대한소화기학회지 2005;46:316-317 □SELECTED SUMMARIES □
요약: 만성 B형 간염에서 장기간 lamivudine 또는 adefovir dipivoxil (adefovir)로 치료하면 HBV 중합효소 유전자에 변 이가 발생하여 약제내성이 발생할 수 있다. Lamivudine 내 성 변이는 HBV 역전사효소 C domain의 YMDD motif에 위 치하고(M204I/V), B domain의 V173L, L180M 변이와 연관 있다. B domain 변이는 YMDD 변이종의 복제능력을 부분적 으로 회복시킨다. Lamivudine 내성은 치료기간에 따라 매년 20% 정도 증가하며, 4년 치료 후 약 70%에서 발생하는데, 내성이 발생한 경우 adefovir 단독 또는 lamivudine과의 병합 치료를 고려할 수 있다. 최근 한 연구에서 2년간 adefovir 단 독치료 후 HBV 역전사효소 D domain에 N236T 변이가 발생 하였고, adefovir는 lamivudine과 교차내성이 없기 때문에 lamivudine과 병합치료를 하는 경우 내성 발생 시점을 지연 시킬 수 있을 것으로 기대되나, 병합치료 중 두 가지 약제에 모두 내성이 발생할 수 있다. 이 연구는 두 가지 약제 모두 에 내성을 보이는 변이종(L180M+M204V+N236T, triple- mutant)의 발현 양상, 복제능력 및 여러 항바이러스제[(lamivu- dine, emtricitabine (FTC), clevudine (L-FMAU), elvucitabine (β -L-FD4C), entecavir (ETV), adefovir, tenofovir (PMPA)]에 대 한 반응을 조사하였다.
실험방법으로 세 가지 pTriEXModHBV plasmid, 즉 L180M+
M204V, N236T, L180M+M204V+N236T 변이를 포함한 plasmid를 이용하였다. 이러한 변이종과 야생형을 포함한 plasmid를 Huh7과 HepG2 세포주에 이입시켜 1주일간 배양 후 세포 내 encapsidated HBV DNA를 정제하여 Southern blot analysis를 시행하였고, phosphor-imager analysis로 바이러스 DNA 합성 정도를 평가하였다. Triple-mutant의 항바이러스 제 감수성을 평가하기 위하여 이입세포에 emtricitabine 15 μmol/ L, clevudine 100μmol/L, elvucitabine 1.25μmol/L, tenofovir 100μmol/L, entecavir 5μmol/L, interferon-α 103 IU/mL를 투여하였고, lamivudine, adefovir, lamivudine+ade- fovir, entecavir, tenofovir의 IC50 (inhibitory concentration)를 확 인하였다. Hydroxyurea 감수성을 분석하기 위해 HEK293 세 포를 이용하였다. 야생형과 비교하였을 때 triple-mutant의 바이러스 복제능은 Huh7 세포에서 27.8±2.1%, HepG2 세포
에서 6.8±1.8%로 감소되었다. Hydroxyurea 투여 후 야생형 과 N236T 변이종은 복제능이 30% 이내로 억제된 반면, L180M+ M204V 변이종과 triple mutant는 70% 이상 억제되 어 YMDD 변이를 포함한 경우 세포 내 deoxynucleotide triphosphates (dNTPs) 농도에 민감함을 알 수 있다. Triple- mutant는 L180M+M204V 변이종과 비슷한 정도로 lami- vudine에 내성을 보였고[fold resistance (mutant IC50/wild type IC50) ＞40], adefovir 약제 감수성은 야생형에 비해 6.3배 낮았 다(IC50=100±20μmol/L). 또한, triple-mutant는 lamivudine/
adefovir 병합치료에도 내성을 보였고(IC50=100±20μmol/L), adefovir는 triple-mutant에 대해 병합치료와 유사하고 lami- vudine보다는 높은 감수성을 나타냈다(adefovir IC50 100±20 μmol/L, lamivudine IC50 ＞100). Triple-mutant는 pyrimidine 유 사체인 lamivudine, emtricitabine, elvucitabine, clevudine에 내 성을 보였고, 야생형과 비교했을 때 entecavir에 대해 6배(IC50
5±0.7μmol/L), tenofovir에 대해 4.4배(IC50 45.5±6.1μmol/L) 내성을 보였다. Interferon-α2b의 효과는 야생형과 triple- mutant에서 큰 차이를 보이지 않았다.
해설: 항바이러스제 투여 중 내성 발생은 임상적으로 매 우 중요하며 이러한 내성 발생을 지연시키기 위해서 서로 다른 내성 양상을 보이는 약제와 병합치료를 고려해 볼 수 있다. 이 연구에서는 lamivudine과 adefovir에 모두 내성을 보 이는 변이종에 대한 lamivudine/adefovir 병합치료의 효과를 조사하였다. 야생형, L180M+M204V, N236T 변이종과 비교 하여 triple-mutant는 in vitro에서 더 낮은 복제능을 보였고, 이러한 복제능 차이는 Huh7 세포에 비해 HepG2 세포에서 더 두드러졌는데, YMDD 변이종이 야생형에 비해 복제능력 이 더 낮고, 더 높은 농도의 dNTP를 필요로 한다는 이전 연 구와 일치한다.1-3 L180M+M204V 변이에 N236T 변이가 추 가되면 L180M+M204V 변이의 중합효소 장애가 발생하고, dNTPs 결합부위에 변화가 생겨 YMDD motif 내의 HBV 역 전사효소 변이 부위에 dNTP가 결합하는 것을 방해함으로써 triple-mutant의 복제능이 L180M+M204V 변이에 비하여 3배 정도 낮아진다.4 그리고 HBV 역전사효소 실험모델에 의하
Lamivudine/Adefovir 내성 B형 간염 바이러스 변이종의 항바이러스제 감수성
(Susceptibility to Antivirals of a Human HBV Strain with Mutations Conferring Resistance to Both Lamivudine and Adefovir.
Hepatology 2005;41:1391-1398)
장윤정 외 1인. Lamivudine/Adefovir 내성 B형 간염 바이러스 변이종의 항바이러스제 감수성 317
면 N236 아미노산이 역전사효소의 활성부위에 인접해 있어, N236T 변이가 발생하면 dNTPs 결합부위에 변화를 초래하 여 adefovir에 내성을 나타낸다.4 이번 연구에서 triple mutant 는 N236T 변이에 비해 adefovir에 대한 내성이 2배 높았는 데, 분자구조에서 L180M+M204V 변이에 따른 공간구조 장 애가 발생하여, N236T 변이로 인하여 이미 변화되어 있는 dNTPs 결합부위에 adefovir가 결합하는 것을 억제함으로써 adefovir에 대한 내성이 증가한다.4,5 따라서 장기간 lamivudine/adefovir 병합치료 중 triple-mutant로 인한 약제 내 성이 증가할 것이다.
Triple-mutant의 L-pyrimidine 유사체에 대한 내성은 L180M+
M204V 변이가 원인이며, triple-mutant의 tenofovir에 대한 약 제 감수성이 야생형에 비해 4.5배 낮았는데, tenofovir와 adefovir가 공통 구조를 공유하므로 N236T 변이가 tenofovir 내성의 원인일 것이다. Tenofovir는 in vitro에서 adefovir나 entecavir에 비해 더 높은 약제 감수성을 보였고, 임상에서 바이러스를 충분히 억제시킬 수 있는 용량을 투여해도 신독 성이 없고, HIV/HBV 중복감염에서 lamivudine 내성이 발생 한 경우에도 효과가 있다는 장점이 있다. 또한, interferon-α 약제 감수성은 야생형과 유사했는데, 이는 interferon-α의 항 바이러스 작용 기전 중 중합효소와 무관한 기전, 즉 core protein과 복제 중간산물을 감소시키고 HBV RNA의 전사 후 분해를 유발하는 기전과 연관이 있을 것이다.6
요약하면, adefovir와 lamivudine 내성이 공존하는 경우 간 암세포주에서 복제 능력이 감소했는데, 이는 lamivudine/
adefovir 병합치료 중 triple-mutant가 lamivudine 또는 adefovir 내성변이보다 더 늦게 발생할 가능성을 시사한다. In vitro에 서 triple-mutant는 lamivudine와 adefovir 모두에 내성을 나타 낸 반면 interferon-α, entecavir, tenofovir에 감수성을 나타내 어 향후 다약제내성을 보이는 HBV에 대한 구조요법으로써
이러한 약제들의 유용성에 대한 연구가 필요하리라 생각한 다. 또한, 이번 연구 결과를 이용하여 임상에서 de novo 병합 치료에 대한 평가를 할 수 있을 것으로 기대한다.
(정리: 한림대학교 의과대학 내과학교실 장윤정, 이명석)
참고문헌
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2. Gaillard RK, Barnard J, Lopez V, et al. Kinetic analysis of wild-type and YMDD mutant hepatitis B virus polymerases and effects of deoxyribonucleotide concentrations on poly- merase activity. Antimicrob Agents Chemother 2002;46:1005- 1013.
3. Ono-Nita SK, Kato N, Shiratori Y, et al. YMDD motif in hepatitis B virus DNA polymerase influences on replication and lamivudine resistance: a study by in vitro full-length viral DNA transfection. Hepatology 1999;29:939-945.
4. Bartholomeusz A, Tehan BG, Chalmers DK. Comparisons of the HBV and HIV polymerase, and antiviral resistance muta- tions. Antivir Ther 2004;9:149-160.
5. Das K, Xiong X, Yang H, et al. Molecular modeling and bio- chemical characterization reveal the mechanism of hepatitis B virus polymerase resistance to lamivudine (lamivudine) and emtricitabine (3TC). J Virol 2001;75:4771-4779.
6. Rang A, Gunther S, Will H. Effect of interferon alpha on hepatitis B virus replication and gene expression in transiently transfected human hepatoma cells. J Hepatol 1999;31:791-799.
