신종 인플루엔자 A/H1N1 역전사중합효소연쇄반응에서 인플루엔자 A형 양성, 신종 인플루엔자 A/H1N1형 음성 결과의 해석
이영경․김한성․김현수․김재석․송원근․강희정․이규만
한림대학교 의과대학 진단검사의학교실
Interpretation of positive result for influenza A and negative result for Novel influenza A/H1N1 in reverse transcriptase PCR for novel influenza A/H1N1
Young Kyung Lee, Han-Sung Kim, Hyun Soo Kim, Jae-Seok Kim, Wonkeun Song, Hee Jung Kang, and Kyu Man Lee Department of Laboratory Medicine, Hallym University College of Medicine, Chuncheon, Korea
Background: Real-time reverse transcriptase PCR (rRT-PCR) is widely used to detect novel influenza A/H1N1. We had observed several cases with positive result for influenza A and negative result for novel influenza A/H1N1 during a novel influenza A/H1N1 outbreak. The causes of those results were investigated in this study.
Methods: A total of 913 cases tested with rRT-PCR for novel influenza A/H1N1 (Real-time Ready Influenza A/H1N1 Detection Set, Roche Diagnostics, Germany) during 25 August 2009 to 8 September 2009 was enrolled in this study. Cases showing positive result for influenza A (M gene) and negative result for novel influenza A/H1N1 (H1 gene) were tested with multiplex RT-PCR for seasonal influenza and novel influenza A/H1N1 (Seeplex FluA ACE Subtyping kit, Seegene, Korea), and the amplicons were directly sequenced.
Results: One hundred and eleven cases (12.2%) were positive for novel influenza A/H1N1.
Twenty-seven cases (3.0%) were positive for influenza A, but negative for novel influenza A/H1N1. Subtypes of influenza A were determined in 25 cases by multiplex RT-PCR and nucleotides sequencing. One novel influenza A/H1N1, six seasonal influenza A/H1N1, three seasonal influenza A/H3N2, and 15 influenza A/H9N2 were detected.
Conclusions: Subtypes of influenza A were determined in most cases with positive result for influenza A and negative result for novel influenza A/H1N1. Several cases with seasonal influenza A were detected. Even if a nonepidemic period of seasonal influenza, tests for seasonal influenza A can help in the differential diagnosis of influenza.
Key Words：Novel influenza A/H1N1, Seasonal influenza A, Real-time RT-PCR
교신저자：김한성
우) 431-070 경기도 안양시 평촌동 896 한림대학교성심병원 진단검사의학과 전화：031)380-3932, 팩스：031)380-3934 E-mail： [email protected]
서 론
최근 전세계적으로 유행하고 있는 신종 인플루엔자 A/H1N1형은 일반 역전사중합효소연쇄반응, 실시간 역전사 중합효소연쇄반응(real-time reverse transcriptase PCR,
rRT-PCR), 다중 역전사중합효소연쇄반응(multiplex RT- PCR) 등의 핵산 검사를 통하여 검사하고 있고, 이중 rRT-PCR이 많이 이용되고 있다[1-3].
신종 인플루엔자 rRT-PCR 키트는 인플루엔자 A형에 공통적인 유전자와 신종 인플루엔자에 특이적인 유전자를 검사하는 제품이 많고, 인플루엔자 A형에 양성, 신종 인플 루엔자에 음성을 보이는 경우 계절 인플루엔자 A형으로 추 정할 수 있다.
저자들이 소속된 기관에서는 계절 인플루엔자 비유행시 기에 인플루엔자 A형이 공통적으로 양성을 보이는 M 유전
곳의 종합병원에 내원하여 신종인플루엔자 rRT-PCR 검사 를 실시한 총 913 사례를 대상으로 하였다. rRT-PCR 검 사에서 M 양성과 H1 음성을 보인 사례들은 재검사를 실시 하였고, 재검사에서도 같은 결과를 보인 사례는 Multiplex RT-PCR을 실시하였고, Multiplex RT-PCR로 인플루엔 자 아형을 결정할 수 없는 사례는 PCR 반응산물의 염기서 열을 분석하였다.
2. 방법 1) rRT-PCR
멸균 면봉으로 비인두가검물을 채취한 후 바이러스 수송 배지에 넣어 검사실로 이송하였고, 핵산 추출 전까지 4℃에 보관하였다. 핵산 추출은 일부 검체는 High Pure Viral Nucleic Acid Kit (Roche Diagnostics, Penzberg, Germany) 를, 일부 검체는 QIAamp RNA Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA, USA)와 QIAcube (Qiagen) 기기를 이용하여 시행하였 다. rRT-PCR은 Real-time Ready Influenza A/H1N1 Detection Set (Roche Diagnostics) 시약과 LightCycler 2.0 (Roche Diagnostics)을 이용하여, 제조사의 지침에 따라 인 플루엔자 A형의 M 유전자와 신종 인플루엔자 A/H1N1형의 H1 유전자에 대한 검사를 시행하였다.
2) Multiplex RT-PCR
rRT-PCR 검사에서 M 양성과 H1 음성을 보인 사례들 에서 추출된 RNA는 Revertidaid First Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas, Ontario, Canada)를 이용하여 cDNA를 합성하였고, Seeplex FluA ACE Subtyping kit (Seegene, Seoul, Korea)를 이용하여 제조사의 지침에 따라 인플루엔자 A (M 유전자), 계절 인플루엔자 A/H1, 계절 인 플루엔자 A/H3, 신종인플루엔자 A/H1, 신종인플루엔자 A/H1, 조류 인플루엔자 A/H5에 대한 multiplex PCR을 시 행하였다. 증폭된 반응 산물은 Lab901 ScreenTape System (Lab901 Limited, Loanhead, UK)을 이용하여 전기영동 하 였고, 키트에 포함된 marker DNA와 비교하여 결과를 판독 하였다.
기서열은 GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank) 에 등록된 인플루엔자 A형의 해당 염기서열과 일치하는지 비 교하였다.
결 과
1. rRT-PCR
총 913사례 중 rRT-PCR 검사에서 M 양성, H1 양성이 111예였고(12.2%), M 양성, H1 음성인 사례가 27예였다 (3.0%). 774예는 M과 H1에 모두 음성을 보였다.
2. Multiplex RT-PCR
rRT-PCR 에서 M 양성, H1 음성인 27예 중 25예는 multipex RT-PCR에서도 M 양성, 신종인플루엔자 H1에 음성 결과를 보였고, 2예는 M과 신종 인플루엔자 H1에 모 두 음성을 보였다. multipex RT-PCR에서 M 양성, 신종 인플루엔자 H1에 음성을 보인 25예 중 4예는 계절 인플루 엔자 유전자에 양성을 보여(계절 인플루엔자 A/H1N1형 1 예, 계절 인플루엔자 A/H3N2형 3예) 계절 인플루엔자로 확인되었다.
3. 염기서열 분석
Multipex RT-PCR에서 M 양성이며 신종 인플루엔자와 계절 인플루엔자에 모두 음성이었던 21사례의 M 유전자의 PCR 반응산물 염기서열을 분석한 결과 계절 인플루엔자 A/H1N1형이 5예, 신종 인플루엔자 A/H1N1형이 1예, 인플 루엔자 A/H9N2형이 15예가 확인되었다. 분석한 염기서열은 인플루엔자 A형 M유전자의 238번째에서370번째 염기에 해 당하였고, GenBank에 등록된 계절 인플루엔자 A/H1N1형, 신종 인플루엔자 A/H1N1형, 인플루엔자 A/H9N2형의 염기 서열의 일치도는 각각 97-98%, 96%, 96-97%였다.
Fig. 1. The results of multiplex RT-PCR. Lane 1, size marker; Lane 2, negative; Lane 3, influenza A (M) positive; Lane 4, influenza A (M) and novel influenza A/H1 positive; Lane 5, negative; Lane 6, influenza A and seasonal influenza A/H3 positive.
Table 1. Summary of the results
rRT-PCR (n=913)
Influenza A positive Novel H1N1 positive
Influenza A positive Novel H1N1 negative
Influenza A negative Novel H1N1 negative
111 (12.2%) 27 (3.0%) 775 (84.9%)
Influenza A subtypes (n=27)
Influenza A Novel H1N1
Influenza A sH1N1
Influenza A sH3N2
Influenza A
H9N2 Undetermined
1 (3.7%) 6 (22.2%) 3 (11.1%) 15 (55.6%) 2 (7.4%)
Abbreviations: rRT-PCR, real-time reverse transcriptase PCR; sH1N1, seasonal H1N1; sH3N2, seasonal H3N2.
Table 2. Similarities between the sequences of the amplicons and the sequences from GenBank database.
Influenza A subtypes N of isolates Sequence identity (%) Compared sequences from GeneBank database
Influenza A Seasonal H1N1 5 97-98
CY040155 CY040139 CY033615
Influenza A Novel H1N1 1 96 GQ323457
FN434471
Influenza A H9N2 15 96-97
EU182283 CY014664 DO067438
형에 대해서 음성이면 신종 인플루엔자로 확진 할 수 있고, 계절 인플루엔자 비유행시기에는 인플루엔자 A형과 신종 인플루엔자 A/H1N1형에 양성이면 신종 인플루엔자로 확 진 할 수 있다. 저자들은 계절 인플루엔자 비유행시기에 다 수의 인플루엔자 A형 양성, 신종 인플루엔자 A/H1N1형 음성 사례를 경험하였다. 총 27사례를 조사한 결과 형 계절 인플루엔자 A형이 9예(33.3%), 신종 인플루엔자 A/H1N1형 에 1예(3.7%), 인플루엔자 A/H9N2형이 15예(55.6%)로 병원 성이 강한 계절 인플루엔자 A형이 상당수 포함되어 있었다.
인플루엔자 A형의 M 유전자는 1,027개의 염기서열 크기 로 기질단백(matrix protein)에 대한 M1 유전자와 막단백 (membrane protein)에 대한 M2 유전자로 나눌 수 있다[4].
인플루엔자 A형의 M 유전자는 사람, 돼지, 조류 등 숙주에 따라 계통발생학적으로 뚜렷한 차이를 보이므로[4], M 유전 자의 염기서열을 분석할 경우 계절 인플루엔자, 조류 인플 루엔자, 신종 인플루엔자를 감별할 수 있다.
인플루엔자 A/H9N2형은 국내외에 만연하여 있는 조류 인플루엔자의 한 아형으로 인체 감염도 유발할 수 있는 것 으로 알려져 있으나, 병원성은 강하지 않은 것으로 알려져 있다[5, 6]. 이 연구에서 다수의 인플루엔자 A/H9N2형이 검출되었으나, 실제 병원성 감염인지에 대해서는 추후 조사 가 더 필요할 것으로 생각한다.
신종 인플루엔자 A/H1N1형과 최근 수년간 국내외에서 유 행하였던 계절 인플루엔자 A/H3N2형은 대부분 oseltamivir (Tamiflu)에 감수성인 반면, 계절 인플루엔자 A/H1N1형은 대 부분 oseltamivir에 내성을 보이는 것으로 알려져 있다[7-9].
이번 연구에서 그 수가 많지 않았으나, 각기 다른 항바이러 스 제제 감수성을 보이는 계절 인플루엔자 A형의 두 가지 아형이 검출되었고, 계절 인플루엔자 유행시기에는 계절 인 플루엔자와 신종 인플루엔자 A/H1N1형이 함께 유행할 것 으로 예상되므로 향후 적절한 항바이러스 치료를 위해서는 계절 인플루엔자 A형의 아형에 대한 검사가 필요할 것으로 생각한다.
이번 연구에서 사용하였던 multiplex RT-PCR은 신종 인 플루엔자 A/H1N1형과 동시에 계절 인플루엔자 A/H3N2형 과 계절 인플루엔자 A/H1N1형을 함께 검사할 수 있는 장 점이 있었으나, rRT-PCR에서 인플루엔자 A형에 양성을 보
로 생각한다.
신종 인플루엔자 A/H1N1형의 확진은 M 유전자의 PCR 반응산물의 염기서열을 분석하는 방법이 “gold standard”이 고, 신종 인플루엔자 A/H1N1형 사례 중 일부는 M 유전자 에 양성을 보이나 H1 유전자에는 음성을 보이는 것으로 알 려졌다[10]. 이번 연구에서도 rRT-PCR과 multipex RT-PCR에서 모두 M 양성, 신종 인플루엔자 H1 음성을 보 인 1예가 M 유전자의 염기서열 분석 결과 신종 인플루엔자 A/H1N1형으로 확인되었다.
신종 인플루엔자 A/H1N1형의 신속하고 정확한 진단은 적절한 항바이러스 치료를 가능하게 한다. 계절 인플루엔자 비유행시기에 인플루엔자 A형에 공통적인 유전자와 신종 인플루엔자 A/H1N1형에 특이적인 유전자만을 검사한 경 우 결론을 내리기 힘든 경우가 다수 있었고, 추가적인 조사 를 통하여 대부분의 사례에서 인플루엔자 아형을 결정할 수 있었다. 계절 인플루엔자 비유행시기이더라도 계절 인플루 엔자 A형에 대한 검사를 함께 실시하는 것이 진단에 유용 할 것으로 생각한다.
요 약
배경: 신종 인플루엔자의 검사에는 실시간 역전사중합효 소연쇄반응(real-time reverse transcriptase PCR, rRT- PCR)을 많이 이용하고 있다. 이 연구에서는 신종 인플루엔 자 A/H1N1형 유행 시기에 rRT-PCR에서 인플루엔자 A형 에는 양성을 보이며 신종 인플루엔자 A/H1N1형에는 음성 을 보이는 사례를 다수 경험하여 그 원인을 조사하고자 하 였다.
방법: 2009년 8월 25일부터 9월 8일까지 신종인플루엔 자 rRT-PCR 검사(Real-time Ready Influenza A/ H1N1 Detection Set, Roche Diagnostics, Germany) 를 실시한 총 913 사례를 대상으로 하였다. rRT-PCR 검사에서 인플루엔 자 A형(M 유전자)에 양성, 신종 인플루엔자 A/H1N1형(H1 유전자)에는 음성을 보인 사례는 Seeplex FluA ACE Subtyping kit (Seegene, Korea)를 이용하여 계절 인플루엔 자와 신종 인플루엔자에 대한 다중 역전사중합효소연쇄반응 (multiplex RT-PCR)을 실시하였고, multiplex RT-PCR로
인플루엔자 아형을 결정하지 못한 사례는 PCR 반응 산물의 염기서열을 분석하였다.
결과: rRT-PCR 검사에서 913사례 중 111예(12.2%) 가 인플루엔자 A형과 신종 인플루엔자 A/H1N1형에 양성 이었고, 27예는(3.0%) 인플루엔자 A형에 양성, 신종 인플 루엔자 A/H1N1형에는 음성 결과를 보였다. 27 사례 중 25예에서 multiplex RT-PCR과 염기서열 분석으로 인플 루엔자의 아형을 확인하였고, 신종 인플루엔자 A/H1N1형 이 1예, 계절 인플루엔자 A/H1N1형이 6예, 계절 인플루엔 자 A/H3N2형이 3예, 인플루엔자 A/H9N2형이 15예였다.
결론: rRT-PCR 검사에서 인플루엔자 A형에 양성, 신 종 인플루엔자 A/H1N1형에는 음성을 보인 사례 대부분에 서 인플루엔자 아형을 확인할 수 있었고, 상당수는 계절 인 플루엔자 A형이었다. 계절 인플루엔자 비유행시기이더라도 계절 인플루엔자 A형에 대한 검사를 함께 실시하는 것이 인플루엔자 진단에 유용할 것으로 생각한다.
참 고 문 헌
1. Carr MJ, Gunson R, Maclean A, Coughlan S, Fitzgerald M, Scully M, et al. Development of a real-time RT-PCR for the detection of swine-lineage influenza A (H1N1) virus infections. J Clin Virol 2009;45:196-9.
2. Whiley DM, Bialasiewicz S, Bletchly C, Faux CE, Harrower B, Gould AR, et al. Detection of novel influenza A (H1N1) virus by real-time RT-PCR. J Clin Virol
2009;45:203-4.
3. World Health Organization, CDC protocol of realtime RTPCR for influenza A (H1N1). http://www.who.int/csr/
resources/publications/ swineflu/realtimeptpcr/
4. Furuse Y, Suzuki A, Kamigaki T, Oshitani H. Evolution of the M gene of the influenza A virus in different host species: large-scale sequence analysis. Virol J 2009;6:67.
5. Kim JA, Cho SH, Kim HS, Seo SH. H9N2 influenza viruses isolated from poultry in Korean live bird markets continuously evolve and cause the severe clinical signs in layers. Vet Microbiol 2006;118:169-76.
6. Peiris M, Yuen KY, Leung CW, Chan KH, Ip PL, Lai RW, et al. Human infection with influenza H9N2. Lancet 1999;354:916-7.
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8. 이주연. 인플루엔자 치료제 내성 현황: 2008-2009 절기 국내 oseltamivir에 대한 A/H1N1 내성주 유행. 감염과 화 학요법 2009;41;S20-4.
9. Moscona A. Global transmission of oseltamivir-resistant influenza. NEJM 2009;360:953-6.
10. Pabbaraju K, Wong S, Wong AA, Appleyard GD, Chui L, Pang XL, et al. Design and validation of real-time reverse transcription-PCR assays for detection of pandemic (H1N1) 2009 virus. J Clin Microbiol 2009;47:3454-60.
