용을 하며, Cas13은 DNA를 부수적으로 절단하는 Cas12 와는 달리 RNA를 부수적으로 절단한다[3].
Cas13 그룹 중에는 이전에는 C2C2로 알려졌던 Cas13a가 가장 먼저 핵산 검출에 활용되었다. Cas13a는 crRNA에 맞는 프로토스페이서를 가진 단일 가닥 RNA 표적을 분해시킨다. 단 일 가닥 RNA에 한 번 결합을 하면, Cas13a 단백질은 비 특이적 RNA 분해효소로 작용을 하여 주변에 있는 RNA가 표적 RNA가 아니더라도 분해를 시킨다. 한 번의 표적 인 식으로 최소 104회의 부수적 절단을 일으키는 것으로 보고 되어 있다[3,26].
표적 유전자에 대한 절단과 비특이적인 주변 RNA 서열의 절 단 2가지 방식의 효소적 절단을 하는 것이다[2,27].
Cas13 는 상보적인 프로토스페이서를 절단하는 것이 아니고, 그 주변을 절단하기 때문에, 프로토스페이서 가 온전히 유지 되 기 때문에 결합을 절단을 여러 차례 할 수도 있어 증폭효과를 나타내므로 민감한 검출에 활용될 수 있다[3,4,28,29].
Cas13 단백질은 PAM 서열을 필요로 하지 않으나 protospacer flaking site(PFS)라고 해서 염기 구아닌이 프 로토스페이서 옆에 있어야한다. 생명공학 및 진단 부문에서 가장 널리 사용되는 Cas13 단백질은 Cas13a와 Cas13b 인 데, Cas13b는 세포 유전자 조작에 더욱 안정적인 것으로 알 려져 있다[30].
Cas13 을 활용한 가장 대표적인 진단 기술이 Gootenberg 그룹이 발표한 "SHERLOCK" 이다[4]. 이는 등온 증폭과 특이적 LwCas13a의 식별을 활용한 핵산 검출용 분석법이다.
RPA 이나 RT-RPA를 이용하여 표적 유전자를 증폭하고, T7 을 사용하여 전사를 하는데, 이로 인하여 다수의 RNA 증 폭 산물이 생성된다. 이후 Cas13의 부수적 절단이 유발되어 형 광 신호를 생성한다. RPA, T7 전사, Cas13a의 검출, 세 단 계로 별도의 강한 열처리 없이 신호 증폭과 효율적인 신호 생성이 가능하여 SHERLOCK은 실제로는 3 단계의 신호 증폭 효과를 가지게 된다. 37 도 환경에서 1-3시간 이내에 aM 농도 수준의 DNA/RNA 검출이 가능하게 된 것이다. 또한 스페이서 서열을 조절하여 바이러스 동정 및 단일 염기 변 이 식별이 가능한데, 이러한 높은 특이도는 RPA 프라이머 결합과 크리스퍼의 인식 두 단계의 반응이 동시에 일어나야 함으로서 가능하다. 동결건조 된 Cas13a 와 종이 검출 기
술을 접목하여 비용이 검사 당 0.61 달러를 넘지 않는 저 비용으로 aM 수준의 민감도을 유지하고도 냉장 시설이 필 요하지 않은 휴대용 검출을 개발하였다.
같은 그룹은 보다 확장된 기술인 SHERLOCKv2를 발표 했다[29]. 이는 4가지 측면의 진보를 이루었다. 각각 다른 리포터 서열에 반응하는 다양한 Cas 단백질을 이용하여 4 개의 다중 진단을 했고, RPA 프라이머를 조절하여 aM 수 준에서 정량적 분석을 가능하게 했으며, Cas13a의 부수적 절단에 의해서 유발된 Csm6 핵산 분해효소를 활용하여 민 감도를 높였고, 장비가 필요없이 육안으로 결과를 확인할 수 있는 색도 분석 기반의 측방 유동 분석법을 개발했다. 이를 이용하여 90분 안에 2 aM 까지 검출 할 수 있다.
감염병 감시 및 병원체 진단이 필요한 현장 진단에 요구 되는 신속성, 휴대성, 저비용, 민감도, 단일염기 식별 등의 기술이 SHERLOCK 및 SHERLOCKv2 로 구현이 되고 있다.
Cas13 기반의 검출 기술을 이용하여 검체로부터 결과 판독에 이르기까지 실제적으로 활용할 수 있는 분석 순서의 확립 또한 중요하다.
Myhrvold 그룹은 HUDSON(heating unextracted diagnostic samples to obliterate nucleases) 이라 명명한 바이러스 검출 기법을 발표하였다[28]. 이 기법에서는 핵산 분해 효소의 영 향없이 체액에서 바이러스 유전자를 추출하여 Cas13 검출 용 시약과 반응을 시킨다. 핵산 추출 과정없이 검체를 바로 SHERLOCK 분석법에 적용할 수 있도록 한 기술이다. 소 변, 혈액, 혈장, 혈청, 타액 등의 체액을 10-25 분 동안 열 처리 및 TCEP/EDTA 처리한 후 바로 Cas13 기반의 검출 기법에 활용할 수 있다.
Cas9 단백질이 표적을 인식하고 절단을 한 이후에는 비 활성화 상태가 되는 것과는 달리 Cas12와 Cas13는 표적 인식 이후에도 부수적인 절단을 한다. 이러한 활성 때문에, Cas12 와 Cas13은 모두 핵산 검출에 있어서 신호 증폭의 기능을 한다. 이는 표적 유전자가 있는 경우, 여러 차례 반 복적으로 핵산 분해 효소의 특성을 보임으로서, 결과적으로는 분석 민감도를 증폭하는 효과를 보인다. 또한, 신호 변환 과 정은 모두 복잡한 실험 환경을 필요로 하지 않기 때문에, 임 상 시험 면에서 혹은 현장 진단 면에서 모두 사용자 친화적 인 특성이라 할 수 있다.
(4) Cas14
Cas 12, Cas13 외에도 Cas14 또한 부수적 절단 효과를
보여 이를 활용한 연구결과가 보고되고 있다. Cas14는 단
일가닥 DNA의 프로토스페이서를 인식할 수 있다. Harrington
그룹은 Cas14-DETECTR를 개발하여 단일 염기 변이를 검출
하였다[31]. 그러나 Cas14는 단일 가닥 DNA 의 식별을 통해 부
수적 절단이 활성화 되기 때문에 이중 가닥 DNA를 검출해야
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시켜야 하는 과정상의 복잡함이 있다. 이는 검출 기법 개발에 있어서 복잡함을 더하기 때문에 활용도면에서 다소 부적절 하다.
Cas14 는 가장 최근에 발견되었고 Cas14a, Cas14b, Cas14c 로 구분되는데, 이는 PAM의 서열과 무관하게 단일 가닥 핵산을 절단한다[31]. 그러나 이중가닥의 표적 유전자의 절단을 위해서는 염기서열 T가 다량 함유된 PAM 서열이 필요한 것으로 보고되었다[32].
Cas12a 가 유사한 단일가닥 서열 구분에 문제가 있는 것 과는 달리 Cas14a는 단일가닥 표적 유전자의차이가 하나인 경 우에도 식별을 할 수 있다. 이는 PAM 서열이 없이도 단일가닥 서열의 SNP를 식별하는 데에 사용될 가능성을 보여준다.
표 1에서는 Cas 단백질들 간의 특성의 차이를 비교해 나 타내고 있다.
3. 유전자가위 진단 기술
CRISPR/Cas 시스템은 특이적으로 핵산을 검출하는 기 술로, 효율이 높아 현장진단 기기에 활용되고 있다. 최초의 크리스퍼 검출 법은 Cas13a의 부수적 RNA 절단 특성을 활용하여 표적 유전자를 검출하고 있다. 이는 표적 유전자 의 절단 외에도, Cas9과 같이 표적 유전자와 결합한 이후 에 표적이 아닌 ssRNA를 분해하는 특성이다[3]. 이 장에서 는 이러한 부수적 절단을 활용한 검출 기술들을 포함한 유 전자 가위 진단 기술을 분야별로 나누어 살펴보도록 한다.
(1) 측방유동분석법
측방유동분석법(LFA, Lateral Flow Assay)은 주로 단 백질과 항체를 검출하는데 널리 사용되고 있으나, 최근 핵 산 검출, 분석에도 활용되고 있다[37]. 일반적으로 프라이머를 태깅하여 표적 유전자가 금나노 입자와 측방유동 매트릭스 사이에 들어가게 설계를 해서 신호를 생성하는 방식이다. 그 러나 프라이머 다이머, 부적절한 증폭산물, 유전자 자체의 2 차구조 등으로 인해 위양성이 나타나기도 한다[38]. 측방 유동분석법을 이용한 핵산 검출은 PCR을 해야 한다거나 정 량적 분석은 어렵다는 단점[39]이 있는 반면 육안으로 간단
하게 결과를 분석할 수 있다는 장점이 있다.
CRISPR/Cas 복합체는 타겟 유전자와 프라이머 다이머를 식별할 수 있기 때문에 현재 핵산을 검출하기 위한 LFA의 한계에 대한 대안이 될 수 있다[29,40-45]. 또한, Cas 단백 질에 따라 단일 가닥 DNA, 이중 가닥 DNA와 단일 가닥 RNA 를 검출 할 수 있다. 다양한 측방유동분석 플랫폼은 Cas 단백질을 표적 유전자의 인식물질로 활용한다.
가장 대표적인 CRISPR/Cas 시스템을 이용한 측방유동 분석법은 Wang et al.이 개발한 CRISPR/dCas9-mediated lateral flow nucleic acid assay(CASLFA) 이다(그림 2).
여기에는 두가지 방식의 기술이 포함된다[46]. 두 가지 방법 모 두 dCas9 단백질이 종이 멤브레인에 고정하여 Cas9의 검출 방 식을 측방 유동플랫폼에 적용시킨 기술이다.
이를 위하여 표적 유전자에 바이오틴이 결합되어 있는 프 라이머를 이용하여 증폭을 하여 스트렙타비딘이 고정된 테 스트 라인에 결합이 되도록 한다. 바이오틴이 수식되어 있는 증 폭 산물을 Cas9/gRNA를 이용하여 식별하는 원리이다. 증 폭산물과 Cas9의 결합체는 측방 유동 플랫폼을 흐르다가 Cas9/gRNA 와 반응할 수 있는 DNA 프로브가 고정된 금 나노 입자와 결합하고, 이 증폭산물-Cas9-금나노 입자 결합 체는 테스트 라인 상의 스트렙타비딘과 결합하여 신호를 생 성한다. 증폭산물이 결합하지 않은 DNA 프로브가 고정된 금나노 입자는 컨트롤 라인 상에 포획된다.
종이 멤브레인에 증폭 산물을 적용하기에 앞서서, dCas9
표 1. Cas 단백질의 특성
Table 1. Properties of Cas proteins
Cas 91 Cas 122 Cas13 Cas14
Length of spacer 18-24 bp 18-25 bp 22-30 bp 20-40 bp
PAM sequence NGG TTN PFS -
Target dsDNA DNA ssRNA DNA
Collateral cleavage None ssDNA ssRNA ssDNA
1xCas9[33] - NG/GAA/GAT를 PAM으로 식별, ScCas9[34] - NNG를 PAM으로 식별, spCas9[35] - NGG를 PAM으로 식별.
2AsCas12a 변이체[36] - VTTV/TTTT/TTCN/TATV를 PAM으로 식별.
그림 2. CRISPR/Cas 시스템을 활용한 측방 유동 분석법(ACS Nano 2020;14:2497-2508에서 발췌 및 수정)
Fig. 2. Scheme of representative lateral flow assay based on CRISPR/Cas system(Wang et al. ACS Nano 2020;14:2497- 2508)
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반응을 실시하여 리보핵단백질과 표적 유전자의 복합체를 만들고 이를 테스트 라인과 반응할 수 있도록 한다. 2개의 CASFLA 방법은 금나노 입자가 리보핵단백질과 결합하는 방식에 차이가 있다. 첫번째 전략(그림 2. 전략A)은 DNA 의 hybridization 기반의 기술인데, 표적 유전자에 맞는 금 나노-DNA 프로브가 필요하다. 이는 표적 유전자에 따라 금 나노-DNA 프로브를 설계해야 한다. 두 번 째 방법(그림 2.
전략 B), 3차원 구조의 서열이 crRNA에 결합을 하여 금나 노-단일가닥 DNA 복합체를 검출하는 방법은 보다 범용성 이 있어서 표적 유전자의 서열과는 무관하게 사용할 수 있 고, crRNA가 보존되는 한 모든 타겟 서열에 적용을 할 수 있다. 이 두번 째 방식과 PCR를 접목하게 되면 0.8 fM까 지 검출 한계를 낮출 수 있다. 위의 두가지 방식에서는 종 이멤브레인에 고정되어 있는 스트렙타비딘과 반응을 할 수 있게 하도록 바이오틴이 고정된 프라이머를 이용한 증폭과 정이 필요하다.
CASLFA 는 20-37 도 환경에서 1시간 이내에 최소한의 장비로 EGFP(Enhanced green fluorescent protein) 유 전자를 검출했다. 사용이 간단하면서도 150-200 copies/reaction 의 민감도를 보이면서 L. monocytogenes 병원체를 다른 식 중독 병원체와 구분해 내었다.
비슷한 원리를 이용한 다른 연구에서 Wang et al.은 색 도변화의 확인을 위하여 프라이머의 결합과정에서 마이크로 입자를 붙여 사용하기도 하였다[47]. 이들 유전자 가위 원 리를 활용한 측방유동 기술은 간단하고 신속하게 핵산을 검 출 할 수 있는 현장 진단에 적합한 기술이라 할 수 있다.
Cas9 은 표적 서열을 인식해도 부수적인 절단을 하지 않 으므로, 신호 증폭의 과정은 발생하지 않아 검출한계가 비 교적 높다. 그러나 LFA 자체가 구현이 간단하고 저렴하기 때문에 의미가 있다. 효소 반응을 다수 포함하는 바이오 센 싱 플렛폼과는 달리 CASLFA 기법은 시각적 신호를 생성 하는 신속한 분석법이다.
Hu et al. 은 Horseradish peroxidase(HRP)를 이용하여 신호을 증폭하여 Cas9 기반의 측방유동분석법을 보고하였다.
간단하고 신속한 방식으로 DNA와 HRP단백질에 금나노 입 자를 고정하였다. HRP 단백질은 색상 반응을 촉진하여, 테 스트 라인에서 0.1 nM 수준에서 표적 유전자를 시각화 하 였다[48].
또한 Mukama 그룹은 Cas12b를 측방유동 센서에 적용 하여 DNA를 검출 하였다[43,49]. 이를 이용하여 1시간 이 내에 육안으로 HPV(Human papillomavirus) DNA를 검 출 할 수 있었다. 이는 Cas12b의 핵산 검출에 있어서 높은 활용도를 보여주는 예라 할 수 있다.
측방유동분석 방식은 결과 판독이 간단하고, 복잡한 장비가 필요하지 않으나, 수동으로 수행해야 하는 과정이 포함되어
있다. 이상적으로는 종이 위에서 Cas의 서열 인식과 절단이 모 두 일어나서 한번 검사 용지를 담금으로서 신호 판독이 가 능할 수 있다.
(2) 색도분석법
크리스퍼를 이용한 핵산의 진단결과를 시각화 하기 위한 또다른 방법으로 색도 분석법을 들 수 있다.
Pardee et al. 는 종이 기반의 색도분석 현장진단법을 개 발하여 미국형 지카 바이러스와 아프리카 형 지카 바이러스를 구분했다(그림 3). 미국형 지카 바이러스와 아프리카 형 지 카 바이러스는 단 한 염기의 차이만 있는데, 이를 CRISPR/
Cas 시스템을 이용하여 검출했다는 의미가 있다.
토홀드 스위치(toehold switch)를 이용하여 유전자 발현의 정 확한 제어를 할 수 있다[50]. “트리거 서열 trigger sequence”과 결합을 하게 되면 토홀드 스위치는 유전자 발현을 활성화 한다.
종이를 활용한 이 현장진단 법에서는 토홀드 스위치가 일 단 활성화 되면 효소가 작동하여 노란색 기질이 보랏빛 산 물이 되게 만든다. 이 색상의 변화는 육안으로 관찰이 가능 하다. 이 트리거 서열이 색도 검출법의 핵심인데, 이는 등온 증폭법을 이용하여 인공적으로 지카 바이러스의 서열에 주 입할 수 있다. Cas9는 증폭 이후에 반응을 시켜서 PAM 서열 상의 SNP를 식별하게 된다. 미국형 지카 바이러스는 Cas9를 활성화 시켜서 트리거 서열을 절단한다. PAM 서열을 이용
그림 3. CRISPR/Cas 색도분석센서의 개념도(Pardee et al. Cell 2016;165:1255-1266에서 발췌 및 수정)
Fig. 3. Schematic representation of CRISPR Cleavage sensor (Pardee et al. Cell 2016;165:1255-1266)
131 하여 표적 유전자를 지정할 수 있고, 리보핵단백질 복합체는
오직 PAM 서열을 포함하는 상보적 서열을 검출할 수 있게 된다. 그러므로, 미국형이 아닌 아프리카형 지카 바이러스는 트리거 서열이 절단되지 않은 채로 토홀드 스위치에 결합하 여 색도 변화를 유도하게 된다. 각각의 내용물은 동결건조 되었기 때문에 종이 기반의 센서에 적용이 용이하다. 이 크 리스퍼 검출법은 NASBACC(Nucleic acid sequence-based amplification) 로 불리우는데 이는 등온 증폭법이 필요하지 만, 저렴하게 구현이 가능하다[51].
Qiu et al. 은 등온 증폭과 회전 환 증폭(RCA, rolling circle amplification) 을 접목한 색도 분석법을 개발하였다[52].
RCA 를 통하여 이중 가닥 DNA를 표적으로 하는 dCas9를 이용하여 혈청 샘플 내에서 microRNA의 단일염기변이를 검출 하였다. RCA는 등온 증폭의 하나로서, 지속적으로 프 라이머와 표적 유전자가 반응을 하여 표적 유전자에 상보적 인 서열이 수백번 반복되어 이루는 긴 DNA 사슬을 만든다.
긴 단일 가닥 DNA 사슬은 2차 구조를 형성하여 이중 가 닥 DNA를 만든다. 이 이중 가닥 DNA 구조가 dCas9-RNP 복합체의 스페이서 서열의 표적 유전자가 되는 방식이다. 여 기서는 변형 HRP를 사용하는데, Cas9 단백질에 절반의 HRP 가 접합된다. 이중 가닥 DNA가 3차 구조의 구조적 결합을 하여 두개의 Cas 단백질이 근접하게 되면 HRP 효소가 단 일체를 형성하게 되어 효소의 기능을 한다. HRP의 활성 정 도는 색도의 변화를 통해 파악한다. 이 기술은 4시간 안에 fM 의 수준으로 검출이 가능하다. 미세유체 장비에 적용하여 단백질 농도를 최적화하면 검출 시간은 줄어들 수 있고, 검출 과정도 간소화 할 수 있어 현장 검출 기술에 적용할 수 있다.
Yuan et al. 은 Cas12a와 Cas13a 단백질을 이용하여 증
폭과정 없이 금 나노 입자 기반의 색도분석 크리스퍼 검출 기술을 개발하였다[53](그림 4). 기존의 금나노 입자 기반의 색도 분석법에서는 표적 유전자와 금나노 입자에 고정되어 있는 핵산 간의 결합을 활용하였다. 금 나노 입자의 서열은 표적 유전자와 최소한 2 곳에서 결합 할 수 있게 한 후, 다 수의 금 나노 입자가 표적 유전자에 결합을 하면 입자의 응 집으로 인하여 색상이 빨강에서 보라로 변하게 되는 원리이 고 이는 육안으로 식별이 가능하다.
그러나 표적 유전자의 농도가 낮은 경우, 색도의 변화가 미미하여 검출이 어렵다. 또한 각각의 표적 유전자에 맞게 금 나노 입자에는 다른 프로브 서열을 고정해야 한다. Yuan et al. 은 크리스퍼 기반의 검출 시스템을 개발하여 리보핵단 백질 복합체는 표적서열의 인식에, 금나노 입자는 신호 증 폭에 이용하였다. 표적 유전자가 있는 경우에는 Cas12a/
13a 가 모든 단일가닥 DNA/RNA를 부수적으로 절단하여 금 나노 응집에 필요한 서열을 모두 분해한다. 표적 유전자가 있는 경우 금 나노 입자를 주입하게 되어도 응집이 일어나 지 않게 된다. 520 nm의 흡광도를 측정하여 표적 유전자 의 농도와 색도 변화 쉬프트 간의 상관관계를 파악할 수 있 다. 이 시스템의 검출 한계는 500 fM 수준이고 형광 크리스퍼 검출 기술과 유사한 수준이다[54]. 이 외에도 Zhou et al.은 금 나노 입자를 이용한 유사한 결과를 보고 했다[55].
(3) 전기분석법
유전자 증폭을 하지 않고서도 아주 낮은 검출 한계를 가 지는 센서에 대한 보고가 되고 있다. 그래핀 기반의 전계 효과 트랜지스터[56](gFET, graphene based field effect transistor), 나노 공극을 이용한 센서[57,58], DNA 구조체를 이용한 전
그림 4. CRISPR/Cas 금 나노 입자 센서 개략도(Yuan et al. Anal. Chem. 2020;92:4029-4037 발췌 및 수정)
Fig. 4. Schematic presentation of colorimetric detection based on gold nanoparticle and CRISPR/Cas system(Yuan et al. Anal.
Chem. 2020;92:4029-4037)
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도도 센서 gel[59] 가 그 예이다.
그래핀 기반의 전계 효과 트랜지스터 센서와 나노 공극센 서는 Cas 단백질에 의한 절단이 아닌, dCas9-crRNA구조 체의 결합을 이용한다(그림 5). dCas9을 이용한 전기화학 센서, 유전자의 증폭 없이 핵산 검출을 할 수 있는 미세유 체 등에 활용되고 있다.
gFET 는 크리스퍼 센서 중에 최초로 전기적 신호 판독을 이용한 예가 된다. dCas9을 이용하여 Haijan et al.은 gFET 를 이용하여 표적 DNA유전자가 있을 때에만 발생하는 전 기적 신호를 얻었다[56]. 극성을 띈 DNA 분자가 그래핀에 가까워 질수록 시스템의 저항이 감소하여 전류를 증가시키는 원리를 이용하였다. 그래핀 표면에 고정된 dCas9가 표적 DNA 에 선택적으로 결합하고, 이를 그래핀 표면에 가깝게 유지시킴으로서, 저항을 감소시켰다. dCas9은 그래핀 표면에 PBA(1-pyrenebutanoic acid) 링커를 이용하여 고정하였다.
PBA 의 pyrene 링이 π-π stacking을 이용하여 그래핀에 부 착되고, 카르복실 기가 Cas9와 수소 결합을 이루어 dCas9를 그래핀 표면에 고정하였다. 고정되지 않은 부분은 비특이적 흡착을 막기 위하여 차폐 시켰다. 한 방울의 샘플을 장치에 떨어뜨려 반응시켰고, 세척을 한 후에 그래핀 위의 백금 전 극을 이용하여 시스템의 전도도를 측정하였다. 검출한계는 15 fM 이고 분석 시간은 15분이었다. 이는 민감한 트랜지스 터의 전도도를 활용한 모듈로서 실시간 전기 신호를 생성하 였다. 적절한 핵산 분리 과정이 포함된다면, CRISPR-Chip은 대형 장비와 효소 반응 과정 등이 필요 없고, 일체형 분석기를 만 들 수 있기 때문에, 유전적 결함을 측정할 수 있는 최적의 현장 진단 기술이 될 수 있을 것이다.
나노 포어 센서는 dCas9 단백질이 DNA에 결합하여 나노 공 극을 통과할 때 발생하는 차단 신호를 기반으로 한다. 통과를
하면 나노 공극에 흐르는 전류가 감소하는데 이 신호를 판 독하여 분석한다. 나노 공극을 검출 전략으로 이용하면 이 중 가닥 DNA를 풀지 않고, 열처리를 하지 않고서 다중 검 출까지 할 수 있다. Yang et al.은 전류의 그래프를 보고서 dCas9 단백질의 결합 부위를 파악했다[58]. 복수의 crRNA 서열을 설계하여 하나의 DNA에 각각 다른 부위에 결합하 게 하여 바코드를 만들고, 각각 다른 DNA에 적용하여 서 열의 전류의 흐름을 추적하였다. 이를 이용하여 다른 DNA 들과 섞여 있는 2가지 DNA 표적 유전자를 식별하여 dCas9 단백질을 나노 공극에 적용했을 때의 특이적 검출 성능을 보고 하였다. 이를 이용하여 분자 1개를 검출할 수도 있으 나, 샘플에 표적 유전자가 미량으로 존재하는 경우에는 표 적 DNA 유전자가 공극으로 갈 수 있는 기회가 적으므로, 분석 시간이 길게 소요된다. 그렇기 때문에 나노 공극을 이 용한 검출 기술은 DNA 식별에는 유용하나, 처리량이 낮을 수 밖에 없다.
최근 Nouri et al.는 미량의 표적유전자의 측정 시간 문 제를 Cas12a를 이용한 절단과 리포터 DNA 조각 여부로 측정을 했다[60].
English et al. 은 크리스퍼를 이용한 DNA 하이드로젤의 절단을 이용해서 전기 신호를 생성하는 검출 기술을 개발했 다[59]. 두 가지 기술을 개발 했는데, 하나는 DNA-젤 융합 체이다. 전도성 탄소 나노 입자를 DNA 젤에 섞어서 전극 위에 놓아 연결한다. DNA가 절단되면 전극간의 연결에 훼 방이 생겨서 저항값이 증가된다. 젤은 전극간의 연결에 사 용이 된다. 측정을 위해서 전극패드를 리보핵단백질이 있는 에펜도르프 튜브에 넣는다. 측정은 정성적이고 표적유전자 의 농도에 따라 3-12 시간이 소요된다. 이를 정량적으로 보 다 신속히 측정하기 위하여 광학신호와 전자 신호를 발생시 키는 종이 기반의 현장진단 장치를 개발하였다. 종이 채널 상에서 DNA와 폴리 아크릴아마이드 젤의 전구물질을 섞어 ssDNA 하이드로 젤을 형성시켰다. 젤 상의 단일 가닥 DNA 가 분해되면 젤 형성이 잘 되지 않기 때문에 Cas12a에 의 해서 DNA를 절단 시키게 되면 채널은 젤에 의해서 막히는 정도가 약해질 것이고, 색상을 띈 버퍼의 흐름이 좋아질 것 이다. 시각적인 신호를 400 pM 까지 확인할 수 있었다. 사 용자간의 차이를 줄이기 위하여 채널 상의 전극을 이용한 전기적 신호판독도 가능하다. 이 전극을 이용하여 전해질 이 온의 농도에 따른 전도도를 측정하는 원리이다. 이 장치는 4 시간의 반응 시간이 필요하고 신호 판독은 2분에 가능하다.
(4) 전기화학 센서
크리스퍼 전기화학 센서에는 다양한 전략이 활용되고 있 다[61-64].
전극 위의 표면에 메틸렌 블루를 붙인 단일 가닥 프로브
그림 5. CRISPR/Cas gFET 센서의 개략도(Hajian et al. Nat.Biomed. Eng. 2019;3:427-437 발췌 및 수정)
Fig. 5. CRISPR/Cas gFET sensor(Hajian et al. Nat. Biomed.
Eng. 2019;3:427-437)
133 DNA 를 고정한다. 이후 표적 유전자가 있으면 Cas 단백질
의 부수적 절단에 의하여 전극 위의 DNA가 절단되어 메틸 렌 블루에 의한 신호 생성이 일어나지 않는다.
다른 전략으로는 단일 가닥 DNA 프로브에 글루코즈산화 효소를 붙여 놓고, 표적 유전자가 있으면 단일 가닥 DNA 프로브가 절단되어 글루코즈산화효소에 의한 반응이 검출되 지 않고, 표적 유전자가 없으면 글루코즈산화효소에 의한 과 산화수소 발생 신호를 측정하는 원리이다.
메틸렌 블루를 사용한 논문들은 방법이 유사하나 핵심적 차이가 있다. Dai et al.은 Cas12a의 부수적 절단 특성을 이용하여 표적 유전자의 증폭없이 전기화학적 신호를 생성 했다[62](그림 6). 그들이 개발한 “E-CRISPR” 센서는 금 전극을 이용하는데, 프로브 단일가닥 DNA에 메틸렌 블루와 싸 이올 그룹을 수식하여 금 전극에 고정하였다. 20-30 ul의 샘플을 금 전극에 떨어뜨려10 분간의 반응 시킨 후에 신호 변화를 분석한다. 표적 DNA 유전자가 존재하는 경우 Cas 12a 복합체는 활성화되어 금전극에 고정된 프로브 DNA를 절단 시킬 것이고, 이는 메틸렌 블루를 방출하게 될 것이다. 세척 한 후에 square wave voltametry를 수행하여 메틸렌 블 루의 환원이 생성하는 피크 전류를 검출할 수 있다. 메틸렌 블루가 절단에 의해서 제거되면 전류의 피크가 감소될 것이다.
이 전류의 변화를 통해서 표적 DNA 유전자를 검출할 수 있고 검출 한계는 50 pM 이었다. 이 원리를 이용하여 별 도의 증폭과정 없이 HPV16 DNA를 50 pM 수준에서 검 출하였는데, 이는 기존의 증폭 과정 없는 크리스퍼 핵산 검 출 기술[4,29]을 이용한 검출 한계보다 낮은 수준이다.
Xu et al. 은 Cas9의 절단 기능을 활용한 전기화학 센서 를 개발하였다. 이 센서에서는 단일 가닥 헤어핀 구조의 DNA에 메틸렌 블루를 붙여서 금 전극에 고정하였다. 크리 스퍼에 의한 신호 증폭이 없는 경우, 표적 유전자와 프로브가 결합하게 되면 헤어핀 구조가 풀어지게 되어 메틸렌 블루와
전극 간의 거리가 멀어지게 되고, 전류의 흐름이 감소하게 된다. Cas9 단백질을 사용하면 표적 유전자 상의 PAM을 인식하게 되어 절단이 일어나 전기화학적 프로브가 표면으 로부터 방출되게 된다. 이러한 Cas9로부터의 절단은 검출 한계를 Cas9 을 사용하지 않은 때에 비해 최소 100배 낮 추게 되어 100 fM 수준에 이르게 된다[63].
Zhang 그룹은 다른 방식의 전기화학 검출법을 개발했는 데, 이는 선형 단일가닥 DNA 리포터 대신 헤어핀 구조의 DNA 리포터를 이용하였다[64]. 헤어핀 구조는 메틸렌 블 루를 더욱 전극에 가까이 위치시킴으로서 전자 이동을 증가 시킬 뿐 아니라, 전극 표면 상의 밀집도가 낮아 Cas12a의 접근도가 증가되어 효소 반응을 증가시킬 수 있다. 헤어핀 구조는 이중 가닥 DNA에 비해 메틸렌 블루를 더욱 전극 가까이 위치시킬 수 있기 때문에, 분자적 반발이 없이 반응 감도를 증진 시킬 수 있었다.
Bruch et al. 은 글루코즈산화제를 RNA 서열에 붙여서 미 세유체 칩 상에 고정하였다[61]. Cas12a의 부수적 절단 기 능을 이용하여 리포터 RNA을 절단했고, 절단이 되면 글루 코즈산화제가 미세유체 칩 채널로부터 방출되게 하였다. 세 척을 한 후에 표적 유전자의 농도에 따라 글루코즈 산화제는 채널 상의 용액의 글루코즈를 산화시켰고, 산화물과 과산화 수소를 생성하였다. 과산화 수소는 전기화학 신호 검출부에 서 측정하였다. 표적 DNA 유전자가 있는 경우 검출한계는 반응 시간에 따라 18 pM, 10 pM, 2 pM 로 나타났고 1000 pM 까지 표적 유전자의 농도와 생성신호와의 유의미한 상관 관계를 확인하였다. 이 기술은 비용이 저렴하고, 수동 과정 이 적으나 미세 유체 칩의 제작 및 운용의 어려움이 따른다.
(5) 형광 검출법
Katzmeier et al. 은 15 유로 이하의 소형 형광 검출기를 개발하여 종이에서 CRISPR/Cas13a 검출법을 구현했다[65].
그림 6. 전기화학 CRISPR 센서의 개략도(Xu et al. Biosens. Bioelectron. 2020;155:112100 발췌 및 수정)
Fig. 6. Schematic representation of electrochemical CRISPR sensor(Xu et al. Biosens. Bioelectron. 2020;155:112100)
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이 기기는 플라스틱 필터 호일을 활용하여 파장을 조정할 수 있는 휴대용 신호 판독기를 활용했으며 크리스퍼 검출이 일어나는 종이는 카트리지에 넣는 방식이다. 각각의 크리스 퍼 시약은 종이 위에 동결건조 되어 있어서 실온에서의 장 기 보존도 가능하다. 표적 RNA 유전자를 주입하면 동결건 조 되었던 Cas 단백질이 활성화되어 형광 리포터 RNA의 부수적 절단이 일어나서 형광 신호가 발생하는 방식이다. 3 nM 의 표적 유전자를 20분 안에 진단할 수 있다. 물론 종 이 위에서의 검출 방식은 액상 검출 방식의 SHERLOCK 이나 HOLMES 그리고 DETECTR에 비해서 효율성이 떨 어지나, 여전히 나노 몰 수준의 검출한계를 보여준다.
East-Seletsky 그룹은 LbuCas13a를 이용하여 박테리오 페이지 λ RNA 및 β-actin mRNA를 검출하였다[3]. 표적 단일 가닥 RNA에 결합을 하여 부수적 절단을 이용하여 또 다른 단일 가닥 RNA 를 절단시키는 원리(그림 7) 인데, 이 때의 프로브는 형광물질 및 형광신호 억제 분자가 수식되어 있고, 절단되면 형광 물질이 억제 분자로부터 떨어지게 되 어 형광신호가 발생된다. 이 원리의 검출 한계는 1-10 pM 이었다.
East-Seletsky et al. 는 표적 RNA의 농도의 증가에 따라 프 로브로부터의 형광 신호가 증가하는 결과를 보고 하였다. 이 들은 부차적인 프로브의 절단이 신호 증폭의 효과가 있다는 것을 입증하였다. 실험 조건을 보면, 10 pM의 표적 RNA는 표 적에 결합한 Cas13a-crRNA 복합체의 0.02%에 해당하는 양 임에도, 실제로는 25-50%의 양에 해당하는 형광 프로브가 분해되었음을 보이며 표적 RNA에 결합한 분자 수 대비 약 10,000 배의 증폭 효과를 보고하였다. 이는 기존의 핵산을 증폭하는 기술과는 달리 검출 신호의 증폭을 통해 극미량의 핵산을 진단할 수 있는 기술이다.
dCas9을 활용한 DNA 검출이 전례없이 우수한 성능을 보 이고 있음에도, CRISPR/dCas9는 비특이적 결합 가능성이 있어 위양성 결과를 유발할 수 있는 문제를 가지고 있다[66,67].
이에 dCas9 의 특이도를 높이기 위하여 기존의 ZFN(Zinc- finger nucleases) 이나 TALEN 에서와 같이 이중합 결합 (dimerization) 을 활용하고 있다[68]. Zhang 그룹은 dCas9 쌍 을 활용하여 이중 가닥 DNA의 검출에서 특이도를 높였다 [69]( 그림 8). 여기서는 파리의 루시퍼레이즈 효소의 절반과 dCas9 단백질을 융합하고 또다른 반대쪽 효소와 dCas9을 융합한 후, sgRNA (single guide RNA) 를 통해 dCas9의 이중합 결합을 유도하여 온전한 루시퍼레이즈의 활성화를 구현하였다. dCas9의 두 종의 프로토스페이서가 표적 유전 자에 각각 결합하여 발광반응을 촉진하여 발광 신호를 생성 했다. dCas9 쌍의 특이도가 높은 이유는 두개의 부분 서열 이 각각 반응하는 것이 전제 되어야 하기 때문이다.
이중합 결합 원리를 활용한 다른 예는 RCA-CRISPR- split-HRP 인데 miRNA 검출을 위해서 분리된 HRP를 활 용하였다[52]. miRNA는 RCA를 유발하는 프라이머의 역 할을 하고 아령 모양의 DNA 링을 템플릿으로 활용한다. 본 템플릿에 miRNA가 다른 서열과 경쟁적으로 결합하기 때 문에 유사서열을 구분해 낼 수 있다. 기존의 RCA와는 달리 수 백개의 DNA 헤어핀 구조를 형성하도록 설계되었고, 이중 가닥의 영역에 분리된 HRP를 가진 dCas9 단백질 쌍이 붙 었을 때에 HRP가 활성화 되어 TMB의 색도 변화를 유발 하기 때문에, 높은 특이도와 신호 증폭을 동시에 구현한 기 술이다. 모델 miRNA로 let-7a를 활용하여 단일 염기의 차 이까지 식별하면서 fM 수준의 민감도를 구현하였다. 이는 경쟁적인 miRNA의 결합과 분리된 HRP의 재 활성화에 기 인한다.
Li 그룹은 내열성 효소인 AacCas12b를 이용하여 HOLMESv2 를 개발하였다[70]. 55'C 에서 RT-LAMP (reverse transcription loop-mediated isothermal amplification) 를 이용한 증폭을 한 후 표적 RNA를 검출하였다. 역전사 과정이 없기 때문에 간 단히 RNA를 검출할 수 있고, RNA 뿐만아니라 DNA 메 틸레이션까지도 검출할 수 있어 그 적용 범위를 확장시키고
그림 7. CRISPR/Cas 형광검출법에 활용되는 부수적 절단의 개략도(East-Seletsky et al. Nature 2016;538:270-273 발췌 및 수정) Fig. 7. Schematic representation of trans cleavage of fluorescent RNA probe(East-Seletsky et al. Nature 2016; 538:270-273)
그림 8. Luciferase를 융합한 Cas9 쌍을 활용한 발광 센서의 개략 도(Zhang et al. ACS Synth. Biol. 2017;6:211-216 발췌 및 수정) Fig. 8. Schematic representation of in vitro DNA detection system using a pair of dCas9 proteins linked to split halves of luciferase(Zhang et al. ACS Synth. Biol. 2017;6:211-216)
135 있다. 그러나 55도의 조건이 필요하고, 단일 염기 변이는 검
출할 수 없는 한계가 있다.
DETECTR 와 HOLMES 모두 표적 유전자를 증폭시켜서 형광신호를 판독하는 방식이다(표 2). 그러나 이 외에도 전 기화학적 방식이나 나노 입자를 활용한 방식도 그 자체의 민감성이 있기 때문에 Cas12a를 이용한 핵산 검출 기술에 활용된다. 표 2에서는 CRISPR/Cas 원리를 이용한 대표적인 진 단 기술들에 사용된 Cas 단백질, 표적 유전자, 검출 한계 등의 특성을 비교하고 있다.
SHERLOCK 이 물론 병원체, 인체 유전체, cfDNA (Circulating free DNA) 검출에의 우수성을 보이고 있지만 miRNA는 그 크기가 작기 때문에 증폭에 어려움이 있어 SHERLOCK 기 반의 핵산 검출에는 활용될 수 없었다[71]. 이를 해결하기 위하여 Shan 그룹에서는 형광 신호의 최종 판독이 아닌 형 광신호의 변화율을 측정하여 별도의 증폭과정 없이 검출 한 계 4.5 aM을 보고하였다[72]. 그러나 반응 비율을 측정하 는 데에 실시간 PCR 시스템이 필요하여 기술의 복잡성을 더하였다.
(6) 미세유체 플랫폼
미세 유체나 나노 기술에도 Cas12a를 활용할 수 있다.
Shao 그룹은 자성 분리를 응용한 V-Chip(MAV-chip) 을 개발하여 단일염기 변이 검출 및 정량을 하였다[74](그림 9).
본 기술에서는 CRISPR/Cas12a을 이용한 단일염기변이를 시각적으로 검출할 수 있는 기술을 개발하여 혈청의 다수의 cfDNA 와 암 유발 돌연변이 DNA 식별하였다. 백금 나노 입자와 자성 비드를 단일 가닥 프로브 DNA를 이용하여 연 결한 후 표적 유전자가 있는 경우 Cas12a의 부수적 절단으로 인 해 백금 나노 입자가 방출되는 원리이다.
자성 비드에 단일 가닥 DNA를 이용해서 백금 나노 입자를 붙였다. 위 아래 두개의 슬라이드로 구분된 미세 유체 칩을 이용했는데, 하단 부 슬라이드에는 3개의 챔버를 두었고, 상 부 슬라이드를 이동시킴으로써 각각 연결될 수 있게 하였다.
표적 유전자가 첫 번째 챔버에 들어가게 되면 Cas12a는 백금 나노 입자와 자성 비드를 연결한 단일가닥 DNA를 절단하여 백 금 나노 입자를 떨어뜨린다. 떨어진 백금 나노 입자는 두 번 째 챔버로 이동하게 되고, 자성 비드는 첫 번째 챔버에 남아 있게
그림 9. 백금입자를 활용한 미세유체 칩 상의 CRISPR/Cas 센서의 작동 원리(Shao et al. Anal. Chem. 2019;91:12384-12391. 발췌 및 수정) Fig. 9. Working principle of the platinum nanoreporter-based CRISPR-Cas12a detection system on the microfluidic chip (Shao et al. Anal. Chem. 2019;91:12384-12391)
표 2. CRISPR/Cas를 활용한 형광 검출법의 비교
Table 2. Comparison of CRISPR/Cas based fluorescent biosensing systems
Cas protein Amplification Target Multiplex Quantification Limit Pretreatment
Sherlock[4] Cas13a RPA DNA/RNA × × aM Required
Sherlock v2[29] Cas13a, Cas13b RPA DNA/RNA ○ ○ zM Required
HUDSON* + Sherlock[73] Cas13a RPA DNA/RNA × × aM NO
Holmes[24] Cas12a PCR DNA/RNA × × aM Required
Holmes v2[70] Cas12b LAMP DNA/RNA × ○ aM Required
Detectr[22] Cas12a RPA DNA × × aM Required
*HUDSON - heating unextracted diagnostic samples to obliterate nucleases
