약학회지 제 30 권 제 4 호 169 〜 173(1986) Yakhak Hoeji Vol. 30, No. 4
Piperine의 진통작용 기전에 관한 연구
殷 載 淳
全州 又石ᄎ學 藥學科 (Received June 29，1986)
A Study on the Mechanism of Analgesic Action of Piperine
Jae Soon Eun
Department o f pharmacy, Jeonju Woo Suk University, Jeonju 520，Korea
Abstract—It was carried out to detect the analgesic action of piperine by hot-plate method and to elucidate its mechanism in rats. Piperine (30mg/kg i.p.) produced profound analgesia, which was blocked by naloxone (lOmg/kg). Chronic intraperitoneal administration of piperine significantly increased the contents of 卢-endorphin in rat midbrain. In the chronic piperine-treated groups, significant decreases of maximum opiate binding were observed. However, Kd value in these groups were not changed.
Piperine이 중추신경 억 제 작용이 있 다 는 사 실 1， 2) 이 밝혀진 후 부 터 ， piperine유도체의 합성 및 약리작용에 관 한 연구가 보고되 었 으 며 3 에 ， 최 근 L iu 등8)은 piperine이 뇌 내 serotonin합성 을 촉진 함으로서 항경 련작용이 나 타 난 다 고 보 고 하 였 다 .
한편 Lee 등 9} 은 tail-clip pressure와 writhing syndrome을 지 표 로 piperine의 진통작용에 대한 실 험 을 한 결 과 ， acetaminophen의 진통작용에 비하여 70배 ， aminopyrine의 진통작용에 비하여 1.5배 정 도 강력한 진통작용이 있 음 을 보 고 하 였다 .
Hughes 등 10J 및 Belluzi 둥 11} 은 뇌에 는 진 통 작용을 나타내 는 opioid peptides가 존재 하 며 ， 그 함량 분포에 따 라 자 극 을 가하면 진 통 작 용 을 일 으 키 고 ，opiate antagonist는 이 전기자극에 의 한 진 통 효 과 를 차 단 하 며 ， 장기간의 동통이 나 자극 으 로 뇌척수액내 opioid peptides 농 도 가 변동된 다고 하 였 다 .
따라서 본 저 자는 piperine의 진통작용에 대 한 기 전을 규명 하여 보 고 자 ，hot-plate latency (H PL) 을 지 표 로 piperine의 진통작용에 대 한 실 험 을 하 였 으 며 ， 이 진통작용이 naloxone에 의해 차단
된 다 는 사실에 따라 ， 통각기전에 직접적인 관계
를 가 지 고 있 는 뇌내 ^-endorphin 함 량 과 opiate 수용체의 상 관 관 계 를 살 펴 본 결 과 ， piperine 이 뇌 내 卢 -endorphin 의 함 량 을 증 가 시 켜 진 통 작 용 을 나 타 내 고 있 다 는 지 견 을 얻 었 기 에 이에 보 고 하 고 자 한 다 .
실 험 방 법
시약 및 기 기 一 본 실험에서 사 용 한 시 약 은 piperine (Sigma Co.), 걱-endorphin〔 1-125〕(New England Nuclear C o . ) , 〔 3H〕-morphine sulfate (New England Nuclear Co.), morphine hydroc
hloride (Sam Sung pharm. Co.) 및 Naloxone hydrochloride (Sigma Co.) 이 었 으 며 ， 사 용 기 기 는 specific 〔 3H〕-morphine binding 측정 시 에 는 liquid scintillation counter (Packard) 를 사 용 하 였 고 ， y3- endorphin (1-125) 측정 시 에 는 gamma-counter (Packard) 를 사용하여 radioactivity 를 측 정 하 였 다 -
실 험 동 물 一 체 중 200g 내외의 흰쥐 (Sprague-
Dawley) 를 자 웅 구별없이 6 마 리 를 1 군 으 로 하
여 사 용 하 였 으 며 ，대 조 군 에 는 생 리 식 염 수 0.2m l
룰 ， Vehicle군에 는 70% ethanol 0. 2m l룰 그리 고
실 험 군에 는 70% ethanol 0. 2ml 에 piperine (30mg/
kg) 을 용해 시 켜 복강내 투여 하 였 고 ，장기 약리 효 과 를 검 정 한 경 우 에 는 1 일 1 회씩 3 일， 1 주 ，2 주 및 4 주 간 복 강 내 로 각각 투 여 하 고 최 종 투약 1 일 후 실험에 사 용 하 였 다 .
疼 痛 측 정 一 동 통 측 정 은 hot-plate 법 12 )을 이용 하 였 다 . 즉 온도 를 55± 10C로 유 지 시 킨 hot
plate 상부에 지 름 20cm， 높이 20cm의 투명 한 원 통 을 올려 놓 고 , 실 험 동 물 을 그 안에 넣은 후 ， hind paw licking을 보일때 까지의 반응시 간 (hot plate latency; H P L 이 라 함 )을 측정하여 동통에 대 한 반응성의 지 표 로 하 였 다 .
脳내 jS-endorphin 함량의 측정一뇌내 卢 -endor
phin 의 측 정 은 동 물 을 단두하여 중 뇌 를 채 취 한 다 음 ， 표 본 을 즉시 wet tissue g 당 glacial acetic acid 9ml 로 homogenate 룰 만 들 고 ，원 심 (10 ， OOOg, 30min.) 시킨 후 ， supernate 를 동량의 acetone 과 혼합하여 다시 동 일 방 법 으 로 원심 시 킨 다 음 ， supernate 를 분리하여 60oC 에서 air 로 증 발 건조 시켜 얻어진 표 본 을 卢 -endorphin(1-125) radioim
munoassay kit 를 사용하여 측 정 하 였 다 . 즉 0 .1M phosphate buffer 로 건조된 supernate 를 희석한 다 음 , Ice water bath 내 에 서 5ml 용량의 siliconized tube 에 assay buffer, 희석된 supernate, ^-endor
phin (1-125) 그리 고 卢 -endorphin 에 대한 rabbit antiserum 을 넣어 mixer 로 2 〜 5 초 섞 은 후 ， 4°C 에 서 24 시 간 incubation시 키 고 ， ice water bath 내 에서 charcoal suspension 을 stirring 시키면서 0.5 ml 씩 tube 에 넣고 잘 혼 합 하 여 ， 40C 에서 2,400 rpm 으로 10 분 간 원심시켜 얻은 supernate 의 radioactivity 를 Gamma-counter 로 측정하였다 . Radioactivity 의 정 량적 인 환산 은 동시 에 행 한 卢 -endorphin 의 표 준 곡 선 으 로 부터 산 출 하 였 으 며 ， 단 백 질 은 Lowry 등 13>의 방법 으 로 측 정 하 였 다 .
腦내 Specific [3H]-morphine binding 의 측 정ᅳ뇌 내 opiate receptor binding은 흰쥐 를 단두 하여 약 0.5g 의 중 뇌 를 채 취 하 여 ， 표 본 을 즉시 얼 음 으 로 냉각 시 킨 20 배 용량의 50mM tris-HCl buffer (pH 7.4) 로 homogenate를 만든 다음，이 homogenate 에 대 한 〔 3H 〕 -morphine 의 saturable binding 을 Goldstein 등 14}의 방법에 의해 측 정 하
였 다 . 즉 여 러 농도의 nonlabeled morphine 0.75 ml 를 각각 0. 05ml 의 [3H] -morphine (specific activity 60 Ci/nM) 을 혼합하여 37°C 수욕상에 서 5 분간 preincubation 한 다음 ， 0. 5ml 의 homo- genate 를 혼합하여 동일 조건에서 15 분 간 incu- bation 하 여 ，진공여과기 (Toyo MF-12 ) 를 이 용 ， nitrocellulose filter paper (pore size 0. 8jwm, Wha
tman Co . ) 로 여과 하 고 ， 빙냉 한 tris-HCl 으로 수 차레 세 척 하 였 다 . 다음 여 과지 를 lml 의 ethylene- glycol-monoethylether 에 완전 히 용해 시 키 고 coun- ting cocktail 9ml 를 가하여 liquid scintillation ccmnter 로 radioactivity 를 측 정 하 였 다 . specific binding 은 total binding 으 로 부터 non-labeled morphine 10 셔 M 존재하에 얻어진 non-specific binding 치를 제하여 산 출 하 였 다 . 결 합 된 〔 3H〕- morphine 의 양은 p mole/mg protein 으로 표시 하 였 으 며 ， B max와 표년치는 Akera 둥의 방 법 15}에 의해 산 출 하 였 다 . 얻어진 실 험 성 적 은 paired 또 는 unpaired-student’s t-test 로 유 의 성 을 검정하 였 다 .
실 험 결 과 및 고찰
疼痛에 대한 piperine 의 영향ᅳ동통반응이 발
현할 때까지의 시 간 (Hot-plate Latency; HPL) 은 saline 만을 투여 한 대 조 군 은 9. 6±1. 5 초 였 고 ， Vehicle 만을 투여 한 군 은 HPL 이 9. 0±1. 2 초였 으 며 ， 장기투여시에 HPL 은 변동되지 않했 으 나 ， piperine (30mg/kg) 투여 군에 서 는 piperine 투여 전 에 는 HPL 이 9.8±1.3 초 였 으 나 ， 약물투여 1 시 간 후에 는 23.7 土 3.7 초 ， 2 시 간 후에 는 33. 2 士 4.0 초로 최고에 도달 하였으며 (Table I 참 조 )，
piperine 3 일， 1 주 및 2 주 장기 투여 시 에 HPL 은 각각 16. 3 土 1.8 초 ， 14. 5±1. 7 초 그리 고 22. 7±
2. 6 초로 효 과 는 지 속적이 었 다 (Table H 참조 ).
piperine 의 진 통 작 용 과 opiate 계와의 관 계 를 보 고 자 ，naloxone (10mg/kg) 과 동시에 piperine 을 투 여한 결 과 ， HPL 은 9 .1±1.5 초 였 고 ， naloxone 처 리로 piperine 의 진통작용이 차 단 되 는 것으 로 보 아， piperine 의 진통작용이 뇌내 opiate 계 와 밀접 한 관 계 를 가 지고 있음 을 알 수 있 다 .
J. Pharm. Soc. Korea
피폐린의 진통작용 171 Table I —Effects of piperine (30mg/kg) on the
modification by naloxone (lOmg/kg).
response to pain of rats and its
Groups Before After treatment of piperine
Treatment lHr. 2Hrs. 4Hrs. 8Hrs.
Saline 9.6±1.5 8.8±1.1 9.7±1.2 9.0±1.0 9.8 土 1.8
Control (Vehicle) 9.0 士 1.2 9.8±1.3 10.2±2.5 9.5±1.0 8. 9 土 1.1 Piperine 9.8±1.3 23.7 士 3.7* 33. 2±4. 0* 26. 6±2. 2* 24.1 ±2.8*
Naloxone+Piperine 9.1±1.5 7.8 土 0.6** 7. 5土0.7** 6. 4±0. 8** 6.1± 0.6**
Each value represents the mean of hot plate latency (second) with SE from 6 experiments.
* ： Significantly different from the control group (p<0. 05).
**： Significantly different from the piperine-treated group (p<0. 05).
Table II ᅳEffects of piperine (30mg/kg) on the response to pain of rats.
Group
After treatment of piperine ueiuie ueaLmeiiL
3 days 7 days 14 days
Control (Vehicle) 9.4±1.1 9.1 士 1.2 9.5±1.3 9.3±1.4
Piperine 9.7±1.2 16.3±1.8* 14. 5土 1.7* 22.7±2.6
Each value represents the mean of hot plate latency (second) with SE from 6 experiments.
* ： Significantly different from the control group (p<0. 05) 月遂내 卢 -endorphin 함량에 미치는 piperine 의
영 향 ᅳ Vehicle 만을 투여 한 군에 서 는 과 -endorphin 함량 은 68.4±6ng/mg protein 이 었 고 ， piperine 30mg/kg 을 3 일， 1 주 ， 2 주 및 4 주간 투 여 하 였 을 때 ， 뇌 내 卢 -endorphin 함 량 은 각 각 87. 0±7. 7 ， 93. 8±10. 4 ， 95.1±9. 2 그리 고 90. 6±9. 8ng/mg
protein 으로서 대조군에 비하여 현저히 증가하였
다 (Table I 참 조 ).
Table I I I —Effects of piperine (30mg/kg) on the content of 卢-endorphin in rat midbrain.
Groups Content of /3-endorphin (ng/mg protein) Control (V ehicle) 68.4 士 6.5 Piperine
3 days 87.0土 7.7*
1 wk. 93.8±10.4*
2 wks. 95.1 士 9.2*
4 wks. 90.6土 9.8*
Specific [3H]-morphine bindin 효에 미 치 는 piperine 의 영향ᅳ뇌내 ^-endorphin 함 량 을 측정 한 동일 표본에 서 specific opiate receptor binding 을 시 행 한 결 과，정 상표본에 서 maximum opiate binding (Bmax) 는 0. 51±0. 08 p mole/mg protein 이 었 고 ， vehicle 장기 투여 로 opiate binding Bmax 는 변동하지 않 했 다 . 그러 나 piperine장기투여 표본에 서 는 opiate binding B max는 처 리 1 주 일 부 Table IV —Effects of piperine (30mg/kg) on specific
〔 3H〕-morphine binding in rat midbrain homogenates.
Each value represents the mean士SE from 6 experi
ments.
* ： Significantly different from the control group (p < 0 .05)
Groups Bmax(pmol/mg protein) Control (vehicle) 0. 51 ±0. 08 Piperine
3 days 0. 49 土 0. 05
1 wk. 0. 42 ±0. 03
2 wks. 0. 31 ±0. 04*
4 wks. 0. 36±0. 08*
Each value represents the mean 土 SE from 6 experi
ments.
* ； Significantly different from the control group
(p<0. 05).
터 감소하여 2 주 및 4 주 에 는 각 각 0. 31±0. 04 ， 그리 고 0. 36 土 0. 08 p mole/mg protein 으 로 대 조 군에 비해 현저히 감 소 하 였 다 (Table If 참조 ).
한편 모 든 실험군에서 Kd 치는 piperine 장기투여 로 변화하지 않했다 (Table V 참 조 ).
Piperine 에 의한 鎭痛作用과 腦내 卢 -endor
phin 含量 및 Specific C3H]-morphine binding 과의 상관관계 一 상 술 한 실 험 성 적 에 서 뇌내 卢 - endorphin 함 량과 진 통 작 용 및 maximum opiate binding 간의 상관관계 를 산출하여 보면 각 각 r = 0.809 와 r = ᅳ 0.755 로 유 의 한 상 관 관 계 가 있음 Table V■ —Effects of piperine (30mg/kg) on the appa
rent Kd values for specific〔 3H〕-morphine binding in rat midbrain homogenates.
Groups Kd(nM)
Control (vehicle) 0.79 士 0. 08 Piperine
3 days 0.85 ±0. 09
1 wk. 0.88 土 0.07
2 wks. 0.80 土 0.09
4 wks. 0.84±0.08
Each value represents:the mean 土 SE from 6 experi
ments.
r = 0 . 8 0 9
•
•
#
•
#
•
•
•
•
#
•
參 •
#
- 3 - 2 - 1 0 1 2 3 s e c .
H o t- pla te Latency
Fig. 1—Correlation between hot-plate latency and 卢-endorphin content in chronic piperine- treated rats.
* r = - 0 . 7 5 5
參
•
•
• • •
•
안 •
•
•
參
~
»--- 1--- >____
•0 1 2 3
S p e c i f - M o r p h i n e B in d in g
Fig. 2—Correlation between specific〔 3H〕-morphine binding and content of 卢-endorphin in chronic piperine-treated rats.
을 알 수 있 다 ((Fig. 1 ， Fig. 2 참 조 ).
본 실험에서 piperine 장 기 투 여 로 maximum opiate binding 은 현저히 감 소 하 고 Kd 치는 변동 하지 않했다는 사 실 은 ， opiate 수용체의 변동이 질적 인 변동이 아닌 수적변동임 을 의 미 하 며 ， 뇌 내 ^-endorphin 함 량 변 동 과 Bmax 변동이 유의한 상 관관계 를 가지 고 있음은 opiate 수용체 의 수 적 감 소가 piperine 에 의 한 뇌내 /3-endorphin 함량 증 가에 따른 receptor regulation 에 의 함을 시 사 하 고 있다 . 16~18) 한편 동 통 에 는 뇌내 opiate 계 외 에도 GABA-ergic 신 경 계 19~20)를 포함하여 그 와
다른 기전이 밀접히 관계되어 있기 때 문 에 ， 이
점은 앞으로 더 연구하여 야 할 과제 라 생 각 된 다 .
결 론
piperine(30mg/kg) 의 진 통 작 용 은 naloxone(10 mg/kg) 처 리로 차단되 며 ， piperine 의 장기 투여 는 뇌내 ^-endorphin 함량을 증 가 시 키 고 ， maximum opiate binding 은 감 소 시 키 며 ， 지 치 는 변화시키 지 못 했 다 . 이 러 한 결 과 는 뇌내 ^-endorphin 함 량이 증가됨으로서 opiate receptor 의 수 적 변 화 가 일어 나 진통작용이 나 타 나 는 것 이 라 사 료 된 다 .
J. Pharm. Soc. Korea
피폐린의 진통작용 173
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