대장상피세포에서 Interleukin-10 유전자 전달의 CXC 케모카인에 대한 억제 효과

대한소화기학회지 2003;41:447-455

서 론

궤양성 대장염이나 크론병 같은 염증성 장질환은 질병의

접수: 2002년 12월 9일, 승인: 2003년 3월 14일

연락처: 김병관, 156-707, 서울특별시 동작구 신대방2동 395 보라매병원 내과

Tel: (02) 840-2514, Fax: (02) 831-0714 E-mail: [email protected]

악화와⁶⁾관해가 반복되는 성향을 지니고 있으며 비교적 젊은 연령에서 많이 나타나고 소화기 이외의 증상을 유 발하기도 한다. 대개 치료는 경험적이며 염증을 경감시키

Correspondence to: Byeong Gwan Kim, M.D.

Department of Internal Medicine, Boramae Hospital 395, Shindaebang 2-dong, Dongjak-gu, Seoul 156-707, Korea Tel: 82-2-840-2514, Fax: 82-2-831-0714

E-mail: [email protected]

대장상피세포에서 Interleukin-10 유전자 전달의 CXC 케모카인에 대한 억제 효과

보라매병원, 서울대학교 의과대학 내과학교실, 서울대학교 화학과*

이국래·김찬규·김병관·장동경·이동호·김주성·정현채·이 연*·박종상*·송인성

Down-regulatory Effect of Interleukin-10 Gene Transfection for CXC Chemokines in Colonic Epithelial Cell

Kook Lae Lee, M.D., Chan Gyoo Kim, M.D., Byeong Gwan Kim, M.D., Dong Kyung Chang, M.D., Dong Ho Lee, M.D., Joo Sung Kim, M.D., Hyun Chae Jung, M.D, Yeon Lee*,

Jong Sang Park, Ph.D.*, and In Sung Song, M.D.

Boramae Hospital; Department of Internal Medicine, Seoul National University College of Medicine;

School of Chemistry*, Seoul National University, Seoul, Korea

Background/Aims: Cytokine plays an important role in initiation and continuation of inflammatory bowel disease.

However, cytokine protein has some limitation as a therapeutic tool because of low bioavailability, poor pharmacokinetics and chemical instability. Thus, we studied the effect of interleukin 10 (IL-10) gene transfection on murine colon cancer cell line by using non-viral gene carrier. Methods: Therapeutic gene and plasmid was pCAGGS mouse IL-10 and gene carriers were polyethyleneimine (PEI) and 3β[L-ornithinamide-carbamoyl]

cholesterol (O-chol). After IL-10 gene transfection, we measured the level of IL-10 in supernatant of cultured CT-26 cells. The chemokine cytokine-induced neutrophil chemoattractant (KC) and macrophage inflammatory protein (MIP)-2, which were treated with lipopolysaccharide (LPS) or tumor necrosis factor-alpha (TNF-α ), were measured after IL-10 gene transfection. Results: The IL-10 values were increased significantly by using PEI, but not by using O-chol. The KC and MIP-2 values were increased when LPS or TNF-α were treated. When PEI was used, KC and MIP-2 values increased by LPS or TNF-α were decreased. When O-chol was used, the KC values increased by TNF-α were decreased but those treated by LPS were not decreased, and the MIP-2 values were not decreased. Conclusions: After IL-10 gene transfection in colon cancer cell, IL-10 cytokine was efficiently expressed. The increased chemokine values by LPS or TNF-αwere suppressed by IL-10 gene transfection, but which was not constant because of carrier efficiency. (Korean J Gastroenterol 2003;41:447-455)

Key Words: Inflammatory bowel diseases; Transfection; Cytokines; Interleukin-10

대한소화기학회지: 제41권 제6호, 2003

거나 관해를 유지하는 목적으로 시행되어진다. 치료는 항 염증제제인 설파살라진이나 5-aminosalycilic acid (5-ASA) 가 사용되거나 코티코스테로이드 그리고 면역억제제인 아자티오프린이나 싸이클로스포린 등이 사용되고 있고¹ 최근 항염증성 싸이토카인인 interleukin-10 (IL-10)이나^2,3 항 tumor necrosis factor (TNF) 단클론항체 등의 사용에 대 한 연구가 발표되고 있다.⁴ 치료에 있어서의 문제점은 흔 히 사용되는 코티코스테로이드의 경우 이는 거의 모든 친염증성 싸이토카인을 억제하여 증상을 호전시키는 데 매우 효과적인 것으로 알려져 있으나 약을 줄이거나 끊 는 것이 종종 어렵거나 불가능하며 이러할 경우 흔히 조 기에 재발하기도 하고 크론병의 경우 일부는 스테로이드 의존성을 보인다고 알려져 있다. 그런데 스테로이드제제 는 잘 알려진 바와 같이 장기간 고용량을 사용하는 경우 많은 부작용으로 인해 사용에 제한이 있다. 또한 면역억 제제의 경우엔 골수 억제나 췌장염 등의 부작용으로 사 용에 제한이 있다.⁵ 염증성 장질환에서 싸이토카인이 중 요한 역할을 하는 것으로 알려져 있는데 이는 염증성 장 질환의 유발이나 지속에 있어 염증을 조절하는 역할을 한다. 친염증성 싸이토카인으로는 IL-1, IL-6, TNF-α , interferon-γ 등이 있으며 항염증성 싸이토카인으로는 IL-4, IL-5, IL-10, transforming growth factor-beta (TGF-β) 등이 있고 이것들이 질환의 만성화와 재발, 관해 등에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다.⁶ 염증의 증폭 및 유지 에는 각종 염증성 사이토카인도 중요하지만 이를 분비하 는 백혈구의 동원이 필수적인데 이에 필요한 것이 케모 카인이다. 케모카인(chemokine)은 저분자량(~7-12 kD)의 화학주성(chemotactic) 싸이토카인이다. 케모카인은 백혈 구의 화학주성과 활성화, 그리고 백혈구의 이동에 중요 한 adhesion molecule의 발현을 증가시켜 면역 및 염증반 응에 참여한다. 이 중 주로 호중구의 화학주성에 작용하 는 CXC 케모카인은 IL-8, epithelial neutrophil-activating peptide (ENA)-78, growth related (Gro)-α 등이 잘 알려 져 있는데⁷ 인체의 IL-8에 해당하는 케모카인이 생쥐의 macrophage inflammatory protein (MIP)-2와 cytokine induced neutrophil chemoattractant (KC)이다.⁸ 염증성 장질환에서 IL-10은 친염증성 싸이토카인인 IL-1β나 TNF-α 의 분비 나 유전자 전사를 억제 조절하는 기능이 있고⁹ 동물 모델에 서 장의 염증을 억제한다고 한다.^10,11 또한 최근의 연구에서 는 크론병 환자에서 사용했을 때 임상적 호전을 보이는 것 으로 보고되고 있다.^2,3 그러나 이러한 싸이토카인 등을 직 접 사용하는 경우 단백질 성분의 투여로 인해 생체 이용률 이 낮으며 낮은 약물 동력학성과 화학적 불안정성, 그리고 면역반응을 유발하는 등의 문제를 발생한다. 따라서 싸이 토카인 유전자 치료의 필요성이 제고되고 있으며 최근 염

증성 장질환에서의 그 이용에 관심이 몰리고 있다. 유전자 치료에서의 4가지 주요 요소는 치료 유전자, 유전자 운 반체, 유전자 발현, 치료 대상 질환인데 유전자 운반체 로는 바이러스와 비바이러스 운반체가 있으며 바이러 스를 이용하는 경우의 여러 가지 문제점을 피하기 위하 여 최근 비바이러스 운반체가 각광을 받고 있는데 후자 의 장점은 감염성이 없고 면역 유발 효과가 없으며 숙 주의 염색체에 삽입(통합)되지 않고 환자에 대한 유순 도가 좋은 점 등이다.¹²

본 연구에서는 IL-10 유전자 전달이 친염증성 싸이토카 인을 억제하는지를 밝히기 위해 우선 배양된 대장암 세포 주에서 비바이러스 운반체인 폴리머가 유전자 전달의 효율 성을 증가시키는지 확인하고, 배양된 대장암 세포주에서 폴리머와 IL-10 플라즈미드의 복합체가 IL-10 단백질의 발 현을 유발하는지와 또한 배양된 대장암 세포주에서 IL-10 유전자 전달 이후 lipopolysaccharide (LPS)와 친염증성 싸 이토카인으로 자극된 케모카인의 발현을 억제하는지를 알 아보고자 하였다.

대상 및 방법

1. 유전자 치료의 체계

Mouse IL-10 유전자를 치료 유전자로 이용하고 플라즈미 드 유전자 발현 체계로는 pCAGGS를 사용하며 유전자 운반 체로는 polyethyleneimine (PEI, 25 kDa; Aldrich, St. Louis, MO, USA)과 3β[L-ornithinamide-carbamoyl] cholesterol (O-chol)을 사용하기로 하였다. pCAGGS mIL-10 플라즈미 드는 미야자키 교수(Division of Stem Cell Regulation Research, Osaka University Graduate School of Medicine, 2-2 Yamadaoka, Suita, Osaka, Japan)로부터 공급받았다.

PEI와 O-chol은 양전하를 가지고 있어 음전하를 지니는 DNA와 전하에 의해 결합체를 형성하게 된다. 세포막이 음 전하를 지니므로 이 결합체를 형성할 때 폴리머와 DNA를 혼합하여 결합체가 양전하를 지니게 하여 투여하면 세포막 의 전하에 의해 부착하게 되며 이후 유전자의 세포내 이입 (endocytosis)이 이루어지게 된다.

2. 유전자 전달 효율성

생쥐의 대장암 세포주인 CT26 세포에 green fluorescence protein (GFP) 또는 luciferase가 부착된 플라즈미드를 PEI 또는 O-chol과 같이 넣어 IL-10 유전자의 시험관내 세포 감 염과 같은 방법으로 실험한 후 형광을 확인하고 luciferase 활성도를 측정하여 폴리머의 유전자 전달 효율성을 확인, 비교하였다.

448

이국래 외 9인. 대장상피세포에서 Interleukin-10 유전자 전달의 CXC 케모카인에 대한 억제 효과

3. IL-10 유전자의 시험관내 세포 감염

생쥐의 대장암 세포주 CT26 세포를 3군으로 나누어 첫 군은 IL-10 플라즈미드 DNA만을 넣었고 두 번째 군은 PEI 와 IL-10 플라즈미드 DNA 복합체, 세 번째 군은 O-chol와 IL-10 플라즈미드 DNA 복합체를 넣은 군으로 나누었고 각 군은 3회의 실험이 시행되었다. CT26 세포를 10⁵개 되 도록 24 well 배양기(Corning, NY, USA) 각각의 well에 넣 고 24시간 동안 배양하였다. 배양액은 DMEM (Gipco-BRL, Gaithersberg, MD, USA) media (10% FBS) 600 µL를 사용 하였다. 여기에 100 U/mL의 penicillin을 가한 후 37℃에서 24시간 동안 5% CO2 배양기에서 배양하였다. 배양 용액을 제거한 후 FBS 없는 DMEM을 첨가하였다. O-chol 6 µg (PEI는 2 µg)과 DNA 2 µg을 최종부피 120 µL의 FBS 없는 DMEM에서 30분간 처리하여 복합체를 형성한다. CT26 세 포를 PEI (또는 O-chol)/DNA 복합체로 4시간 동안 세포 감 염시킨 후 24시간 동안 배양하였다. 이 배양 용액을 -70℃

에서 IL-10을 측정할 때까지 보관하였다.

4. Lipopolysaccaride와 TNF-α자극 후 chemokine의 측정

친염증성 싸이토카인의 억제 효과를 보기 위해 대장암 세포주를 6군씩의 3개의 그룹으로 나누어 첫째 군은 아무것 도 넣지 않고 두 번째 군은 PEI만을 넣고, 세 번째 군에서는 O-chol만을, 네 번째 군은 IL-10 플라즈미드 DNA만을 넣고, 그리고 다섯 번째 군은 PEI와 IL-10 플라즈미드 DNA 복합 체, 여섯 번째 군은 O-chol과 IL-10 플라즈미드 DNA 복합체 를 넣은 군으로 나누었고 상기 방법으로 IL-10 유전자 세포 감염 24시간 후 각 군에 대해 lipopolysaccharide (10 µg/mL) 처리, TNF-α (30 ng/mL, Sigma, St. Louis, MO, USA) 처 리, 그리고 아무 것도 처리하지 않은 세 그룹으로 나누었고 각 군은 3회의 실험을 시행하였다. 이후 24시간 동안 배양 한 후에 배양 용액을 -70℃에서 MIP-2와 KC 단백질을 측 정할 때까지 보관하였다. 본 연구에서는 세포주 배양을 이 용하였으므로 대식세포나 활성화된 단핵구에서의 발현하는 interleukin이나 TNF-α , Interferon-γ 등은 측정하지 않았고 표피세포에서 발현하는 케모카인인 MIP-2와 KC를 측정하 였다.

5. IL-10, MIP-2, KC의 측정

IL-10의 양은 enzyme linked immunosorbent assay (ELISA; optEIA mouse IL-10 set, Pharmingen, SanDiego, CA, USA)를 사용하여 측정하였고 MIP-2, KC도 ELISA (R&D systems, Minneapolis, MN, USA)를 이용하여 측정 하였다.

6. 통계 분석

모든 결과치는 평균과 표준오차로 나타내었으며 SPSS PC 통계 프로그램을 이용하여 Student's t-test로써 유의성 을 검정하였고 유의수준은 p<0.05로 하였다.

결 과

1. 유전자 운반체의 유전자 전달 효율성

유전자 운반체의 유전자 전달 효율성은 PEI와 O-chol의 GFP의 전달을 형광사진으로 확인하였고(Fig. 1) luciferase 활성도는 PEI나 O-chol이 없을 경우 6.89E+03 RLU/mg protein, PEI를 유전자 운반체로 사용하였을 경우 2.69E+07 RLU/mg protein, 그리고 O-chol을 유전자 운반체로 사용하 였을 경우 1.08E+06 RLU/mg protein으로 PEI의 유전자 전 달 효율성이 O-chol에 비해 25배 정도 높았다(Fig. 2).

Fig. 1. The fluorescent finding using PEI as gene carrier.

Fig. 2. The luciferase activity after transfection using PEI or O-chol. The luciferase activity using PEI as gene carrier is about 25 fold higher than that using O-chol.

449

The Korean Journal of Gastroenterology: Vol. 41, No. 6, 2003

2. 유전자 운반체와 IL-10 복합체의 IL-10 발현 효율성 유전자 운반체 없이 IL-10 플라즈미드 DNA만을 투여한 군에서 배양액의 IL-10 농도는 52.6±26.9 pg/mL이었고 O-chol과 IL-10 플라즈미드 DNA 복합체를 넣은 군에서의 배양액의 IL-10 농도는 351.2±127.0 pg/mL, 그리고 PEI와 IL-10 플라즈미드 DNA 복합체를 넣은 군에서의 배양액의 IL-10 농도는 2874.0±243.1 pg/mL로 PEI는 IL-10 발현 효 율성이 의미 있게 증가하였다(p<0.0001). O-chol은 IL-10 발현 효율성이 증가하는 경향은 보였으나 의미 있게 증가 하지는 않았다(p=0.064)(Fig. 3).

Fig. 3. The IL-10 value after transfection using PEI or O-chol. The IL-10 value is increased by PEI significantly, but not by O-chol.

* p<0.0001.

3. IL-10 유전자 전달이 LPS, TNF-α로 자극한 세포 배양액에서의 MIP-2, KC 농도에 미치는 영향 1) KC

IL-10 플라즈미드 DNA나 유전자 운반체의 종류와 유무 에 상관없이 LPS와 TNF-α 처리시 모두 KC는 증가하는것 이 관찰되었다(Fig. 4). 유전자 운반체로 PEI를 사용하였

Table 1. Changes of KC Values (pg/mL)

mIL-10 (-) mIL-10 (+)

Control PEI O-chol Control PEI O-chol

No Tx 213±66 84±23 234±61 260±79 13.3±5.5 115±41 LPS 2051±123 1893±107 2009±166 1884±28 539±105 1767±17 TNF-α 1480±52 893±309 1441±68 1422±72 211±107 1021±220 mIL, mouse interleukin; No Tx, no treatment with LPS or TNF-α .

Control means transfection without gene carrier.

mIL-10 (-), without mIL-10 gene transfection; mIL-10 (+), without mIL-10 gene transfection; PEI, using PEI as a gene carrier; O-chol, using O-chol as a gene carrier.

을 경우 PEI만 투여하였을 때와 PEI와 IL-10 플라즈미드 DNA 복합체를 투여하였을 때를 비교하면 LPS나 TNF-α 로 처리하지 않았을 때에도 IL-10 유전자 전달한 경우 KC 가 감소하였을 뿐아니라 LPS나 TNF-α 로 인해 증가한 KC 도 의미 있게 감소하였다. O-chol을 사용한 경우에는 LPS 나 TNF-α 로 처리하지 않았을 때와 TNF-α 로 처리한 이후 증가한 KC는 IL-10 유전자 전달 후 의미 있게 감소하였으 나 LPS로 증가한 KC는 감소하지 않았다(Fig. 5)(Table 1).

Fig. 4. The KC values after the treatment with LPS or TNF-α . The KC values are increased when treated with LPS or TNF-α , compared to non-treated group, which is not affected by the presence of plasmid and PEI (O-chol).

* p<0.05 : No treatment vs. LPS or TNF-α treatment

2) MIP-2

MIP-2 또한 IL-10 플라즈미드 DNA나 유전자 운반체의 종류와 유무에 상관없이 LPS와 TNF-α 처리시 모두 증가 하였다(Fig. 6). 유전자 운반체로 PEI를 사용하였을 경우 LPS나 TNF-α 로 처리되어 증가한 MIP-2는 IL-10 유전자 전달 후 의미 있게 감소하였다. 그러나 O-chol을 사용한 경 우는 LPS나 TNF-α 로 처리 여부에 상관없이 IL-10 유전자 전달에 의해 감소하지 않았다(Fig. 7)(Table 2).

450

Lee, et al. Effect of Interleukin-10 transfection for Chemokines in Colonic Epithelial Cell

Fig. 5. The changes of KC values after IL-10 gene transfection using PEI or O-chol with treatment of LPS or TNF-α . Using PEI as gene carrier, all the KC values after treatment with LPS or TNF-α are decreased but using O-chol as gene carrier, the KC values after treatment with TNF-α are decreased significantly, but the values after treatment with LPS is not decreased by IL-10 gene transfection.

* p<0.05.

Fig. 6. The MIP-2 values with LPS or TNF-α treatment. The MIP-2 values that treated with LPS or TNF-α are increased when compared with non-treated group, which is not affected by the presence of plasmid and PEI (O-chol).

* p<0.05 : No treatment vs. LPS or TNF-α treatment.

Fig. 7. The changes of MIP-2 values after IL-10 gene transfection using PEI or O-chol with treatment of LPS or TNF-α . Using PEI as gene carrier, MIP-2 values after treatment with LPS or TNF-α are decreased significantly, but using O-chol, MIP-2 values are not changed by IL-10 gene transfection.

* p<0.05

Table 2. Changes of MIP-2 Values (pg/mL)

mIL-10 (-) mIL-10 (+)

Control PEI O-chol Control PEI O-chol

No Tx 1.3±0.57 0.66±0.57 0.66±0.57 2.3±0.57 0 0

LPS 46.6±10 14.6±2.5 35±3 40±4 3.3±0.57 28±6

TNF-α 20.6±6.5 5.6±0.57 17±4 23.6±3.5 3.3±0.57 19±2.5 mIL, mouse interleukin; No Tx, no treatment with LPS or TNF-α .

Control means transfection without gene carrier.

mIL-10 (-), without mIL-10 gene transfection; mIL-10 (+), without mIL-10 gene transfection; PEI, using PEI as a gene carrier; O-chol, using O-chol as a gene carrier.

451

대한소화기학회지: 제41권 제6호, 2003

고 찰

염증성 장질환인 궤양성 대장염과 크론병은 악화와 호전 을 반복하는 질환으로 항염증제제나 스테로이드 면역억제 제 등이 사용되고 있으나 약 20-30% 정도에서는 스테로이 드 의존성이거나 불응성인 경우가 있고 또한 스테로이드 약제에 대한 부작용이 문제가 되고 있으며 면역억제제 등 도 치료에 반응하지 않거나 부작용이 문제가 되고 있다.¹ 최근 염증성 장질환의 발병 기전에서 싸이토카인에 대한 관심이 높아지는 바, 치료에서도 실제로 적용되고 있으며 효율성과 문제점에 대해 많이 보고되고 있는데 그 예로 항 TNF-α 단클론 항체가 스테로이드 불응성 크론병에서 효 율성이 입증되었고⁴ 또한 thalidomide는 TNF-α m-RNA의 분해를 촉진하여 TNF-α 생성을 감소시키고 또한 IL-12의 생성도 감소시킴으로써 크론병에서의 증상 완화 및 스테로 이드 사용량을 감소시키는 것으로 보고되고 있다.^13,14 최근 항염증 싸이토카인인 IL-10에 대한 관심이 높아지고 있는 데 IL-10은 점막의 T-세포 활성화 및 metalloproteinase, extracellular matrix의 결손을 down-regulation하여 점막 손 상을 억제하고, 또한 T-세포 활성화 억제는 활성화된 대식 세포나 단핵구에서의 TNF-α , IL-1β, IL-6, IL-8의 합성을 억제한다.⁹ 그리하여 실제로 IL-10 유전자가 비활성화된 IL-10 knockout 생쥐에서 내인성 균주에 의해 대장염이 발 생되며 이들에서 IL-10 관장을 하였을 때 호전된다는 보고

와^15,16 생쥐에서 IL-10 피하주사로 대장염이 효과를 보았다

고 하며^10,11 사람의 크론병에서도 효율성이 입증되고 있

다.^2,3

그러나 이러한 싸이토카인 관련 치료는 치료 빈도 수가 많아야 하며 자체에 의한 항체 생성이나 암 유발 가능성, 그리고 전신 부작용이 문제가 되거나 고가인 점 등으로 인 해 사용의 제한이 되고 있으며¹⁷ 이에 싸이토카인 유전자 치료에 대한 관심이 높아지고 있다.

과거 유전자 전달의 운반체로서 바이러스가 많이 이용되 었는데 대장염 모델에서 실제로 바이러스를 이용한 유전자 전달의 효율성이나^18,19 쥐의 TNBS (trinitrobenzene sulfonic acid) 유발 대장염 모델에서 adenovirus를 이용한 IL-4 유 전자 전달 실험에서 조직 손상의 억제와 interferon-γ , myeloperoxidase 활성도 억제, NOS II 유전자 발현의 억제 등이 밝혀지기도 하였다.²⁰ 그러나 바이러스는 감염을 일으 키거나 면역원이 될 수 있고 숙주 염색체에 이입될 수 있는 등의 문제점이 있다.²¹

그리하여 바이러스를 이용하지 않는 싸이토카인의 전 달이 요구되어 세균을 이용한 실험으로써 유전자 조작된 lactococcus lactis를 위 내에 주입하여 dextran sulfate sodium 처리된 생쥐의 대장염을 50% 억제하고 IL-10(-/-)

생쥐의 대장염 발생을 억제하였다는 보고가 있었다.²² 비 바이러스 유전자 운반체로서 양이온의 리포좀을 이용하 여 항염증 싸이토카인인 Il-4와 IL-10 유전자를 심한 염증 성 장질환 환자의 대장에 주입한 실험이 보고되기도 하 였는데 이러한 시도는 전신 부작용을 방지하고 IL-4나 IL-10의 국소 농도를 지속적으로 유지하고자 하는 의도이 었다.⁶ 그러나 리포좀은 세포 전달의 효율이 높은 것으로 보고되고 있으나 대량 사용시의 세포 독성으로 그 사용 의 한계를 보이고 있다.²³ 본 연구에서 LPS나 TNF-α 로 자극한 후의 케모카인의 농도가 O-chol을 투여한 경우보 다 PEI를 투여한 경우 비교적 낮게 나타났는데 이는 유전 자 운반체의 세포 독성에 따른 차이에 기인한 것으로 생 각된다.²⁴

또 다른 유전자 운반체로서 양이온의 폴리머들이 일부 에서 시도되고 있으며 생체분해성의 양이온의 폴리머인 carnitine ester가 생쥐에서 정맥주사를 통하여 성공적으로 유전자를 전달할 수 있음이 보고된 바 있다.²⁵ 이러한 생체 분해성 폴리머나 리포좀은 전달하고자 하는 플라즈미드 DNA의 polyphosphate 음이온 하전에 의해 복합체를 형성 하며²⁶이 또한 복합 비율에 의해 양이온을 띄게 되는데 이 는 음전하를 띄는 세포막과 자연히 부착하게 되며 이후 endocytosis에 의해 세포 내로 이입하게 되고 이후 endosome 에 의해 이동되어 세포핵 근처에서 세포질 내로 빠져나오게 되고 핵이 DNA를 흡수하게 된다.²¹

본 연구에서는 유전자 운반체로서 양이온의 폴리머인 PEI와 양이온의 리포좀인 O-chol이 사용되었는데 배양 세 포의 IL-10 유전자 전달 이후 배양액의 IL-10 농도를 비교 해 보았을 때 PEI가 약 10배 정도 효율적임을 확인할 수 있 었다. 이는 유전자 운반체의 효율성을 luciferase 활성도의 비교로 확인한 결과로서 그 이유를 유추할 수 있다 하겠다.

또한 IL-10 유전자 전달 이후 24시간 이후의 IL-10의 농도 만을 측정하였으므로 향후 생체 내에서의 치료를 고려할 때 IL-10의 발현이 지속적으로 유지될지에 대한 의문이 있 는데 생쥐에서 폴리머와 IL-10 플라즈미드 복합체를 정맥 내 투여한 이후 혈청의 IL-10 농도를 5일에서 50일까지 관 찰한 연구에서 50일까지 상당한 정도로 유지되는 것으로 보고되었다.²⁷

염증질환의 유발에 있어 케모카인은 백혈구의 활성화에 매우 중요하며 언제 어느 곳에 조직 내로 들어가 할동할지를 결정하게 된다.²⁸ 케모카인에는 아미노산 시스테인(cystein) 의 수와 위치에 따라 4가지 종류의 케모카인인 CXC, CC, C, CX3C로 나뉘며 CXC 케모카인은 주로 호중구를 염증 부위에 끌어들이는 역할을 담당하고 CC나 C 케모카인은 주로 단핵구나 림프구 등의 만성 염증성 세포들에서 작용 한다.²⁹

452

이국래 외 9인. 대장상피세포에서 Interleukin-10 유전자 전달의 CXC 케모카인에 대한 억제 효과

인체의 장표피세포는 친염증성 싸이토카인이나 미생 물 병원체에 감염된 후 친염증성 유전자의 발현이 증가 되어³⁰ 화학주성의 케모카인을 생성하고 이것이 급성 점막염증 시작의 신호가 될 수 있는데 인체 장표피세포 는 세균이나 LPS의 자극이후 CXC 케모카인인 IL-8과 Gro-α ³¹ 등의 생성이 증가하지만 숙주의 적응 면역반 응에 역할을 하는 interferon-γ 나, IL-2, IL-4, IL-5 등은 생성하지 않는다.

IL-8은 호중구와 T-세포, 표피세포내 림프구에 화학주성 능이 있으며 염증성 장질환의 장세포에서 매우 높게 발현 되는 것으로 알려져 있다.²⁸인체의 IL-8에 해당하는 케모카 인인 생쥐의 MIP-2, KC 또한 마찬가지로 Cryptosporidium parvum 같은 세균이나 LPS, TNF-α 에 의해 증가한다고 보 고되고 있다.^32-34 본 연구에서 LPS나 TNF-α 에 의해 증가 된 친염증성 화학주성능의 케모카인인 MIP-2와 KC가 IL-10 유전자 전달 전처치에 의해 억제되는 것을 확인할 수 있었는데 인체 대장 세포주에서 IL-1β, TNF-α , LPS 등으 로 자극된 다른 연구에서는 증가된 IL-8이 직접 첨가한 IL-4나 IL-10, TGF-β에 의해 영향이 없었다는 결과와³⁵ 상 반된다.

이는 아마도 IL-10을 직접 넣어준 것과 IL-10 DNA 유전 를 전달한 것과의 세포 내에서의 효율성 차이 또는 세포주 의 차이에 의한 것일 수 있겠고 이는 추후 실험으로써 확인 해야 할 것이다. 또한 본 연구에서 케모카인인 MIP-2나 KC 가 PEI 폴리머를 이용하였을 때는 효과적으로 억제되나 O-chol을 사용하였을 때는 일치된 결과를 보지 못하였는데 이는 아마도 본 연구에서 IL-10 전달 효율성 차이에서 나타 나듯이 O-chol 폴리머의 유전자 전달 효율성 차이에 기인 한 것으로 생각된다.

대장 염증질환에서 이러한 유전자 전달의 방법으로 double balloon catheter를 이용한 표지 유전자(reporter gene) 의 대장세포 내의 유전자 전달과³⁶ 생쥐의 정맥내 주사 후 혈액과 조직에서의 싸이토카인 발현 연구는 향후 생체실험 방향을 제시해 주고 있다.²⁷

결론적으로 생쥐의 대장세포에서 유전자 운반체를 이용 한 IL-10 유전자 전달은 효율적으로 발현되며 이는 LPS나 TNF-α 등의 염증성 자극으로 증가된 케모카인을 PEI의 경우 효과적으로 억제하였으나 O-chol의 경우엔 부분적으 로 억제함이 확인되었는데 이는 유전자 운반체의 효율성의 차이로 판단된다.

요 약

목적: 염증성 장질환은 유발이나 지속에 있어 싸이토카인 이 중요한 역할을 하는 것이 알려지면서 싸이토카인을 이용

한 치료가 활발히 연구되고 있다. 그러나 싸이토카인 단백질 을 직접 사용하는 경우 생체 이용률이 낮으며 낮은 약물동력 학성과 화학적 불안정성이 문제되고 있으며 이에 싸이토카 인 유전자 전달을 이용한 치료가 최근 도입되고 있다. 이에 본 연구에서는 배양된 생쥐의 대장암 세포주에서 비바이러 스 유전자 운반체를 이용하여 IL-10 유전자를 전달하였을 때 IL-10이 발현하는지를 확인하고, 동시에 이렇게 전달된 IL-10 이 염증성 자극으로 유발된 케모카인을 억제하는지를 알아 보고자 하였다. 대상 및 방법: 치료 유전자와 플라즈미드는 pCAGGS mouse IL-10을 이용하고 유전자 운반체는 polyethyleneimine (PEI)과 3β[L-ornithinamide-carbamoyl]

cholesterol (O-chol)을 이용하였고, 생쥐의 대장암 세포주인 CT26 세포를 이용하여 IL-10의 유전자 전달 이후 배양액에 서의 IL-10 농도를 측정하였다. 이후 CT-26 세포를 lipopoly- saccaride (LPS)나 TNF-α 로 자극한 경우, 케모카인인 KC 나 MIP-2의 변화를 측정하였다. IL-10 유전자 전달로 IL-10 이 발현된 CT-26 세포를 LPS나 TNF-α 로 처리하여 배양 액에서 KC와 MIP-2를 측정, 비교하였다. 결과: PEI를 운반 체로 이용한 경우 배양액의 IL-10 농도는 의미 있게 증가하 였으나 O-chol을 이용한 경우에는 의미 있게 증가하지 않 았다. CT-26 세포를 LPS나 TNF-α 로 처리하여 배양액에서 측정한 KC와 MIP-2는 모두 의미 있게 증가하였다. 이렇게 증가한 KC와 MIP-2는 PEI를 이용한 경우 의미 있게 감소 하였으나 O-chol을 사용한 경우엔 MIP-2는 감소하지 않았 고 KC는 LPS로 처리한 경우엔 감소하지 않았다. 결론: 생 쥐의 대장세포에서 유전자 운반체를 이용한 IL-10 유전자 전달은 효율적으로 발현되었으며 이는 염증성 자극으로 증 가된 케모카인을 효과적으로 억제하였으나 유전자 운반체 에 따른 차이가 확인되었는데 이는 유전자 운반체의 효율 성의 차이로 판단된다.

색인단어: 염증성 대장질환, 유전자 전달, 싸이토카인, interleukin-10

참 고 문 헌

1. D'Haens G, Rutgeerts P. Medical therapy for Crohn's disease.

Curr Opin Gastroenterol 1998;14:306-311.

2. van Deventer SJ, Elson CO, Fedorak RN. Multiple doses of intravenous interleukin 10 in steroid-refractory Crohn's disease. Gastroenterology 1997;113:383-389.

3. Fedorak RN, Gangl A, Elson CO, et al. Safety, tolerance, and activity of multiple doses of subcutaneous recombinant human interleukin 10(rHuIL-10) in patients with mild to moderate active Crohn's disease. Gut 1997;41(suppl 3):16A.

453

The Korean Journal of Gastroenterology: Vol. 41, No. 6, 2003

4. D'Haens G, van Deventer S, van Hogezand R, et al.

Endoscopic and histologic healing with infliximab anti-tumor necrosis factor antibodies in Crohn's disease: A European multicenter trial. Gastroenterology 1999;116:1029-1034.

5. Kirschner BS. Safety of azathioprine and 6-mercaptopurine in pediatric patients with inflammatory disease. Gastroenterology 1998;115:813-821.

6. Rogy MA, Beinhauer BG, Reinisch W, Huang L, Pokieser P.

Transfer of interleukin 4 and interleukin 10 in patients with severe inflammatory bowel disease of the rectum. Hum Gene Ther 2000;11:1731-1741.

7. Dwinell MB, Eckmann L, Leopard JD, Varki NM, Kagnoff MF. Chemokine receptor expression by human intestinal epithelial cells. Gastroenterology 1999;117:359-367.

8. Remick DG, Green LB, Newcomb DE, Garg SJ, Bolgos GL, Call DR. CXC chemokine redundancy ensures neutrophil recruitment during acute inflammation. Am J Pathol 2001;159:1149-1157.

9. Pender SL, Breese EJ, Günther U, et al. Suppression of T-cell-mediated injury in human gut by interleukin 10:

Role of matrix metalloproteinases. Gastroenterology 1999;

115:573-583.

10. Powrie F, Leach MW, Mauze S, Menon S, Caddle LB, Coffman RL. Inhibition of Th1 responses prevents inflammatory bowel disease in scid mice reconstituted with CD45RBhi CD4+ T cells. Immunity 1994;1:553-562.

11. Herfarth HH, Mohanty SP, Rath HC, Tonkonogy S, Sartor RB. Interleukin 10 suppresses experimental chronic, granulomatous inflammation induced by bacterial cell wall polymers. Gut 1996;39:836-845.

12. Jeschke MG, Herndon DN, Baer W, Barrow RE, Jauch KW.

Possibilities of non-viral gene transfer to improve cutaneous wound healing. Curr Gene Ther 2001;1:267-278.

13. Vasiliauskas EA, Kam LY, Abreu-martin MT, et al. An open-label pilot study of low-dose thalidomide in chronically active, steroid-dependent Crohn's disease. Gastroenterology 1999;117:1278-1287.

14. Ehrenpreis ED, Kane SV, Cohen LB, Cohen RD, Hanauer SB. Thalidomide therapy for patients with refractory Crohn's disease: an open-label study. Gastroenterology 1999;117:1271-1277.

15. Schreiber S, Heinig T, Thiele HG, Raedler A. Immun- oregulatory role of interleukin 10 in patients with inflammatory bowel disease. Gastroenterology 1995;108:1434-1444.

16. MacDonald TT, Monteleone G, Pender SL. Recent devel- opments in the immunology of inflammatory bowel disease.

Scand J Immunol 2000;51:2-9.

17. Baldassano RN. Anti-TNF therapies have eliminated the need for steroids in pediatric Crohn's disease: Pro.

Why use steroids if safer therapies are available? Infla Bowel Dis 2001;7:338-341.

18. Wirtz S, Galle PR, Neurath MF. Efficient gene delivery to the inflamed colon by local administration of recombinant adenoviruses with normal or modified fibre structure. Gut 1999;44:800-807.

19. Wu CH, Shen L, Wu GY. Gene therapy applications in gastroenterology and hepatology. Can J Gastroenterol 2000;14:57-61.

20. Hogaboam CM, Vallance BA, Kumar A, et al. Therapeutic effect of interleukin-4 gene transfer in experimental inflammatory bowel disease. J Clin Invest 1997;100:

2766-2776.

21. Pouton CW, Seymour LW. Key issues in non-viral gene delivery. Adv Drug Delivery Rev 1998;34:3-19.

22. Steidler L, Hans W, Schotte L, et al. Treatment of murine colitis by Lactococcus lactis secreting interleukin 10. Science 2000;289:1352-1355.

23. Wang J, Guo X, Xu Y, Barron L, Szoka FC. Jr. Synthesis and characterization of long chain alkyl acyl carnitine esters.

Potentially biodegradable cationic lipids for use in gene delivery. J Med Chem 1998;41:2207-2215.

24. Lee MJ, Cho SS, You JR, et al. Intraperitoneal gene delivery mediated by a novel cationic liposome in a peritoneal disseminated ovarian cancer model. Gene Ther 2002;9:

859-866.

25. Tang F, Hughes JA. Synthesis of a single-tailed cationic lipid and investigation of its transfection. J Controlled Release 1999;62:345-358.

26. Choi JS, Lee EJ, Jang HS, Park JS. New cationic liposomes for gene transfer into mammalian cells with high efficiency and low toxicity. Bioconjugate Chem 2001;12:108-113.

27. Koh JJ, Ko KS, Park JS, et al. IL-10 plasmid DNA delivery in NOD mice for the prevention of autoimmune pancreatic beta cell destruction. J Korean Soc of Endocrinol 2000;

15:262-271.

28. Shibahara T, Wilcox JN, Couse T, Madara JL. Charac- terization of epithelial chemoattractants for human intestinal intraepithelial lymphocytes. Gastroenterology 2001;120:60-70.

29. Baggiolini M, Dewald B, Moser B. Human chemokines: an update. Annu Rev Immunol 1997;15:675-705.

30. Dwinell MB, Lügering N, Eckmann L, Kagnoff MF. Regulated production of interferon-inducible T-cell chemoattractants by human intestinal epithelial cells. Gastroenterology 2001;

120:49-59.

454

Lee, et al. Effect of Interleukin-10 transfection for Chemokines in Colonic Epithelial Cell

31. Yang SK, Eckmann L, Panja A, Kagnoff MF. Differential and regulated expression of C-X-C, C-C, and C-chemokines by human colon epithelial cells. Gastroenterology 1997;

113:1214-1223.

32. Lacroix-Lamade S, Mancassola R, Naciri M, Laurent F.

Role of gamma interferon in chemokine expression in the ileum of mice and a murine intestinal epithelial cell line after Cryptosporidium parvum infection. Infect Immun 2002;70:2090-2099.

33. Kopydlowski KM, Salkowski CA, Cody MJ, et al. Regulation of macrophage chemokine expression by lipopolysaccharide in vitro and in vivo. J Immunol 1999;163:1537-1544.

34. Tessier PA, Naccache PH, Clark-Lewis I, Gladue RP, Neote KS, McColl SR. Chemokine networks in vivo: involvement of C-X-C and C-C chemokines in neutrophil extravasation in vivo in response to TNF-alpha. J Immunol 1997;159:

3595-3602.

35. Schuerer-Maly CC, Eckmann L, Kagnoff MF, Falco MT, Maly FE. Colonic epithelial cell lines as a source of interleukin-8; stimulation by inflammatory cytokines and bacterial lipopolysaccharide. Immunology 1994;81:85-91.

36. Schmid RM, Weidenbach H, Liptay S, Adler G. Direct gene transfer into the colon using a double-baloon catheter.

Endoscopy 1997;29:39-43.

455