Chapter 11

Chapter 11

Recombination

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11.1 Introduction to homologous recombination

• forms the basis for genetic diversity (유전적 다양성)

• essential for correct segregation of homologous chromosomes in meiosis I HR이 일어나지 않으면 homologous chromosome 끼리 서로 붙어 있지를 못해 random segregation이 일어나 문제가 생김

• is needed to repair double-strand DNA breaks in somatic cells 돌연변이가 일어난 경우 수선을 함

• is also used to repair single-stranded DNA gaps at replication forks

• can restart stalled replication forks

• is needed to maintain telomeres when telomerase is missing

Some purposes for homologous recombination

위의 사항에 대하여 이번 장에서 배울 예정임

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Figure 11.1 Figure 11.2

Mendel의 법칙 발견 이후인 1900년 대 초에 gene의 link에 대하여 생각하기 시작함.

(그림 11.1) 연관된 유전자들과 연관 되지 않은 유전자들 간에 gamete (배우자)의 유전형의 비율이 틀려짐을 발견.

(그림 11.2) Morgan이 초파리의 감수 분열 기간에 상동 염색체간의 crossing over가 일어 나는 것을 발견함. 유전자들이 서로 멀리 위치하면 교차 될 확률이 많다고 주장.

1933년 Nobel 상을 받음. ³

Figure 11.3

Curt Stern이 mitosis 기간에도

crossing over가 일어나는 것을 발견.

복제 후에 상동 염색체의 non sister chromatid간에 교차가 일어남.

homozygous recessive (y/y)는 yellow (sn/sn)은 singed bristle를 나타냄

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Figure 11.4 Meiosis in yeast gives 2:2 segregation for alleles A and a

Mendel의 법칙에 따라서 allele은 배우자에 2:2로 segregation 된다.

그림 11.4 와 다르게 fungi에서 3:1 혹은 1:3의 segregation이 생긴다.

(Neurospora에서는 6:2 혹은 2:6)

이러한 현상은 gene conversion 현상에 의하여 발생함.

주로 Mendel의 법칙을 따르지만 gene conversion 현상이 일어나기도 함.

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Figure 11.7

Figure 11.8

Gene conversion은 flanking region (A와 B 사이)의 reciprocal crossover와 관련이 있다. A와 B는 2A:2a와 2B:2b.

gene conversion이 M에서 일어나 3M:1m이 일어남.

Gene conversion이 M에서 일어 난 후 chromosome replication이 일어나고 복제가 된 후에 M/M과 M/m이 생긴다.

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11.2 Recombination in bacteriophage

Homologous recombination은 진핵세포에만 국한된 것이 아니라 바이러스나 박테리아에서도 일어난다. 이들의 연구를 통해 HR의 물리학적인 성질이나 효소 등을 연구하였다.

위의 그림처럼 phage plaque의 형태를 통해 recombination을 관찰. h^-r⁺, h⁺r^-가 parental type h^-r^-, h⁺r⁺가 recombinant type임.

우측 그림처럼 phage를 다른 배지에서 키운 후 E. coli에 동시에 감염 시키면 DNA duplex

(light blue와 dark blue)간에 break와 rejoining에

의하여 recombination이 일어난다. ⁷

11.3 Recombination in bacteria

Conjugation 후에 recombination이 일어 나는 것을 발견하여 이에 대하 많은 연구를 수행함.

1965년 Clark와 Margulies가 최초의 재조합 돌연변이인 recA를 발견함.

현재는 표 11.1 에 보듯이 30여 가지의 돌연변이가 존재함

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Figure 11.11

11.4 Early models of homologous recombination

1964년 Robin Holliday가 감수분열에서 HR에 대한 model을 창안함.

Two paired chromatids from a homolog pair를 보여줌. 두 개의 symmetric nick이 일어난 후 strand exchange가 일어남.

ligation이 일어나 holliday junction 구조가 생김. Holliday junction에서 branch

migration이 생겨 B 유전자 지역이 heteroduplex region이 됨.

isomerization이 일어나고 resolution 이라는 과정을 통해서 holliday 구조가 두 개의 분리된 nicked duplex로 됨.

즉 cross over (splice) 구조와 non- crossover (patch) 구조로 된다.

이 상황에서 mismatch repair가 일어나 gene conversion이 생긴다.

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Figure 11.13

RecA is a strand exchange protein

Figure 11.12

E.coli는 몇 가지의 recombination pathway를 사용하지만 RecA 단백질은 거의 모든 과정에서 필요하다. RecA는 단일 가닥 DNA나 이중 가닥 DNA에 helical filament로 결합을 한다.

(그림 11.12)

단일 가닥 DNA에 RecA가 결합하면 서열이 유사한 DNA간에 strand exchange의 초기 과정을 촉진한다.

단일 가닥 DNA에 RecA가 결합하면 유사 서열 내에 strand invasion이 일어나게 된다.

strand invasion의 중간과정을 displacement loop (D-loop)의 형성이다.

그림 11.13; 붉은 단일 가닥 DNA가 푸른색의 이중 가닥 DNA 내의 유사서열을 분리하고 invasion을 한다. 이를 RecA 단백질이 촉진 한다. strand exchange 기간에 ATP hydrolysis 가 일어나 RecA가 단일 가닥으로부터 떨어져 나오게 한다.

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RecA가 homologous recombination 에서 중재하는 strand exchange 세 단계

Figure 11.14

• Presynapsis; RecA는 단일 가닥 DNA에 결합하여 helical nucleofilament를 만듬. 이차 구조가 있을때는 SSB가 결합하여 이차 구조를 없애고 RecA 단백질이 결합됨.

2. Synapsis; RecA coated single strand DNA와 이중 가닥 DNA가 접촉을 하여 단일 가닥 DNA로 하여금 유사서열을 찾게 한다.

유사서열이 나란히 배치되면 이중 가닥 DNA의 부분적인 변성이 시작 된다. 변성된 부위의 상보적인 서열에 침입한 단일가닥이 나란히 배열된다. 아직 까지 서로 꼬여진 구조가 아니며 불안전한 구조로 paranemic joint라고 한다. 이 부위에 double helical 지역이 만들어 지며 plectonemic joint라고 한다. Plectonemic joint내의 상보적인 DNA 가닥에 하나 혹은 그 이상의 mismatch나 짧은 결실이나 삽입이 있으면 heteroduplex DNA가 형성된다.

3. DNA heteroduplex extension; plectonemic joint가 형성되면 branch migration에 의하여 heteroduplex 지역이 확장된다. 그 결과 hetero- duplex product와 linear single strand DNA가 형성된다.

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RecBCD processes double-strand break ends

Figure 11.15

RecB, RecC, RecD 단백질은 하나의 복합체로 작용하며 3’→5’ exonuclease, 5’→3’

exonuclease, DNA helicase 활성이 있다.

이들 세가지 활성은 HR을 위해서 이중 가닥의 끝을 자르는 역할을 한다.

RecBCD complex는 이중 가닥의 끝에 결합하여 helicase 활성을 이용하여 이중 가닥을 풀고 각 단일 가닥을 degrade 한다. 단일 가닥을 degradation하는 속도는 서로 틀려 RecBCD가 chi (crossover hotspot instigator)에 도달 할 때 까지 3’ 끝이 빨리 파괴된다. chi 서열은 E. coli genome의 5000bp마다 한번씩 존재하며 서열은 5’-GCTGGTGG-3’ 이다.

chi site를 만나면 3’→5’ exonuclease 활성은 감소하고 5’→3’ 활성이 증가하여 3’ single-strand overhang가 생긴다. 이곳에 RecA가 결합하여 nucleofilament가 만들어져서 homologous duplex 내로 invasion이 일어나 HR이 시작이 된다.

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Figure 11.16

The Meselson-Radding model of recombination is based on single strand nick for initiation

recombination은 항상 symmetric heteroduplex 를 만드는 것이 아니라 한쪽 가닥에만 재조합이 일어난 asymmetric heteroduplex도 만든다.

이를 설명하기 위하여 Meselson과 Radding이 새로운 model을 주장함.

(a) single strand nick이 발생.

(b) nick된 부위의 3’ 끝을 합성하여 5’ 끝이 displace됨

(c) RecA 의 도움으로 유사지역에 strand invasion이 일어나 D-loop가 형성.

(d) D-loop가 잘라짐

(e) branch migration이 일어나고

(f) resolution이 일어나 crossover와 noncrossover 한 것이 생긴다.

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11.5 Transformation in yeast

Figure 11.18

yeast의 plasmid를 Ars 없이 만들고 두 개의 chromosomal DNA 지역 (URA3와 ABC) 을 집어넣는다. 이 plamid는 replicator가 없어 혼자서는 복제가 불가능하고 염색체 내에 integration 되어야만 존재를 할 수 있다.

이때 double strand break를 만들면 염색체 내부로 유사지역을 찾아 recombination이 일어나 integration 되는 확률이 훨씬 높다.

이로부터 recombination의 다른 model인 double strand break model이 나오게 됨.

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11.6 Double-strand break repair model of homologous recombination

Figure 11.19

Meselson-Radding의 single strand break model은 Holliday model의 부족한 점을 설명을 하지만 yeast에서 일어나는 double strand break model이나 meiotic recombination에서 Spo11 단백질에 의하여 형성되는 double-strand break가 recombination을 촉진한다는 사실은 설명을 하지 못하였다.

1983년 Szostak가 double-strand break repair (DSBR) model을 주장함.

1. double strand break이 생겨서 HR이 시작됨

2. nuclease degradation에 의하여 3’ 단일 가닥이 생김.

3. 3’ 단일 가닥이 DNA의 유사 지역을 찾아 D-loop를 형성하고 asymmetric heteroduplex DNA를 형성한다.

4. DNA 중합효소가 3’을 연결한다.

5. 두 번째 3’ 말단도 연결이 된다.

6. 두 개의 holliday junction이 생기며

7. resolution이 blue arrow를 따라 생기느냐 red arrow를 따라 생기느냐에 따라서 non-crossing over 구조와 crossing over 구조가 생긴다.

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11.7 Meiotic recombination

Meiotic recombination은 mitotic recombination에 비하여 훨씬 많은 빈도로 발생한다.

그 이유는 Spo11 단백질 (type II topoisomerase-like protein)이 재조합 초기 단계에

double strand break를 만들기 때문이다. 효모에서 Spo11은 감수분열 시기에 genome당 150-200 break를 만들어 최소한 한 chromosome arm당 하나의 교차가 일어나게 한다.

Spo11이외에 meiotic-specific HR 단백질이 많은 교차를 야기 시킨다.

교차가 한 염색체의 특정 부위에서 일어나면 근처에서 두 번째 교차가 일어나기는 매우 힘들며 이를 interference라고 한다. 이는 염색체당 교차의 수를 제한 하는 역할을 하며 염색체의 segregation을 조절한다.

Meiotic recombination은 synaptonemal complex라는 구조에서 생기며 이 구조는 감수 분열의 pachytene 시기에 염색체를 따라서 형성된다.

Spo11은 감수 분열 시기에만 합성이 되고 typeII topoisomerase와 유사하다. Spo11은 자체의 catalytic site에 있는 tyrosine기를 이용하여 DNA에 결합하여 자른다. 다음으로 Spo11은 MRX와 Sae2에 의하여

떨어져 나오고 이들이 3’-OH를 갖는 단일 가닥을 만든다.

RecA family인 Rad51과 Dmc1이 recombinase로 작용하며 strand invasion, D-loop 형성 등이 일어나서 HR이 일어나게

된다. ¹⁷

There are two distinct phases of meiotic recombination

Figure 11.27

(a) (b)Spo11이 공유 결합을 하여 DNA duplex를 잘라서 double strand break를 만든다

(c) Spo11이 제거됨

(d) (g) strand invasion에 의하여 strand exchange가 일어난다.

(e) (f) second end capture가 일어나며 holliday junction이 생긴다.

resolution에 의하여 crossover가 생긴다.

(h) (i) synthesis-dependent strand- annealing mechanism이 일어나서

cross over가 일어나지 않고 연결이 된다.

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Figure 11.28

11.8 Using mitotic recombination to make gene knockouts

gene knocks; 유전 공학에서 mitotic recombination을 이용하여 특정

유전자를 파괴한다. 즉 HR에 의하여 plasmid나 DNA 분절이 genome내로 integration 될 수 있다.

두 가지 기본적인 knock out 방법이 있으며

gene replacement; 유전자 전체 혹은 해독틀의 일부가 제거되고 selectable marker로 대치되는 경우

gene insertion; 유전자의 내부로 selectable marker가 들어가서 해당 유전자의 활성이 파괴되는 경우.

Gene knockout 은 무작위적으로 들어 갈 수도 있고 HR에 의하여 homology를 이용하여 DNA 분절과 동일한 서열을 가진 부위로 들어 갈수도 있다. 이 경우를 gene targeting이라고 한다.

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Gene knockouts in yeast using a nutritional selectable marker

Gene knockouts by PCR require only short regions of homology

Plasmid가 HR에 의하여 효모의 genome 내로 삽입이 된다.

관심이 있는 유전자의 유사성이 있는 부위를 500-1000bp를 갖는 nutritional selectable marker를 만들고 제한 효소로 자른 후 형질 전환시켜서 integration

시킨다.

관심이 있는 유전자의 앞 부위와 뒤쪽에 약 50 bp의 유사성이 있고 selectable marker의 앞과 뒤에 20bp의 유사성이 있는 primer를 이용하여 selectable marker를 증폭시킨다. 증폭된

marker는 target 유전자와 양끝에 50bp의

유사성이 있지만 효모의 HR에서는 문제가 없다.

형질 전환을 이용하여 integration 시켜서 해당 유전자를 knock out을 시킨다

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Targeted gene knockouts in mice Gene knockout에서 Homologous recombination은 효모 보다 mouse cell에서 훨씬 덜 효율적이다.

이를 개선하는 방법이 1980년대 Capecchi에 의하여 개발되었다.

두 가지 점에서 개선이 됨.

첫째; random insertion을 제거하여 원하는 위치에 insertion 된 것을 선택하는 selection system이 중요 두 번째; mouse blastocyst의 inner cell mass에서 유래한 embryonic stem cell을 이용함.

Figure 11.31

그림 11.31; Capecchi가 실행한 HGPRT 유전자를 파괴한 최초의 실험.

Neo^R을 HGPRT 유전자의 8번 exon 부위로 대치 한 후 정상적인 유전자와

replacement 시킴. HGPRT가 파괴된 경우 6-thioguanine (6-TG)에서 살아나고 (6-TG는 HGPRT⁺cell에게는 독성으로 작용)

Neo^R에 의하여 aminoglycoside antibiotic G418에 살아 남는다. 그러나 제 위치에 교체가 될 확률은 1:1000으로 매우 낮다.

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Positive-negative selection enriches for targeted gene disruption

Figure 11.32

Gene knockout의 효율을 증가 시키기 위하여 Capecchi가 새로운 방법을 발견함 (그림 11.32) positive-negative selection은 두 가지 성분을 갖고 있다.

하나는 관심이 있는 유전자를 Neo^R marker를이용 하여 파괴하고 이를 이용하여 positive selection을 함.

다른 하나는 herpes simplex virus thymidine kinase (HSV-tk)를 이용하여 negative selection을 함.

vector는 유전자의 exon 부위에 Neo^R 유전자가 들어간 부위와 끝에 HSV-tk유전자를 갖고 있음.

(HSV-tk유전자를 갖는 세포는 FIAU에 민감하다.) HSV-tk유전자가 유사성이 있는 부위의 바깥 쪽에 위치하기 때문에 단지 random insertion 된 것만 genome내에 HSV-tk유전자를 갖게 되고 제 위치에 들어간 것은 genome내에 HSV-tk를 갖고 있지 않다.

(b) random insertion 된 것은 Neo^R 유전자와 HSV-tk유전자를 갖고 있어 aminoglycoside antibiotic G418에 저항성이 있고 FIAU에 민감하다. 그러나 (a) gene targeting이 일어난 것은 homologous recombination에 의하여 NeoR 유전자 만 갖고 있어 G418과 FIAU

모두에 저항성을 갖고 있다. ²²

Gene replacement in mice - creation of transgenic mice

Figure 11.33

ES (embryonic stem) cell의 유전자를 파괴시키고 이들을 mouse blastocyst에 다시 주입을 한다.

blastocyst를 사용한 쥐와 주입된 ES 쥐와는 strain이 달라 쥐의 coat color를 보고 disrupted 된 ES에서 유래된 것인가를 알 수가 있다.

Chimeric mouse; 파괴된 ES cell을 주입한 blastocyst 를 다른 암컷 쥐에 착상을 시켜서 자손이 태어난

경우를 말하며 주입된 ES cell로부터 유래한 세포와 blastocyst로부터 유래한 세포들이 섞여있다.

chimeric mice는 두 가지 coat color를 보인다.

test mice와의 교배를 통해 germ line cell 까지 유전자가 knockout 된 것을 찾아낸다.

이를 transgenic mice라고 하며 이들은 knockout 유전자에 대하여 heterozygous 하기 때문에 교배를 통하여 homologous한 것을 만든다.

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Figure 11.34

11.9 Mitotic recombination and DNA

replication

(a) Collapsed fork; 주형 가닥에 nick이 있으면 one-ended double-strand

break가 생기고 이때 strand invasion을 이용하여 holliday junction이 생긴다.

resolution을 통하여 다시 replication fork를 만든다.

(b) Stalled fork; 주형에 손상을 입은 부위를 지나 갈 때 lagging strand는 계속 합성을 하나 leading strand는 합성을 멈춘다. Branch migration에 의해서 fork는 reverse되고 branched structure를

만든다. lagging strand를 주형으로 leading strand 를 합성하고 reverse branch migration을 이용하여 다시 합성이 시작된다.

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Figure 11.35

앞장의 그림에서 나타난 reversed fork intermediate의 사진.

four-pronged replication fork가 DNA 손상에 의하여 복제가 멈추어진 세포에서 관찰이 되었다. (stalled fork에 의하여 생김)

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Figure 11.38

Recombination must be regulated to prevent chromosome rearrangements and genomic instability

Repair와 recombination factor는 genome의 안정성과 해로운 재배치를 막는 역할을 한다. 그러나 이러한 factor들이 결여되면 sister chromatid exchange, nonreciprocal translocation, chromatid break등 여러 가지가 증가하여 문제가 된다.

좌측 그림은 (A) chromatid break가 증가하여

rearrangement가 된 것을 보여준다. (B) chromatid break (C) (D) multiple arm을 갖는 염색분체 그러므로 재조합은 잘 조절 되어야 한다.

중기의 염색체에서 gap이 형성되거나 break가 쉽게 일어나는 부위가 있으며 이를 fragile site라고 한다.

주로 CCG, AGC같은 tandem repeat 지역이며 그림 11.38에서 보듯이 이곳에서 break가 일어나고 break induced replication (BIR)이 일어나면 non- reciprocal translocation이 생긴다.

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11.10 Site-specific recombination

Figure 11.43

Site-specific recombination은 하나 혹은 두 개의 특정 DNA 서열을 이용한 exchange, insertion, deletion등을 말하며 다양한 recombinase에 의하여 촉진된다.

site-specific recombination은 특정 부위와 그 부위를 인식하는 효소에 의하여 알려짐.

주로 immunoglobulin diversity와 transposable element의 작용에 이용된다.

Site-specific recombination에는 transposition, conservative site-specific recombination, target-primed reverse transcription의 세 가지 family가 있으며 앞으로 12장에서 배우게 될 것이다. 11장에서는 기본적인 site-specific recombination 기작에 대하여 배운다.

그림 11.43; 가장 간단한 site-specific recombination의 예 이 기본적인 기작이 약간씩 변형이 되어서 사용된다.

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Mating type switching in yeast

Figure 11.44,45

효모의 mating type switch는 haploid에서 일어나며

diploid에서는 일어나지 않는다. mating type은 MAT locus (특정 유전자를 발현 하게하는 transcription activator를 암호화한다)의 정보에 의하여 결정된다. Mating type switch는 HO유전자 (24bp를 인식하는 endonuclease)의 발현에 의하여 야기된다.

그림 11.44; HO endonuclease가 MAT locus의 특정 부위를 자르면 (double strand break) MAT locus와 HMR혹은 HML 부위와 synthesis-dependent strand-annealing reaction

(SDSA)에 의하여 gene conversion이 일어나 mating type이 교환이 된다. HMR과 HML은 silent cassette임.

MATa가 HO에 의하여 절단되어 MATα로 교환 되는 과정을 조사함

그림 11.45

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V(D)J recombination produces the immune system diversity

Figure 11.47 다양한 pathogen과 antigen에 대하여 많은 항체를 형성하여야 한다.

immunoglobulin gene precursor의 다양한 재조합을 이용하여 10¹¹의 항체를 만들 수 있다 IgG 유전자는 variable (V), diversity (D), joining(J) segment로 됨. 항체의 light chain은 V와 J서열이 constant 서열에 연결되어 만들어지고 heavy chain은 V, D, J segment가 constant 서열에 연결되어 형성된다. 이러한 연결은 B-cell의 발달 중에 somatic

recombination에 의하여 만들어짐.

1) Combinational diversity; V, D, J segment의 재배치에 의하여 생김

2) Junctional diversity; 부정확하며 V, D, J coding segment가 재배치 될 때 연결부위에 nucleotide의 insertion 혹은 deletion에 의하여 발생한다.

3) Pairing diversity; heavy chain과 light chain의 조합에 의하여 발생한다.

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Figure 11.48

V(D)J recombination은 programmed double-strand break에 의하여 일어나며 정확히 연결되어야 한다. 이를 위하여 V,D,J 분절은 recombination signal sequences (RSS)로 flank되어 있으며 RSS는 heptamer와 12혹은23 nucleotide로 된 spacer, nonamer로 되어 있다.

RSS는 RAG-1과 RAG-2 (recombination activating gene)의 표적이며 RAG 유전자는 단지 lymphocyte 발달 기간에만 발현 한다.

(a) RAG 단백질이 RSS와 coding 서열 사이를 공격한다.

(b) RAG•RSS complex가 다른 RAG•RSS complex와 쌍을 이룬다

(c) coding sequence의 끝이 hairpin loop를 만든다. 같은 V나 D 그리고 J가 연결되는 것을 막기 위하여 12/23 rule를 적용 한다. 즉 12bp의 spacer를 갖는 RSS는 23bp의 spacer를 갖는 RSS와 만 연결됨.

(d) hairpin이 Artemis 단백질에 의하여 잘리고 연결된다. 이때 nucleotide의 첨가나 결실이 생겨 ORF가 변하기도 한다.

이 현상은 앞에 언급한 junctional diversity임.

연결 시에는 nonhomologous end-joining factor (NHEJ)가 작용하여 ORF를 연결한다.

Figure 11.49

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