전호(Anthriscus sylvestris) 뿌리 정유의 항균 및 항산화 작용
임혜림·신승원# 덕성여자대학교 약학대학
(Received September 25; Revised October 4, 2012; Accepted October 8, 2012)
Antibacterial and Antioxidant Activities of the Essential Oil from the Roots of Anthriscus sylvestris
Hyerim Lim and Seungwon Shin#
College of Pharmacy, Duksung Women’s University, Seoul 132-714, Korea
Abstract — To develop a new effective and safe natural antibiotics and antioxidant the essential oil was extracted from the roots of Anthriscus sylvestris by steam distillation. Its composition was analyzed by GC-MS. The activities of the essential oil fraction and its main components were evaluated against antibiotic-susceptible and -resistant strains of some food-born bacteria. In addition the synergism was examined with this oil combined with antibiotic by checkerboard titer test. The anti- oxidant activities were determined by in 1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazil (DPPH) free radical scavenging activity test and reducing power assay. The essential oil fraction of A. sylvestris revealed significant inhibiting activities against antibiotic-sus- ceptible and -resistant species of Vibrio and Shigella with MICs ranged from 1.00~4.00 mg/ml. It showed synergistic or addi- tive effects when it was combined with amphicillin or trimethoprim/sulfamethoxazole (1 : 9). Additionally, the essential oil fraction of A. sylvestris exhibited significant DPPH free radical scavenging activity and the reducing power.
Keywords □ essential oil, Anthriscus sylvestris, myristicin, antibacterial, Shigella, Vibrio, anti-oxidant
전호(Anthriscus silvestris Hoffman)는 미나리과에 속하는 다년 생 초본으로 이 식물의 뿌리를 토전호 또는 아삼 이라고 하며 감 기로 인한 기침, 천식, 두통 등에 쓰여 왔으며, 폐, 간, 비 및 방 광 경락에 들어가는 것으로 한방서에 기록되어 있다.1-3)전호 (Anthriscus silvestris Hoffman)의 성분으로는 β-phellandrene, Z- β-ocimene, α-pinene, desoxypodo-phyllatoxin, campesterol, β- sitosterol, anthricin, isoanthricin, luteolin-7-glucoside 등이 알 려져 있으며, 약리작용으로는 거담작용, 해열작용, 관상동맥혈류 량 증가작용, 항암작용, 항알러지작용 등이 보고되었다.4-8)
이 식물은 오랫동안 대한약전 외 한약(생약) 규격집에 전호 (Anthrisci Radix)의 기원식물로 기재되어 있었으나 현재의 규격 집(2011년도 발행)에는 전호(Peucedani Radix)의 기원이 백화전 호(白花前胡) Peucedanum praeruptorum Dunn 또는 바디나물 Angelica decursiva Franchet et Savatier의 뿌리로 변경되었다.9) 그러나 전호(Anthriscus silvestris Hoffman)는 우리나라에 풍부하
게 야생하는 식물자원으로 현재에도 그 뿌리는 여전히 건강식품 원료 등으로 사용되고 있으며, 유망재배 약용식물자원 중의 하 나로 꼽히고 있다.10)
Vibrio 속 균주는 주로 해수 또는 어패류와의 접촉에 의해 창 상감염, 패혈증의 장관의 감염을 일으키며 격렬한 증상을 나타 내며 간 질환을 앓고 있는 사람이나 저항력이 낮은 사람이 굴 등 어패류를 날로 생식하면 감염된다.11-14)대단히 심한 감염으로 발 병 후 24시간 이내에 50% 이상이 사망하는 것으로 알려져 있다.
Shigella는 법정전염병인 세균성 이질의 원인균으로서 사람과 원 숭이에 대하여 감염성 장염을 일으킨다. 음식물과 함께 경구적 으로 감염되어 대장의 점막에 침입하여 점액성 혈변을 동반한 이 질로 장관에 괴사, 궤양을 일으킨다.15-18)이들 균 감염에 대한 치료제로 사용되어 왔던 항생제에 대한 내성균의 급속한 증가로 새로운 항균제의 개발의 필요성이 부각되었는데, 식물 정유는 이 네 대처할 유망한 천연항균제 개발 자원이다.19)
한편 각종 활성 산소종의 생체 조직 내에서의 반응은 만성질 병이나 노화 등을 일으키는 것으로 밝혀졌고, 이에 따른 항산화 물질에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다.20)특히 최근에는 합 성항산화제 등이 개발되어 사용되고 있지만, 폐, 위장관 점막 같
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종설
은 조직과 간에 유해성 등이 보고된 바 있어 합성항산화제가 기 피되어지고 있어서, 약용식물이나 생약 등에 많이 함유된 강력 한 항산화력을 갖는 페놀계 화합물과 같은 생리활성 물질에 대 한 관심이 증대되고 있다.21)
본 연구에서는 한국에 야생하는 전호(Anthriscus silvestris) 뿌리의 정유로부터 식품유래 감염균, 특히 항생제내성균에 적용 가능한 천연 항균제 및 항산화제의 선도물질을 개발하는 것을 목표로 전호의 뿌리를 수증기증류법으로 추출하여 gas chromatography-mass spectrometry(GC-MS)로 그 조성을 분석 하고, 전호 정유 분획의 Shigella 및 Vibrio 속 균주에 대한 항균 작용 및 항산화 활성을 측정하여 그 결과를 보고한다.
실험재료 및 방법
정유추출 및 분석
강원도 진부 근처의 산야에서 야생하는 전호(A. sylvestris)를 2011년도 6~7월에 채취하여 뿌리 2.4 Kg을 SDE(Spontaneous Distillation and Extraction) 장치를 이용하여 수증기 증류하여 상법에 따라 정유(211.7 mg)를 추출하였다. 같은 방법으로 추출 을 여러 번 반복하여 얻은 정유를 합쳐서, 분석 및 활성 검정에 사용하였다. 재료 식물 표본(ANSY-1)은 덕성여자대학교 약학대 학 표본실에 보관하였다.
추출한 정유의 조성은 Hewlett-Packard 6890 GC와 Hewlett- Packard 5973 MSD 분석기기에 2% 용액(ether) 1 µl씩을 주입 하여 아래와 같은 조건에서 분석하였다. 측정된 각 peak의 mass spectrum은 computer에 저장된 mass data(PBM Search of Library file: Data: Wiley L.)와 비교하여 구조를 동정하였다.
Carrier gas: He(0.8 및 1.6 ml/min), column: HP-5MS (30 m×
0.25 mm×0.25µm) capillary column, oven temperature: 50oC (10 min), 3oC/min(50~125oC), 1oC/min(125~145oC), 3oC/min (145~250oC) split(10 : 1).
사용균주 및 배양
Shigella boydii KCCM 41650, S. flexneri KCCM 11937, S. sonnei KCCM 41282, Vibrio harveyi CCARM 0111, V.
parahaemolyticus CCARM 7001 및 V. vulnificus KCCM 41665 를 한국미생물보존센터(KCCM)와 항생제 내성 균주 은행 (CCARM)에서 분양 받아서, Müller-Hinton I 액체배지에(BD) 배 지에 현탁하고, McFarland 0.5 Standard와 같은 탁도로 조정된 균액을 제조하여 균의 농도가 약 1×104~105CFU/ml가 되게 만 들어서 항균효과 측정에 사용하였다.
정유 비교물질, 항생제 및 기타 시약
정유 분획(3 g)을 hexane : ethyl acetate=95 : 5를 용매로 사용
하여 silicagel column chromatography를 하여 해당 fraction으 로부터 myristicin(93.8%, 125 mg)을 얻었고, 같은 조건으로 2차 chromatography를 하여 myristicin(99.5%, 52 mg)을 얻어서, UV, IR, H-NMR 등의 기기분석 data로 구조를 확인하였다.
α-Terpinolene과 norfloxacin, oxacillin, trimethoprime 및 sulfamethoxazole 등의 항생제와 항산화 실험에서 사용한 양성 대조물질 butylated hydroxyl anisole(BHA) 등 기타 시약은 모 두 Sigma-Korea Chemical Co.에서 구입하여 사용하였다.
액체배지 희석법에 의한 MIC 측정
항균활성 실험과 항생제에 대한 내성과 감수성의 판정은 Clinical and Laboratory Standard Institute(CLSI, USA)22)에서 제시한 microbroth dilution test 규정22)에 따랐다. 수증기 증류에서 얻 은 전호 정유 분획과 주성분인 myristicin 및 terpinolene를 각각 에탄올과 소량의 Tween 80을 가하여 현탁 시킨 후 syringe filter 로 무균 여과하여, 최고농도 50 mg/ml에서 최저농도가 0.78 mg/
ml에 이르도록 단계적으로 희석하여 96 well plate의 각 well에 100µl씩 주입한 후 균액을 100 µl씩 첨가하였다. 이것을 shaking incubator(100 rpm)에 넣고 36oC에서 24시간 배양한 후, 육안으 로 관찰하여 균의 성장이 억제된 최저농도(MIC)를 판별하였다.
Norfloxacin, sulfamethoxazole 등의 비 수용성 항생제는 dimethyl- sulfoxide(DMSO)를 용매로, oxacillin과 amphicillin은 증류수를 용매로 하여, 2 mg/ml부터 8단계까지의 배수 희석액을 제조하였 다. 각각 한 농도의 sample을 각 well마다 5 µl씩을 주입하고, 균 액 100 µl, 배지 95 µl를 첨가하고, 정유와 같은 조건에서 배양하 였다. 사용한 용매와 Tween 80이 시료의 항균력에 영향을 미치 지 않았음을 대조실험을 통해 확인하였다. 대조실험에서는 시료 를 제외하고 균과 용매, Tween 80를 본 실험과 같은 조건에서 배양하여, 균만을 배양했을 때와 비교하여 균 생장에 첨가한 Tween 80이 영향을 주지 않음을 확인하였다.
정유와 항생제의 병용에 의한 상승효과 실험
96 well plate의 각 well의 가로 방향으로 최고농도 50 mg/ml 에서 최저농도가 0.78 mg/ml에 이르도록 2% Tween 80을 포함 한 배지로 단계적으로 희석한 전호 정유 분획, 또는 myristicin 50µl를 넣고 세로방향으로는 이와 유사한 방법으로 항생제를 각 각 DMSO(99%)에 녹인 배수 희석액을 제조하여, 각각 한 농도 의 sample을 각 well마다 5 µl씩 첨가하였다. 여기에 Mcfarland 0.5의 탁도로 조절한 실험 균주 각 strain의 현탁액 145 µl를 가하 고, 위와 같은 조건으로 배양한 후 균이 억제된 최소농도의 배합 비율을 관찰하였다. 가장 효율적으로 나타난 배합농도의 결과를 Table III의 각주에 기록된 공식에 대입하여 fractional inhibiting concentration(FIC) 및 fractional inhibiting concentration index (FICI)를 산출하여 FICI가 0.5보다 작거나 같을 때 synergistic
effect가 있는 것으로, 0.5와 4 사이면 또는 additive로, 4보다 클 때 antagonistic effect로 판정하였다.23,24)
1,1-Diphenyl-2-picryl-hydrazil(DPPH) free radical 소거 활성
Blois25)의 방법에 따라 전호정유 및 myristicin을 ethanol을 용 매로 배수 희석하여 측정시 최종농도 기준으로 0.1~1.6 mg/ml 가 되도록 시료를 만들고, 각 농도 별 시료 20 µl에 0.1 mM DPPH 180µl를 넣고 vortex 한 후, 30분 동안 진탕한 후 540 nm에서 흡광도를 측정하여 비교액과 시료액의 흡광도의 차이를 백분율로 환산하여 DPPH radical 소거능을 표시하였다. 양성대 조군으로 BHA(0.1 mg/ml)를 사용하였다.
환원력 측정
Elmastas 등26)의 방법에 따라 DMSO 1000 µl에 전호정유 또 는 myristicin 4 mg을 녹여 시작농도로 하고 이후 DMSO를 용 배로 배수희석을 반복하여 0.12~4.0 mg/ml 사이의 6단계 농도로 시료를 만든다. 2 ml epi tube에 각 농도 별 시료 200 µl, 0.2 M 인산 완충액 500 µl, 1% potassium ferricyanide(K3Fe(CN)6)
500µl를 넣어준 후 50oC에서 20분 동안 반응시킨다. 여기에 10%
trichloroacetic acid 500µl를 첨가하고 1000 rpm에서 10분간 원 심분리하여 얻어진 상층액에 0.1% FeCl3 100µl을 넣어 발색을 유도시킨 후 750 nmn에서 흡광도를 측정하였다. 반응액의 흡광 도의 높은 정도가 환원력의 세기를 나타낸다. 양성대조군으로 BHA(0.12 mg/ml)를 사용하였다.
실험결과 및 고찰
전호(Anthemis sylvestris) 뿌리를 수증기 증류하여 얻은 정유 의 수득율은 약 0.09%(w/w) 였다. 추출한 정유를 GC-MS로 분 석한 결과 Table I에 정리된 바와 같이 총 29종의 성분이 확인 되었다. 전호정유에는 α,α,4-trimethylbenzene methanol의 함유 율이 50.65%로 제일 높은 것으로 나타났고, 다음으로는 myristicin(16.18%), α-terpinolene(8.84%), elemicin(8.05%)의 순으로 함량이 높게 나타났다. 이러한 정유 조성은 이전에 보고 된 전호 정유의 분석 결과4,7)와는 많은 차이를 나타내나 다르나, 이와 같은 차이는 생육환경이나 화학변종에 의한 것으로 추정된다.
본 연구에서 실험한 전호 정유의 최다 함유 성분으로 확인된
Table I− Composition of the essential oil from the roots of A. sylvestris analyzed by GC-MS
No. Compounds RI* Area (%) Identification
01. Limonene 1033 0.04 GC, MS
02. α-Terpinolene 1086 8.84 GC, MS
03. Methyl benzene 1116 0.02 MS
04. iso-Borneol 1166 0.34 MS
05. endo-Borneol 1169 0.26 MS
06. Menthol 1180 0.16 GC, MS
07. Cyclopropy methyl ketone 1191 0.83 MS
08. α,α-4-Trimethyl benzene methanol 1196 50.65 MS
09. Chrysanthenyl acetate 1269 0.28 MS
10. Endobornyl acetate 1291 0.24 MS
11. Germacrene-d 1406 0.10 MS
12. iso-Caryophyllene 1414 0.14 MS
13. α-Ylangene 1486 1.89 MS
14. Aromadendrene 1491 0.24 MS
15. Verbenone 1498 0.14 MS
16. α-Selinene 1501 0.58 MS
17. α-Curcumen 1504 0.24 MS
18. α-Longipinene 1506 0.14 MS
19. Cuparene 1513 0.18 MS
20. α-Zingiberene 1524 0.10 MS
21. β-Cedrene 1538 0.08 MS
22. Myristicin 1540 16.18 GC, MS
23. Elemicin 1575 8.05 GC, MS
24. Spathulenol 1580 4.59 MS
25. α-Copaene 1648 0.20 MS
26. β-Himachalene 1657 0.87 MS
27. β-Ionone 1695 0.14 MS
28. Apiol 1731 0.42 GC, MS
29. Eremophilene 1756 0.14 MS
In total 96.10
*GC retention indices (RI) calculated against C8 to C23 n-alkanes on a HP-5 MS column.
α,α,4-trimethyl benzene methanol(50.65%)은 column chro- matography로 분리되지 않았다. 전호 정유 3 g을 사용하여 2차 에 걸친 column chromatography의 결과 182 mg의 myristicin을 얻어 GC-MS로 순도(99.2%)를 확인하고, UV, IR, 1H-NMR, 13C-NMR을 측정하여 문헌상의 data19)와 비교하여 구조를 동정 하고, 전호 정유분획에서 세번째로 높은 함유율을 나타낸 terpinolene과 함께 본 연구의 항균력실험 및 항산화실험에 전호 정유 전체 분획에 대한 비교물질로 사용하였다.
Microbroth dilution test를 이용하여 전호 정유분획과 그 주성분인 myristicin 및 terpinolene의 식중독의 중요 원인균에 속하는 Shigella 및 Vibrio 각 3종 균주에 대한 억제활성을 기존 항생제인 amphicillin, norfloxacin, oxacillin, trimethoprim/
sulfamethoxazole(T/S)과 비교하여 실험하였다. 그 결과 Table II 에 나타난 바와 같이 전호의 정유전체 분획의 실험한 Shigella 및 Vibrio 각 3종 균주에 대한 최소억제농도(MIC)는 1.00~4.00 mg/
ml로 나타났고, 전반적으로 균의 종이나 항생제 내성에 따른 현 저한 항균력의 차이는 보이지 않았으나, 실험한 6조의 균 중에 서 V. vulnicus가 전호정유에 대해 가장 높은 감수성(MIC=1.00 mg/ml)을 나타냈다. 특히 전호정유는 항생제 감수성 균주 뿐 아 니라 amphicillin 및 oxacillin에 대해 내성을 보이는 Shiegella속
Table II− MICs (minimum inhibitory concentrations) of the essential oil fraction (EOF) and their main components of A. sylvestris against antibiotic-susceptible and -resistant species of Shiegella and Vibrio
Samples (mg/ml) Shiegella species Vibrio species
S. boyd. S. flex. S. sonn. V. harv. V. para. V. vuln.
A. sylvestris EOF 2.00 4.00 2.00 4.00 4.00 1.00
Myristicin >8.00 >8.00 >8.00 8.00 8.00 4.00
Terpinolene >8.00 >8.00 >8.00 >8.00 >8.00 >8.00
Amphicillin* 64.00 128.00 64.00 64.00 2.00 2.00
Norfloxacin* 0.03 0.03 0.03 0.50 <0.50 <0.50
Oxacillin* >4.00 >4.00 >4.00 4.00 >4.00 4.00
T/S* 0.12/2.37 0.25/4.75 0.12/2.37 0.25/4.75 0.25/4.75 0.06/1.18
*µg/ml, T/S: trimethoprime/sulfamethoxazole (1 : 19).
S. boyd.: Shigella boydii KCCM 41650, S. flex: S. flexneri KCCM 11937, S. sonn.: S. sonnei KCCM 41282, V. harv.: Vibrio harveyi CCARM 0111, V. para.: V. parahaemolyticus CCARM 7001, V. vuln.: V. vulnificus KCCM 41665.
Table III− Frantional inhibitory concentrations (FICs) and FIC indices (FICIs) of the essential oil fraction (EOF) from the roots of A. sylvestris combined with amphicillin or T/S
Combination S. boyd. S. flex. S. sonn. V. harv. V. para. V. vuln.
FIC FICI FIC FICI FIC FICI FIC FICI FIC FICI FIC FICI
A. sylvestris EOF 0.25
0.50 0.50
1.00 0.25
0.50 0.03
0.28 0.50
1.00 0.50
Amphicillin 0.25 0.50 0.25 0.25 0.50 0.50 1.00
A. sylvestris EOF 1.00
2.00 0.25
0.50 0.50
1.00 0.02
0.15 0.50
1.00 0.50
T/S 1.00 0.25 0.50 0.13 0.50 0.50 1.00
FICI=FIC of the essential oil+FIC of amphicillin or T/S
FIC of the essential oil=MIC of the essential oil fraction in combined with amphicillin or T/S MIC of essential oil alone
---
FIC of amphicillin or T/S=MIC of amphicillin or T/S in combined with the essential oil MIC of amphicillin or T/S
---
3종 균주와 V. haveyi에 대해서도 유사한 억제 활성을 나타냈다.
전호정유의 2, 3번째 주성분인 myristicin 및 terpinolene의 MIC는 실험한 모든 균에 대해 4.00->8.00 mg/ml의 MIC를 나타 내, 이들 함유성분의 전호 정유 분획의 항균력에 기여하는 바가 적을 것으로 예측되었다. 실험한 Vibrio 3종에 대한 myristicin 및 항생제의 MIC 결과는 이미 보고된 문헌의 결과와 일치하였다.19) 그러나 전호 정유의 항균력은 대부분의 식물 정유가 그렇듯이 기존항생제에 비하면 현저히 낮아 정유 단독으로 항균제로 사용 하기는 항균력이 낮은 편이나, 기존 항생제와는 다른 작용기전 을 갖는 새롭고 안전한 천연항균제라는 이점이 있다. 이에 전호 정유의 항균제로서의 실효성을 높이기 위하여 기존 항생제의 병 용에 의한 상승작용을 checkerboard titer test로 실험하였다. 항 생제 내성균과 감수성균에 대한 결과를 비교하기 위하여, 전호 정유와의 병용효과 실험에 사용하는 항생제는 MIC 실험한 항생 제 중 실험한 균 주 다수에 내성을 나타낸 amphicillin 과 모든 균 주가 감수성을 나타낸 T/S(1 : 19)를 선정하였다.
Table III에 나타낸 바와 같이 Shigella 및 Vibrio 각 3종 균주 에 처리한 결과 FICI가 0.15~2.00으로 나타나 전호정유와 항생 제를 병용시 항생제 내성균과 감수성균에 관계없이 상승 또는 상 가효과가 있음이 확인되었다. 특히 V. harveyi에 대한 전호정유와
T/S의 병용시 FICI가 0.15로 가장 큰 상승효과를 보여 주었고 이 때 T/S의 FIC는 0.13으로 단독 투여시에 비해 MIC가 약 1/8로 감소되었음을 나타내었다.
활성 산소종에 의해 유도된 free radical이 노화의 주요 원인 중 하나이며, 암 등 각종 질병의 원인이 된다. 근래 polyphenol 등 식물계에 분포된 천연 항산화제 연구가 활발한데, 물질에 따 라 다양한 항산화 기전이 존재하는 것으로 알려져 있다.
본 논문에서는 전호정유 전체분획과 이 정유에서 분리한 myristicin을 시료로 하여 DPPH free radical 소거 활성, 아질산 염소거능 실험, 환원력 실험을 하여 전호 정유의 항산화 작용을 측정하였다.
Fig. 1에 제시된 바와 같이 전호정유 분획은 뚜렷한 DPPH free radical 저해 활성을 나타냈으며, 농도 의존적으로 활성이 증 가되었다. 그러나 대조물질로 사용한 BHA에 비해서는 낮은 억 제 활성을 나타냈다. 같은 농도(1 mg/ml)에서 DPPH free radical 저해도를 비교했을 때, BHA(92.2%)가 전호정유분획(20.0%) 보 다 4.6배 이상 강한 효과를 나타냈다. 많은 경우에 천연항산화제 는 합성항산화제보다 작용이 약하나, BHA의 사용을 제한하는
여러 가지 문제 점을 고려하면, 약용 및 식용으로 사용되어온 전 호로부터 추출한 전호정유는 천연 항산화제로서의 가치가 있다 고 생각된다. 전호정유분획의 중요 조성성분인 myristicin은 상 대적으로 현저하게 낮은 활성을 나타냈다.
환원력 실험은 물질의 항산화력을 나타내는 중요 지표로 물질 이 Fe3+를 Fe2+로 환원시키는 반응으로 항산화 활성을 측정하 는 방법이다. Fig. 2에 나타난 바와 같이 전호정유분획은 뚜렷한 농도 의존적인 환원력을 보였으나 비교물질로 사용한 합성산화 제 BHA에 비교해서는 낮은 환원력을 보였다. 이에 비해 myristicin의 환원력은 현저히 낮아 이 성분이 정유분획의 환원 력에 미치는 영향이 적다는 것을 알 수 있었다.
결 론
이상의 결과를 종합하여 전호 정유는 본 실험에 사용한 식중 독의 중요 원인 균에 속하는 Vibrio속 및 Shigella속의 항생제 감 수성 및 내성 균주 대부분에 항균작용을 나타냄을 확인하였고, 특히 기존항생제와의 병용에 의한 상승효과를 이용하여 이들 식 품유래 균주 감염에 의한 식중독의 예방과 치료에 유용한 물질 로 개발될 수 있을 가능성을 확인하였다. 또한 본 실험 결과가 보여 준 전호정유의 뚜렷한 항산화 작용으로 전호정유가 활성산 소에 의한 세포손상으로 인한 여러 증상의 예방에 사용될 수 있 음이 예측되었다. 그러나 실용화를 위하여는 앞으로 지속적인 연 구가 더 필요하다.
감사의 말씀
이 논문은 2011년도 덕성여자대학교 교내연구비 지원을 받아 수행한 연구임.
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Fig. 1− DPPH free radical scavenging effects (%) of different concentrations of the essential oil fraction and myristicin from the roots of A. sylvestris. Values are means±SD of triplicated tests. Statistical analysis was performed with Student's t-test.
Fig. 2− Reducing power of essential oils from A. sylvestris. BHA (control, 0.12 mg/ml) was used as control. The results are given as mean±SD of triplicate independent experiments.
Statistical analysis was performed with Student's t-test.
ABS: absorbance.
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