Effect of Low Dose Corticosterone Pretreatment on the Production of LPS-Induced Inflammatory Mediators in Endotoxin-Preexposed Cells

DOI 10.17480/psk.2018.62.1.39

Endotoxin tolerance 유도상태에서 리포폴리사카라이드로 유도된 염증성 매개 인자의 in vitro 생산에 있어서 저농도 corticosterone 전처리 효과

채병숙^#

우석대학교 약학대학 약학과

(Received January 29, 2018; Revised February 23, 2018; Accepted February 23, 2018)

Effect of Low Dose Corticosterone Pretreatment on the Production of LPS-Induced Inflammatory Mediators in Endotoxin-Preexposed Cells

Byeong Suk Chae^#

College of Pharmacy, Woosuk University, Wanju, Jeonbuk, 55338, Republic of Korea

Abstract — Low dose glucocorticoids (GCs) are known to have proinflammatory effects in the LPS-stimulated innate immune cells. To investigate whether preconditioning of low dose corticosterone enhances or not LPS-induced production of inflammatory mediators and heper T (Th) cytokines in endotoxin tolerant cells (ET), RAW 264.7 cells and EL4 cells were pretreated with low dose corticosterone (Cort: 50 and 100 ng/ml) and low dose LPS (50 ng/ml) in fresh complete medium once a day for 3 days and then cultured in fresh complete medium for 6 hr or 24 hr in the presence or absence of LPS (1~10μg/ml) or Con A. In the present study, the results demonstrated that Cort pretreatment strongly enhanced LPS- induced production of TNF-α, IL-6, IL-10, PGE₂ and NO by RAW 264.7 cells in a dose-dependent manner in control, whereas Cort pretreatment didn’t affect LPS-induced production of TNF-α, IL-10, PGE₂ but

significantly

Keywords Endotoxin tolerance, Corticosterone pretreatment, TNF-α, IL-6, IL-10, IFN-γ, PGE₂, NO

Endotoxin은 선천성 면역계의 자극에 의하여 Toll-like receptor (TLR) 4를 통한 TNF-α, IL-1, IL-6, IL-8, IFN-γ, PGE₂ 및 acute phase protein 등과 같은 pro-inflammatory mediator의 과생산을 유도하지만 동시에 IL-10 및 TGF-β와 같은 anti-inflammatory cytokine 생산을 유도하여 급성염증반응이 빠르게 회복되는 양 상을 보인다.¹⁾그런데 낮은 용량의 LPS에 미리 노출시킨 후 유

도되는 endotoxin tolerance(ET) 상태에서는 연속적 고용량 endotoxin 처리 시 마크로파지와 같은 innate immune cell에 의 한 TNF-α, IL-1β, IL-6 및 PGE₂ 등 pro-inflammatory mediator 생산은 억제되고 IL-10과 같은 anti-inflammatory cytokine 생산 증가가 유도됨으로써 염증반응 유발이 억제됨을 보여주고 있으며, 이런 ET 상태는 이차 감염에 따른 endotoxin shock이나 사망으 로부터 innate immunity 억제에 따른 보호효과를 갖는 특징을 지 닌다.^2,3)그런데 임상적으로는 장기간에 걸쳐 ET를 유지하는 sepsis 상태에서 오히려 이차 감염에 대한 치사율이 높은 것으로 나타났 는데, 이는 ET에서 pro-inflammatory cytokine의 생산 억제에 따 른 선천성면역 무반응상태가 관여할 것으로 보고있다.^4,5)

Endotoxin tolerance 상태에서 이차감염에 따른 치사율은 스

#

Corresponding Author Byeong Suk Chae

College of Pharmacy, Woosuk University, Wanju, Jeonbuk, 55338, Republic of Korea

Tel.: 063-290-1426 Fax.: 063-290-1561 E-mail: [email protected]

Short Report

트레스 시스템의 하나인 시상하부-뇌하수체-부신(hypothalamic- pituitary-adrenal: HPA) 축의 활성화 및 glucocorticoids(GCs) 생 산 등과 관련성을 지닌다.⁶⁾ ET의 특징을 보이는 sepsis에서 이 차 감염에 따른 높은 치사율은 부신의 불충분성 및 HPA 축의 무반응성 유발이 기여하는 것으로 보고되었다.^7,8)특히 부신 기 능이 정상인 sepsis 환자에 비하여 부신 기능이 저하된 septic shock 및 sepsis 환자의 경우 사망률이 높았고, GCs가 저하된 sepsis에서 나타나는 이차 감염에 대한 면역능 저하는 조직 및 장 기손상, 더 나아가서는 높은 치사율과도 유관함이 관찰되었다.^9,10) 따라서 sepsis의 미래 치료적 접근으로 neuroimmunomodulation이 중요한 역할을 차지할 것으로 보고있다.¹¹⁾

Endotoxin은 HPA 축의 활성화 반응을 유도하며, 그에 따라 생 산된 GCs는 면역반응 및 염증반응 등의 억제를 매개하여 감염 에 대한 보호작용을 갖는다.^12,13) GCs는 약리적 농도에서 in vivo 및 in vitro에서 LPS로 유도되는 monocyte의 CD14 활성 억제 효과를 가졌고 TNF-α, IL-1, IL-6, PGE₂, COX2 및 NO 생산 등 의 억제작용이 관찰되었으며,^14,15)임상에서는 GCs를 자가면역 및 염증반응 등을 억제하거나 장기이식 후 면역거부반응의 치료 목적으로 사용되어 왔다.¹⁶⁾또한 임상에서 항염증 작용을 지니 는 GCs는 약리적인 농도에서 endotoxemia 치료목적 및 septic shock을 개선시키기 위해 사용되어 왔지만, 일반적으로 septic shock 치료에 GCs 고용량이나 저용량이 효과적이지 못하며 그 효능에 대하여 아직 논란이 되고 있다.^17-19)

그런데 GCs는 약리적 고농도의 항염증효과와는 반대로 생리 적 수준의 저농도의 전처리에서는 endotoxin에 의해 유도되는 면역반응이 증가되고 그에 따른 염증성 매개인자들의 생산이 증 가됨을 보였다. 저농도 GCs의 전처리는 in vivo 및 in vitro에서 LPS로 유도되는 면역반응 및 proinflammatory cytokine 생산 증 가에 따른 염증반응이 오히려 촉진되었다.^20-22)또한 역으로 TNF- α, IL-6, IL-1β 및 NO 등과 같은 inflammatory mediator는 스트 레스 시스템의 주요 구성물질을 활성화시키고 HPA 축을 자극하 며 cortisol 혈중농도 증가 및 GCs 저항성 등을 유발하는데 관 여하였다.²³⁾뿐만 아니라 육체적·정신적인 만성 스트레스에 의한 HPA 축의 만성 활성화는 GCs 혈중농도의 저수준 상승 상태를 유

도한다.^24,25)우울증과 같은 반복된 만성스트레스나 염증성 질환은

HPA 축의 만성 활성화 유발, GCs의 생산증가, negative feedback inhibitory effect 저하 및 GCs 저항성 증가 등에 따른 낮은 수준 의 만성 hypercortisolemia와 관련성을 지닌다.^26,27)따라서 내인 성 GCs는 감염에 따른 병원균의 과도한 면역반응 및 염증반응 을 제한하기 위한 보호작용의 하나로써 작용함에도 불구하고,²⁰⁾ 반복적인 만성스트레스에 따른 저수준 GCs preconditioning은 면역활성화 및 염증유발을 촉진할 가능성을 지닌다.

따라서 sepsis에서 나타나는 이차감염에 따른 조직손상 및 사 망률 증가에 있어서 저농도 GCs preconditioning이 하나의 risk

factor로서 작용할 수 있으나, ET 상태에서 저농도 GCs의 preconditioning이 LPS가 유도하는 면역생물학적 반응에 미치는 영향에 대해서는 불확실한 상태에 있다. 더구나 ET 상태 또는 GCs는 각각 Th1/Th2 ratio를 Th2 반응으로 향하게 하는 효과를 지님으로써 세포성 면역억제효과를 갖지만,^28,29) ET상태에서 저 농도 GCs 전처리가 LPS 자극에 의한 T cell의 면역반응에 미치 는 영향에 대하여는 밝혀져있지 않다. 따라서 본 연구는 endotoxin tolerance 상태에서 생리적 저농도 수준의 GCs preconditioning 이 이차적 LPS 자극으로 유도되는 innate immune cell의 염증 반응 및 T cell 반응 등에 어떠한 변화를 유발하는지를 알아보기 위하여, 저농도의 LPS(50 ng/ml)로 반복 노출시켜 endotoxin tolerance를 유도한 RAW 264.7 cell 및 EL4 cell에서 저농도 corticosterone(Cort 50 and 100 ng/ml) 전처리가 고용량 endotoxin 으로 유도되는 염증성 매개인자 및 Th cytokine 생산에 미치는 영 향에 대하여 실험을 실시하였다.

실험방법 (Experimental Methods)

재료 및 시약

RAW 264.7 cell 및 EL4 cell은 한국세포주은행(Seoul, Korea) 에서 구매를 했다.

세포 배양

RAW 264.7 cell 및 EL4 cell은 10% fetal bovine serum (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA), penicillin 100 U/

ml, streptomycin 100 μg/ml(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 및 antimycotic Amphotericin B(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 함유한 DMEM 배지(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)에 서 배양하였다. 그 RAW 264.7 cell 및 EL4 cell는 매일 새 배지 로 갈아주면서 LPS 50 ng/ml, corticosterone(Cort) 50 및 Cort 100 ng/ml로 3일 동안 하루 1번씩 일정시간에 처리하였다. 마지 막 처리 후 24 hr 후에 새 배지로 갈아준 다음 RAW 264.7 cell 은 LPS 1 μg/ml, EL4 cell은 LPS 10 μg/ml 또는 Con A 10 μg/

ml 존재 또는 부재하에서 5% CO₂ incubator에서 37^oC로 TNF- α 생산을 위해서는 6 hr, 그 나머지를 위해서는 24 hr 동안 배양 하였으며 그 후 세포배양액을 채취하여 cytokine, PGE₂및 NO 측정을 위해 −70^oC에 보관하였다.

Cytokine의 측정

RAW 264.7 cell 또는 EL4 cell의 보관된 세포배양액 중 TNF- α, IL-6, IL-10 및 IFN-γ 등 cytokine의 농도측정은 cytokine monoclonal antobodies(BD Biosciences Pharmingen, USA)를 이용하여 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay) 방법으 로 실시되었고, ELISA microplate reader(Molecular Devices

Co., Ltd., USA)를 사용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.

각 결과는 ml당 picogram 단위에서 정량하였으며 최저농도의 한 계는 5 pg/ml이상으로 하였다.

PGE₂측정

RAW 264.7 cell 배양액에서의 PGE₂ 농도는 monoclonal antibody/enzyme immunoassay kit(Cayman Chemicals, MI, USA)를 사용하여 ELISA microplate reader를 사용하여 405 nm 에서 흡광도를 측정하여 정량하였고 최저농도의 한계는 5 pg/ml 이상으로 하였다.

NO 측정

RAW 264.7 cell로부터 얻어진 세포배양액 중 NO 농도 측정 은 96-well plate에 시료 100 μl에 Griess reagent 100 μl를 가한 후 10분에 ELISA microplate reader를 사용하여 540 nm에서 흡 광도를 측정하였다.

통계학적 분석

모든 자료는 means±standard error(S.E.)로 나타냈으며, 유의 성 검사는 Students’ t-test로 행하였다.

결과 및 고찰 (Results and Discussion)

Endotoxin을 반복 노출시킨 RAW 264.7 cell에 의한 cytokine 의 생산에 있어서 저농도 corticosterone의 전처리 효과

반복된 만성스트레스와 만성염증질환에서 그에 따른 HPA 축 의 만성 활성화는 GCs의 생산을 높이며, 여러 원인에 의해 GCs 의 negative feedback inhibitory effect가 저하되었을 때 만성적 저수준의 hypercortisolemia를 나타내게 된다.^26,27)약리적 고농 도의 GCs의 면역억제 및 항염증효과와는 반대로 육체적·정신적 인 만성 스트레스에 따른 저수준 혈중농도의 GCs preconditioning 상태는 endotoxin에 의해 유도되는 면역활성화 및 염증성 매개 인자들 생산을 in vivo 및 in vitro에서 증가시킴을 보였다.^21,22)본 연구는 저수준의 HPA 축의 활성화 및 GCs의 생산에 의한 preconditioning이 endotoxin tolerance에 의해 유도되는 염증관련 innate immune response나 T cell 반응에 있어서 어떠한 변화를 유도하는지를 알아보고자 하였다.

Endotoxin tolerance(ET)는 in vitro에서 저농도 LPS (>

10 ng/ml)에 의해 노출된 macrophage가 연속적인 2차 LPS 고농 도 처리 시 염증성 innate immune response의 무반응성 상태를 유도함으로써 감염이나 조직손상에 대하여 보호효과를 지니는 상태를 말한다.^2,3) Chae³⁰⁾의 이전 연구에 따르면, RAW 264.7 cell에서 LPS 50 ng/ml를 3일간 일정한 시간에 3번 반복 처리하 고 매일 배지를 갈아주었으며, 4일째 되는 날 새 배지에서 고용

량의 LPS를 투여하였을 때, TNF-α, IL-6 및 PGE₂등의 생산 억제가 관찰됨으로써 저농도 LPS 50 ng/ml의 3번 반복된 전처 리가 ET를 유도시킴을 확인하였고, 본 연구에서 이와 동일한 방 법으로 ET를 유도하였다. 또한 Chae³¹⁾는 RAW 264.7 cell에서 corticosterone 50 및 100 ng/ml의 전처리가 LPS에 의한 TNF- α, IL-6 및 IL-1β 등의 생산을 증가시켜 염증유발효과를 나타냄 을 관찰하였다. 따라서 본 연구는 저농도 LPS(50 ng/ml)에 반복 노출된 ET 상태에서 저농도 Cort 50 및 Cort 100 ng/ml 전처리 가 고농도 LPS로 유도되는 마크로파지의 염증반응 및 T cell의

Fig. 1 − Pretreatment of low dose corticosterone on the production of cytokines in endotoxin-repeated exposed RAW 264.7 cells.

RAW 264.7 cells were pretreated with low dose corticosterone

(Cort50: corticosterone 50 ng/ml; Cort100: corticosterone

100 ng/ml) and low dose LPS (50 ng/ml) in fresh complete

medium once a day for 3 days and then cultured in fresh

complete medium for 6 hr for TNF-α or 24 hr for the other

cytokines in the absence of LPS. Concentration of cytokines

was measured using ELISA. Each value represents the

mean±S.E. * (p<0.05) and ** (p<0.01): Significantly different

from the value in each vehicle.

면역반응 등에 어떠한 변화를 유발할 수 있는지를 관찰하였다.

본 연구에서 RAW 264.7 cell은 저농도인 LPS 50 ng/ml 또는 저농도 corticosterone(Cort) 50 및 100 ng/ml를 3일간 일정한 시 간에 동시에 3번 반복 처리하면서 매일 새배지로 갈아주었고, 4 일째 되는 날은 새 배지에서 TNF-α 생산을 위해서는 6 hr, 그 나머지 inflammatory mediator를 위해서는 24 hr 배양하였으며, 그로부터 세포배양액을 채취하여 cytokine 농도를 측정하였다.

그 결과는 Fig. 1에서 보여주는 바와 같이, 반복된 저농도 Cort 전처리가 control에서 농도 의존적으로 TNF-α, IL-6 및 IL-10 등 의 생산을 증가시켰으며, 저농도의 GC가 pro-inflammatory effect 를 지닌다는 많은 증거들^20,22)을 지지하고 있다. 또한 이는 육체 적·정신적인 만성 스트레스에 의한 HPA 축의 만성 활성화^24,25) 는 GCs 혈중농도의 저수준 상승 상태를 유도하는데 이런 저수 준의 GCs preconditioning이 마크로파지의 면역 활성화 및 염증 성 매개인자들의 생산을 증가시켜 염증반응을 유도할 수 있음을 시사하고 있다. 한편 endotoxin tolerance(ET) 상태는 마크로파 지와 같은 pro-inflammatory mediator 생산 억제 등 innate immune cell의 면역활성 저하효과의 특징을 지니는데,^2,3)임상적 으로는 ET의 특징을 보이는 sepsis에서 염증유발 및 장기손상에 대한 높은 위험성을 갖는다.³²⁾본 연구에서, 저농도 LPS로 반복 처리하여 유발된 ET 특성을 지닌 RAW 264.7 cell에서는 반복된 저농도 Cort 전처리가 TNF-α, IL-6 및 IL-10 생산을 유의성 있 게 억제하였다. 이는 저농도의 반복된 Cort 전처리가 저농도 endotoxin 반복 투여로 이미 활성화된 마크로파지를 억제하여 TNF-α, IL-6 및 IL-10 등의 생산을 저하시켰을 것이다. 따라서 반 복적인 만성스트레스에 따른 저수준 GCs preconditioning^26,27)는 이차감염이 없는 sepsis 상태에서 TNF-α, IL-6 및 IL-10 생산을 억제할 것으로 사료된다.

Endotoxin을 반복 노출시킨 RAW 264.7 cell에서 LPS에 의해 유도된 cytokine 생산에 있어서 저농도 corticosterone 의 전처리 효과

LPS는 마크로파지를 자극하여 염증성 매개인자들의 생산을 증 가시켜 강력한 염증반응을 촉진하지만,¹⁾ endotoxin tolerance 상 태에서는 이차 감염에 대해 innate immune cell의 LPS 대한 무 반응성을 나타냄으로서 보호효과를 지닌다.^2,3)그런데 endotoxin tolerance의 무반응성은 임상적으로 sepsis에서 이차감염에 대한 장기손상 및 높은 치사율 등의 위험성을 높이는 것으로 알려져 있으나 그 위험성 인자에 대해서는 불명확하다.^4,5)저용량의 GCs 치료가 무반응성 복부 septic shock의 치사율을 낮추었다는 보 고³³⁾및 오히려 저용량GCs 치료가 septic shock에 치사율을 낮 추지 못했다는 보고³⁴⁾등 저용량 GCs 치료 효과에 대해서 상반 된 결과를 나타내고있다. 또한 저농도 GCs의 전처리는 마크로 파지에서 cytokine 과생산 및 nuclear factor-kappaB 활성화를

유도하였고²¹⁾ 사람에게 stress cortisol을 전처리하였을 때 endotoxin으로 유도되는 전신성 염증반응을 증가시키는 것으로 나타났다.²²⁾ 본 연구는 저농도 LPS에 의해 반복노출시켜 endotoxin tolerance가 유도된 마크로파지에서 만성 스트레스 상 태에서 관찰될 수 있는 저농도 GCs의 반복된 전처리가 고용량 LPS에 의한 cytokine 생산에 어떠한 영향을 주는지를 알아보았 다. 본 연구에서 RAW 264.7 cell에서의 세포배양은 Fig. 1과 같 은 방법으로 실시하였고, 다만 4일째 되는 날 새 배지로 갈아 준 다음 고용량 LPS 1 μg/ml 존재 하에서 TNF-α를 위해서는 6 hr,

Fig. 2 − Pretreatment of low dose corticosterone on the LPS- induced production of cytokines in endotoxin-toleranted RAW 264.7 cells.

RAW 264.7 cells were pretreated with low dose corticosterone (Cort50: 50 ng/ml; Cort100: 100 ng/ml) and low dose LPS (50 ng/ml) in fresh complete medium once a day for 3 days and then cultured in fresh complete medium for 6 hr for TNF-α or 24 hr for the other cytokines in the presence of LPS (1μg/ml).

Concentration of cytokines was measured using ELISA. Each value represents the mean± S.E. Other legends and methods are the same as in Fig. 1. * (p<0.05) and ** (p<0.01):

Significantly different from the value in each vehicle.

그 나머지 inflammatory mediator 생산을 위해서는 24 hr 배양 하였다. 그 결과, Fig. 2에서 보여주는 바와 같이, control에서 반 복된 저농도 Cort 전처리가 RAW 264.7 cell에서 LPS 자극으로 유도되는 TNF-α 생산을 5.13배, IL-6는 15.39배 및 IL-10는 87.60배까지 농도의존적으로 월등히 증가시켰는데, 이는 저농도 Cort 전처리가 macrophage의 활성을 높여 LPS에 의해 유도되 는 proinflammatory 및 anti-inflammatory cytokine 생산을 월등 히 증가시켜 염증유발효과를 지님을 시사하고 있고, 또한 이 연 구결과는 저농도 GCs의 전처리는 in vivo 및 in vitro에서 LPS 로 유도되는 면역반응 및 proinflammatory cytokine 생산 증가 에 따른 염증반응이 오히려 촉진되었다는 많은 연구결과들을 지 지하고 있다.^20-22)

본 연구에서 ET 처리된 RAW 264.7 cell에서는 반복된 저농 도 Cort 전처리가 고용량 LPS에 유도된 TNF-α 및 IL-10의 생산 에는 영향을 미치지 못하였으나 IL-6 생산은 약간 증가시켰다. 이 는 sepsis와 같은 ET에서 반복된 저농도 Cort 전처리가 ET에 의해 면역활성이 저하된 마크로파지를 자극하여 LPS에 의해 유 도되는 IL-6의 생산을 약간 증가시킴으로써 낮은 수준의 염증 반응을 유도할 수 있으며, IL-6의 낮은수준의 만성적 혈중농도의 증가는 저수준 만성 전신성 염증성 질환과 유관할 수 있어 그에 대한 많은 연구가 요구된다.

Endotoxin을 반복 노출시킨 RAW 264.7 cell에서 LPS에 의해 유도된 PGE₂ 생산에 있어서 저농도 corticosterone의 전처리 효과

Endotoxin은 마크로파지에서 PGE₂생산을 증가시키는 것으로 잘알려져 있지만, ET에서는 COX2 발현 및 PGE₂와 같은 eicosanoids 생산 등이 억제됨을 보여준다.^30,34) 한편 GCs는 약리 적 농도에서 LPS에 의해 유도되는 PGE₂생산을 억제하지만,¹⁵⁾ 만성적 스트레스나 반복된 우울증에 따른 저수준 GCs의 증가는 HPA 축의 negative feedback inhibition의 저하에 따른 HPA 활 성화를 유도하며 COX2 및 PGE₂의 증가의 특징을 보인다.^35,36) 그런데 저농도 GCs preconditioning이 ET에 의해 억제된 LPS 로 유도되는 PGE₂생산에 미치는 영향에 대하여는 불확실하다.

본 연구에서, RAW 264.7 cell에서의 세포배양은 Fig. 1과 같은 방법으로 실시하였고, 다만 4일째 되는 날 새 배지로 갈아 준 다 음 고용량 LPS 1 μg/ml 존재 하에서 24 hr 배양하였다. 그 결과, Fig. 3A에서 보여주는 바와 같이, 반복된 저농도 Cort 전처리가 control에서는 고용량 LPS 부재 하에서 RAW 264.7 cell에 의한 PGE₂ 생산을 5.48배까지 농도 의존적으로 증가시켰으나, 반면에 ET에서는 1.21배 까지 미약하게 증가시켰다. 반복된 저농도 Cort 전처리가 control에서는 LPS로 유도되는 PGE₂생산을 유의성 있 게 증가시켰으나, ET에서는 변화를 유도하지 못하였다(Fig. 3B).

이는 저농도 Cort precondionting이 마크로파지에서 LPS에 의한

PGE₂생산증가를 유도하여 염증반응을 유발하지만 마크로파지 의 활성이 억제된 ET 상태에서는 LPS에 의해 PGE₂생산증가 를 유도하지 못할 것으로 사료된다.

Endotoxin을 반복 노출시킨 RAW 264.7 cell에서 LPS에 의해 유도된 NO 생산에 있어서 저농도 corticosterone의 전처 리 효과

NO(nitric oxide)와 같은 reactive oxygen species(ROS)의 생산 은 염증유발은 물론 조직 손상을 유도하고 세포의 정상적 대사를 저해하는 효과를 지니는 inflammatory mediator로써 작용한다.^37,38) NO는 우울증이나 반복된 스트레스 또는 inflammatory cytokine 에 의하여 유도될 수 있으며 뇌에서 신경전달물질로서 역할을 한 다.^35,36)

본 연구는 RAW 264.7 cell에서의 세포배양은 Fig. 1과 같은 방법으로 실시하였고, 다만 4일째 되는 날 새 배지로 갈아 준 다 음 고용량 LPS 1 μg/ml 존재 하에서 24 hr 배양하였다. Chae³⁰⁾ 는 전 연구에서 본 연구와 같은 실험방법으로 ET를 유도한 RAW 264.7 cell에서 농도의존적으로 LPS에 의한 NO 생산이 증가됨

Fig. 3 − Pretreatment of low dose corticosterone on the LPS- induced production of PGE

in endotoxin-toleranted RAW 264.7 cells.

A : in the absence of LPS (1 μg/ml); B : in the presence of LPS (1 μg/ml). RAW 264.7 cells were pretreated with low dose corticosterone (Cort50: 50 ng/ml; Cort100: 100 ng/

ml) and low dose LPS (50 ng/ml) in fresh complete medium once a day for 3 days and then cultured in fresh complete medium for 24 hr in the presence of LPS (1 μg/

ml). Concentration of cytokines was measured using

ELISA. Each value represents the mean±S.E. Other

legends and methods are the same as in Fig. 1. * (p<0.05)

and ** (p<0.01): Significantly different from the value in

each vehicle.

을 보여주었다. 본 연구 결과 Fig. 4에서 보여주는 바와 같이, 반 복된 저농도 Cort 전처리가 control에서 RAW 264.7 cell에서 고 용량 LPS 부재 하에서 NO생산을 2.16배까지, LPS 존재하에서 는 3.97배까지 유의성 있게 농도의존적으로 증가시켰다. 반면에 ET에서는 반복적 저농도 Cort로 전처리함으로서 LPS 자극 부재 하에서 1.30배까지 미약하게 증가시켰으며 LPS 존재하에서는 1.10 배 증가를 유도하였다. 따라서 이는 저농도 Cort precondionting 이 마크로파지에서 LPS 존재 및 부재 하에서 NO 생성을 농도의 존적으로 월등히 증가시키지만, ET 상태에서는 LPS에 의한 NO 생산능을 증가시켜 산화성 스트레스 및 그에 따른 염증반응을 유 도할 것이나 그 변화의 폭은 매우 미약할 것으로 사료된다. 또한 마크로파지에 의한 IL-6 및 NO 생산증가는 서로 양방향으로 영 향을 주어 시너지효과를 가질 것이다.

Endotoxin을 반복 노출시킨 EL4 cell에서 Con A에 의해 유 도된 cytokine 생산에 있어서 저농도 corticosterone의 전처리

효과

T cell의 면역반응은 antigen-presenting cell에 의한 선천성 면 역반응에 의해 조절되며, 특히 Th1 cell은 IFN-γ, IL-2 및 TNF- β를 생산하여 Th1 면역반응을 촉진하는데 비해 Th2 cell은 IL- 4, IL-10, IL-13를 생산하여 Th2 면역반응을 유발하는 것으로 잘 알려져있다. Endotoxin tolerance 상태의 adaptive immunity에 서는 regulatory T cell 활성 증가와 함께 IL-2 및 IFN-γ 생산은 억제되고 IL-4 및 IL-6 생산은 촉진되어 Th1/Th2 균형을 Th2로 향하게 함으로써 세포성면역반응 억제와 체액성면역반응 촉진을 유발하며 병적으로는 allergic inflammation 유발 가능성을 높이 는 특징을 지닌다.^39-41)한편 GCs는 monocyte의 IL-12를 억제 하며 항염증성 IL-10 생산에는 영향을 주지 않으나, Th cell의 IL-10 및 IL-4 생산을 유도하고 특히 regulatory T cell 활성을 증가시켜 Th1/Th2 ratio를 Th2 반응으로 전환함으로써 ET와 유 사하게 세포성면역 억제효과를 나타낸다.^28,42)그런데 저농도 GCs 의 획득면역에 대한 효과는 논란이 되고 있다. 만성스트레스를 가할 경우 증가된 corticosterone이 IL-2, IL-4 및 TGF-β1 혈중 농도 증가와 상관성을 지녔으며, 비장세포에서 Con A로 자극함 으로써 IFN-γ, IL-4 및 IL-10 생산을 높였다는 보고에 의하면,⁴³⁾ 저수준의 GCs가 Th1 및 Th2 cytokine 생산을 둘 다 높일 수 있음을 시사하고 있다. 몇몇 연구에서는 저수준의 GCs 상승과 유관한 만성스트레스가 Th1/Th2을 Th2 반응으로 전환하는 것 으로 나타났다.^44,45)또한 GCs가 Th2 로 향한 체액성면역을 높 이는데 비해 GCs의 생리적 농도는 murine bone marrow B cell 의 항원반응을 억제시킨 것으로 나타났는데 이는 저농도 GCs가 체액성 면역을 억제시킬 수 있음을 시사하고 있다.⁴⁶⁾

본 연구에서는 저농도 LPS에 의해 반복 노출된 EL4 cell에서 T cell 자극제인 Con A 10 μg/ml에 의한 cytokine 생산능에 있 어서 Cort 반복 전처리의 효과를 알아보고자 하였다. EL4 cell 에서 LPS 50 ng/ml 또는 Cort 50 및 100 ng/ml를 동시에 3일간 일정한 시간에 3번 반복 처리하였고 매일 배지를 갈아주었으며, 4일째 되는 날 새 배지로 갈아 준 다음 Con A 10 μg/ml 존재 하 에서 24 hr 배양하였다. 실험한 결과(Fig. 5), 반복된 저농도 Cort 전처리가 control에서는 Con A 자극으로 유도되는 IFN-γ 및 IL- 10 생산을 증가시켰으며, 그 IFN-γ/IL-10 ratio는 vehicle, Cort 50 및 Cort 100에서 각각 3.28, 4.19, 6.26으로 나타냄으로써 Cort 전처리에 의하여 특히 Th1/Th2 ratio에서 Th1 반응으로 더 욱 촉진될 수 있음을 보여주고 있다. 반면에 ET에서는 반복된 저농도 Cort 전처리가 IFN-γ 생산은 변화를 유도하지 못하였으 나 IL-10 생산은 Cort 50 ng/ml 전처리에서 억제되었고 Cort 100 ng/ml 처리 시는 월등히 증가됨을 보여주었으며, 그 IFN-γ/

IL-10 ratio는 vehicle, Cort 50 및 Cort 100에서 각각 2.71, 0.60 및 2.47 등을 나타냈다. 따라서 이는 반복된 저농도 Cort 전 처리가 Con A로 T cell를 자극하였을 때 Th1 및 Th2 cytokine

Fig. 4 − Pretreatment of low dose corticosterone on the LPS-

induced production of NO in endotoxin-toleranted RAW 264.7 cells.

A : in the absence of LPS (1 μg/ml); B : in the presence of LPS (1 μg/ml). RAW 264.7 cells were pretreated with low dose corticosterone (Cort50: 50 ng/ml; Cort100: 100 ng/

ml) and low dose LPS (50 ng/ml) in fresh complete medium once a day for 3 days and then cultured in fresh complete medium for 24 hr in the presence of LPS (1 μg/

ml). Concentration of cytokines was measured using

ELISA. Each value represents the mean ± S.E. Other

legends and methods are the same as in Fig. 1. * (p<0.05)

and ** (p<0.01): Significantly different from the value in

each vehicle.

생산을 유도하며 결국 Th1 반응 활성화로 향해 세포성면역 활 성화 효과를 가지지만, ET에서는 특히 Cort 50 전처리에서 Th1/

Th2 ratio가 Th2 반응활성화으로 향하여 결과적으로 세포성면역 이 억제되는 결과를 가져올 것이며 농도범위에 민감하게 작용할 것으로 사료된다.

저농도의 endotoxin을 반복 노출시킨 EL4 cell에서 LPS에 의해 유도된 cytokine 생산에 있어서 저농도 corticosterone 의 전처리 효과

LPS는 강력한 T-independent antigen으로써 Th1/Th2 균형을 Th2 로 기울게 하여 체액성면역 유발효과를 갖는 것으로 알려져 있다. Sepsis에서 ET로 유도되는 선천성 면역억제는 획득면역 억제로 인한 이차감염에 따른 장기손상 및 사망률을 높이는데, 이는 특히 Th1 반응 저하와 유관할 것으로 보고되었고⁴⁷⁾ ET는 endotoxin에 의한 반응에서 IFN-γ 생산 장애를 나타내는데,⁴⁸⁾ sepsis에서 선천성면역 무반응성은 recombinant IFN-γ 치료요법 으로 회복됨을 나타냈다.⁴⁹⁾ 이는 ET가 T세포의 면역억제와 체 액성 면역 증가 효과와 유관함을 보여준다.

본 연구에서 EL4 cell에서의 세포배양은 Fig. 4와 같은 방법 으로 실시하였고, 다만 4일째 되는 날 새 배지로 갈아 준 다음 LPS 10μg/ml 존재 하에서 24 hr 배양하여 세포배양액의 cytokine 농도를 측정하였다. 그 결과(Fig. 6)에 의하면, control 에서는 반복된 저농도 Cort 전처리가 고농도 LPS 자극으로 유 도되는 EL4 cell에 의한 IFN-γ 및 IL-10 생산을 증가시켰고 IFN- γ/IL-10 ratio는 vehicle, Cort 50 및 Cort 100에서 각각 5.61, 2.86 및 3.06으로 얻어졌는데, 이는 Cort 전처리에 의하여 특히 Th1/Th2 ratio에서 Th2 반응으로 더욱 촉진되어 세포성 면역은 억제되고 체액성 면역이 유도될 수 있음 보여준다 그런데 ET에 서는 반복된 저농도 Cort 전처리가 고농도 LPS에 의해 IFN-γ 및 IL-10 생산에 변화를 유도하지 못하였고 그 IFN-γ/IL-10 ratio 는 vehicle, Cort 50 및 Cort 100에서 각각 0.4, 3.24 및 2.8로 나타냈는데, 이는 ET에서 반복된 저농도 Cort 전처리가 Th1/

Th2 ratio에서 Th1 반응으로 향할 수 있음과 염증성 세포의 면 역활성화가 유도 될 수 있음을 나타낸다.

심한 sepsis 환자를 치료하기 위해 사용된 GCs는 생쥐의 bone marrow B cell의 항원반응을 억제하는 것으로 나타났는데,⁴⁴⁾이 는 ET 상태에서 약리적 농도의 GCs가 체액성 면역을 억제시킴 을 보여준다. 이와 반대로 GCs가 생쥐의 endotoxin tolerance 확 립을 억제하고 LPS에 의해 억제된 humoral immune response 를 부분적으로 회복하는 것으로 관찰되었고⁶⁾, 스트레스 하에서 Th1/Th2 패턴이 Th2로 향하였으며 질병에 대한 민감성을 나타냈 다고 보고하였는데²⁸⁾, 이는 저농도 GCs preconditioning이 LPS에 의한 자극으로 Th1/Th2 ratio에서 Th2 반응으로 향하게 할 가 능성을 지님을 보여주고 있다. 그런데 본 연구에서는 ET 상태에

Fig. 5 − Pretreatment of low dose corticosterone on the Con A-

induced production of cytokines in endotoxin-toleranted EL4 cells.

(1)A : control; (1)B : ET (2) : IFN-γ/IL-10 ratio. EL4 cells were pretreated with low dose corticosterone (Cort50:

50 ng/ml; Cort100: 100 ng/ml) and low dose LPS (50 ng/

ml) in fresh complete medium once a day for 3 days and then cultured in fresh complete medium for 24 hr in the presence of Con A (10 μg/ml). Concentration of cytokines was measured using ELISA. Each value represents the mean

± S.E. Other legends and methods are the same as in Fig. 1.

* (p<0.05) and ** (p<0.01): Significantly different from the

value in each vehicle.

서 반복된 저농도 Cort 전처리가 LPS 자극으로 IFN-γ/IL-10 ratio 증가를 유발하여 세포성 면역 증강효과를 가져올 것으로 사 료되며 이러한 세포성면역 증가는 무반응성 선천성면역을 회복 하고 동시에 염증성 면역세포 활성화에 따른 proinflammatory cytokine 생산을 과도하게 증가시킬 수 있어 지연형 염증반응을 유발할 가능성을 지닌다. 그러므로 이에 대한 명확한 기전연구 가 요구된다.

결 론 (Conclusion)

본 연구는 endotoxin tolerance 상태에서 생리적 저농도 수준 의 GCs preconditioning이 이차적 LPS 자극으로 유도되는 innate immune cell의 염증반응 및 T cell 면역반응 등에 어떠 한 변화를 유발하는지를 알아보기 위하여 실시하였다.

결론적으로 endotoxin tolerance 상태에서 저농도의 corticosterone preconditioning은 이차 감염에 따른 마크로파지에 의한 TNF-α, IL- 10 및 PGE₂등 염증성 매개인자들의 생산을 유도하지 못했지만 IL- 6 및 NO 생산을 약간 증가시켰는데 이는 면역무반응성을 보이는 endotoxin tolerance 하에서 저농도의 corticosterone preconditioning 이 낮은 수준의 염증(low grade inflammation) 유발 가능성을 지 님을 시사하고 있다. 또한 endotoxin tolerance 상태에서 저농도 의 corticosterone preconditioning은 T cell의 IFN-γ 및 IL-10 생산능 상실을 유발하여 T 세포의 면역능 상실에 따른 2차 감염 에 대한 저항력 저하를 유발할 가능성을 지니며, IFN-γ/IL-10 ratio 증가에 따른 Th1/Th2 균형에서 Th1 반응으로 향하게 함 은 염증성 세포의 면역 활성화를 촉진하여 지연형 염증반응을 유 발 할수 있음을 보여주고 있다.

임상적으로는 sepsis에서 나타나는 이차감염에 따른 조직손상 및 사망률 증가에 있어서 저농도 GCs preconditioning이 하나의 risk factor로서 작용할 수 있음을 시사하고 있다. 뿐만 아니라 부 신 기능이 정상인 sepsis 환자에 비하여 부신 기능이 저하된 septic shock 및 sepsis 환자의 경우 불충분한 부신기능에 따른 GCs 생산 저하가 2차 괌염에 의한 높은 사망률과 유관할 수 있 음을 보여주고 있다. 따라서 우울증과 같은 반복된 만성스트레 스나 염증성 질환에서 HPA 축의 만성 활성화 및 GCs 저항성 등에 따른 저수준의 GCs preconditioning은 감염에 의한 낮은 수준의 염증유발 촉진 가능성을 지닐 것으로 사료된다.

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Fig. 6 − Pretreatment of low dose corticosterone on the LPS-

induced production of cytokines in endotoxin-toleranted EL4 cells.

(1)A : control; (1)B : ET; (2) : IFN-γ/IL-10 ratio. EL4 cells

were pretreated with low dose corticosterone (Cort50: 50

ng/ml; Cort100: 100 ng/ml) and low dose LPS (50 ng/ml) in

fresh complete medium once a day for 3 days and then

cultured in fresh complete medium for 24 hr in the

presence of LPS (10 μg/ml). Concentration of cytokines

was measured using ELISA. Each value represents the

mean±S.E. Other legends and methods are the same as in

Fig. 1. * (p<0.05) and ** (p<0.01): Significantly different

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