서 론
미세조류는 이산화탄소를 고정하여 디젤, bio-hydrogen 등 다 양한 형태의 바이오 연료와 생리활성물질을 생산한다(Roessler et al., 1994; Gavrilescu and Chisti, 2005). 최근 들어 석유 가격 의 상승과 화석연료 고갈 등으로 미세조류를 이용한 바이오디젤 의 생산과 이를 통한 이산화탄소 저감 효과에 많은 관심이 모아 지고 있다(Gavrilescu and Chisti, 2005). 미세조류는 바이오연료 를 생산하는 기존의 곡물과 달리 빠른 성장속도와 성장을 조절할 수 있다는 특징을 가지고 있으며 종에 따라 다양한 종류의 지방 과 탄화수소 그리고 오일 등을 생산하고 있어 바이오연료 생산을 위한 생물자원으로 가장 적합한 것으로 보고되고 있다(Banerjee et al., 2002, Guschina and Harwood, 2006).
본 논문은 바이오디젤의 생산성이 높은 미세조류 Dunaliella salina의 대량생산을 위하여 그 성장을 촉진 시킬 수 있는 해 양방선균을 선별하기 위한 것이다. 해양에서 분리된 방선균 은 16s rDNA 분석결과에서 유전적 특징은 토양방선균과 비 슷하지만 성장에 해수 중 이온을 필요로 하는 등 해양방선균 고유의 특징을 가지고 있는 것으로 알려져 있다(Jensen et al., 2005). 해양방선균은 다양한 생리활성물질의 생산으로 많은 연구의 대상이 되고 있으며 그 중 Streptomyces sp.는 호기성 의 그람양성균으로 그 형태적 특징은 사상균과 유사한 것으로 알려져 있다(Fenical, 1993). 최근 들어 Streptomyces sp.에서
cytotoxic actinofuranones, azamerone 및 항염증성 물질(Park et al., 2006: Cho et al., 2006a, b) 등과 같은 다양한 대사물질 을 생산할 수 있어 그 가치와 활용성이 주목 받고 있다. 본 연 구에서는 해조류에서 분리한 방선균 98 균주의 추출물을 대상 으로 D. salina의 성장 촉진 효과를 분석하였고 바이오디젤로 사용되는 지방산(C16, C18)의 함량 변화를 비교 분석하였다.
재료 및 방법
해양방선균과 미세조류
해양방선균은 2004년 8월부터 2010년 2월까지 한국연안(
강릉, 포항, 울산, 부산, 통영, 완도)에서 채집한 해조류 및 해조류 근권에서 분리하였다(Park et al., 2006). 미세조류 Dunaliella salina는 한국미세조류 은행에서 분양 받아 사용 하였다.
방선균 배양 및 추출물 제조
해조류 및 근권으로부터 분리한 방선균은 M1 배지(starch 10 g, yeast extract 4 g, peptone 2 g, seawater 1 L) 500 mL에 접종 하여 20℃에서 10일간 진탕 배양하였다. 배양액에 20 g/L의 Amberite XAD-7 resin을 첨가하여 6시간 동안 다시 진탕시켜 방선균 대사물질을 흡착 시켰다. 흡착된 resin은 거즈를 이용 하여 회수하였고 1 L의 증류수를 사용하여 잔류 이온을 제거하
*Corresponding author: [email protected]
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Growth Activation of the Biodiesel-producing Microalga Dunaliella salina Using an Extract of the Marine
Actinomycete Streptomyces anulatus
Ji Young Cho
Marine actinomycetes isolated from seaweed were screened for growth activation effects on the biodiesel-producing microalgae Dunaliella salina. Of the 98 actinomycetes studied, strain 288-11 isolated from the rhizosphere of Undaria pinnatifida showed potent growth activation. The strain was identified as Streptomyces anulatus based on 16S rDNA sequence analysis. The cell density increased up to 2.1-fold with the addition of 1 mg/mL of extract to the medium. To understand the effect of adding S. anulatus extract, the gross biochemical composition and fatty acids of D. salina were determined.
Key words: Actinomycetes, Streptomyces anulatus, Dunaliella salina, Biodiesel, Growth activation
Department of Marine Biotechnology, Soonchunhyang University, Asan 336-900, Korea고 500 mL의 아세톤으로 추출하였다. 추출액은 40℃에서 진 공 농축하여 농도가 40 mg/mL가 되도록 메탄올에 녹여 -20℃
에 보관하여 사용하였다.
미세조류의 성장촉진 효과
미세조류 D. salina는 1.2±0.4×105 cell/mL의 농도로 F/2배지 (Guillard & Ryther, 1962)가 담긴 24-well plate에 접종하였고 98종류의 방선균 추출물을 각각 1 mg/mL의 농도로 첨가하였 다. Cell 수는 접종된 well plate를 20℃, 70 umol/m2/s에서 7 일 동안 배양한 후에 계수하였다. 성장촉진 효능이 가장 좋은 균주를 선별하여 1일 간격으로 10일 동안 cell 수를 계수하여 대조구와 비교하였다.
16S rDNA에 의한 방선균 동정
선별된 방선균의 동정을 위하여 16S rDNA 염기서열 분석을 실시하였다. Chromosomal DNA는 High pure PCR template preparation kit (Roche, Mannheim, Germany)을 이용하여 분리 하였고 16S rDNA 염기서열 분석에 사용하는 universal primer 인 27F (5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′) 와 1492R universal primer (5′-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3′)를 사용하여 PCR증폭하였다(Park et al., 2006). Agarose gel 전기 영동 후 PCR 산물은 GeneAll Gel SV kit (Generalbiosystem, Seoul, Korea)를 이용하여 정제하였고 TOPO-TA Cloning kit (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 이용하여 cloning하였다.
GeneAll Plasmid SV kit (Generalbiosystem, Seoul, Korea)을 이용하여 plasmid를 분리하였고 Big Dye Terminator Cycle DNA Sequencing kit (ABI PRISM PE, Applied Biosystems, Carlbad, CA, USA)를 이용하여 염기서열 분석을 실시하였다.
그 결과는 BLASTN 프로그램을 이용하여 Gene-Bank의 염기 서열과 비교 분석하였다.
생화학 조성 분석
방선균 추출물의 세포 내 영향을 확인하기 위해 건중량, 탄
수화물, 지방, 단백질, 클로로필 a 등의 생화학 조성을 분석 하였다. 동결건조 된 미세조류의 건중량은 미세조류를 0.5 M 중탄산암모늄(NH4HCO3)을 이용하여 세척하고 90℃에서 24 시간 건조 시킨 후 측정하였다. 탄수화물의 함량은 phenolic- sulfuric acid method (Kochert, 1978)로 분석하여 glucose 함 량으로 나타내었다. 클로로필 a는 100% 아세톤으로 추출하여 Sterman equation (1988)을 이용하여 측정하였다. 총 지질은 핵산과 isopropanol (3:2)로 추출하여 중량 측정하였고 단백질 은 Lowry method (1951)를 이용하여 측정하였다.
지방산 분석
미세조류는 4℃, 10분 동안 원심 분리 (1,000 rpm)하여 회 수 하였고 지방산분석을 위해 동결 건조하였다. 지방산의 methylation은 Whyte (1998) 방법으로 총 지질을 추출하여 benzene과 14% BF3-methanol을 가하고 80℃에서 30분간 가 열하여 methylation 시켰다. 지방산분석은 gas chromatography (Hewlett-Packard 5890, USA)에서 Supelcowax 10 fused silica capillary column (30 m×0.32 mm ID, 0.25 mm) 이용 하여 FI 검출기로 분석 하였다. 분석 프로그램 조건은 18℃에 서 35분간 유지하고 2℃/min로 240℃까지 변화시키고 240℃
에서 20분간 유지하였다. 헬륨 가스는 21 cm/s로 split ratio 100:1의 조건으로 실시하였다. 지방산 standard를 이용하여 바 이오디젤로 사용되는 탄소(C16, 18)의 지방산 함량을 비교분 석 하였다.
방선균 배양 배지별 효능
방선균 288-11의 추출물 함량을 높이기 위해 M1 배지를 포 함한 8종의 해양배지를 이용하여 288-11 균주를 배양하였다.
Tryptone과 casitone 및 glucose를 기본으로 하는 TCG배지에 CaCO3와 무기물(Fe2(SO4)3 4H2O, KBr)을 첨가한 4종의 배 지(TCG, T+C, TBFe, TBFe+C)를 준비하였고 starch와 yeast extract 및 peptone을 기본으로 하는 M1배지에 CaCO3와 무기 물(Fe2(SO4)3 4H2O, KBr)을 첨가한 4종의 배지(M1, M1+C,
Table 1. Composition of broth media for actinomycetes culture in 1 L seawater (g/L) at pH 8.0
Media Tryptone Casitone Glucose Starch Yeast Extract Peptone CaCO3 Fe2(SO4)3 4H2O KBr Reference
TCG 3 5 4 1 0.04 0.1 Newton et al., 2008
T+C 3 5 4 In this work
TBFe 3 5 4 In this work
TBFe+C 3 5 4 1 0.04 0.1 In this work
M1 10 4 2 Moore et al., 1999
M1+C 10 4 2 1 Choi et al., 2010
M1BFe 10 4 2 0.04 0.1 Asolkar et al., 2006
M1BFe+C 10 4 2 1 0.04 0.1 Bugni et al., 2006
통계처리
결과는 3반복 실험을 통해 평균값을 나타내었으며 Student t-test로 평균간의 유의성을 검정하였다.
결과 및 고찰
미세조류 성장 촉진 효과
해조류로부터 분리한 98 균주를 배양하여 추출물을 조제하 고 바이오디젤 생산 미세조류 D. salina의 성장 촉진효과를 확 인하였다. 그 결과 가장 효능이 높은 288-11 균주를 선별하였 다. 균주 288-11은 Undaria pinatifida의 근권에서 분리된 균 주로 추출물 1 mg/mL의 농도에서 접종 7일 째 D. salina의 1.9 배 성장촉진 효과를 나타내었다. D. salina는 해양방선균 추출 물이 첨가되지 않은 배지에 접종 후 4일째에 대수증식기에 달 하며 접종 후 8일째에 정체기에 도달하였다. 방선균 288-11 균 주의 추출물을 배양액에 첨가한 경우 배양 3일에 대조구에 비 해 1.8배의 성장촉진 효과를 나타내었으며 배양 4일에는 2.1배 를 나타내었고 정체기인 배양 8일에는 1.8배의 성장촉진 효과 를 나타내었다(Fig. 1).
16S rDNA에 의한 방선균 동정
미세조류의 성장촉진 효과를 나타내는 균주 288-11을 동정하
기 위하여 16S rDNA 염기서열을 분석하였다. 그 염기서열을 BLASTN 프로그램을 이용하여 GeneBank의 ribosomal DNA 염기서열과 상동성을 비교한 결과 Streptomyces anulatus (accession number DQ026637.1)와 99%의 유사성을 나타내 었다. 따라서 분리된 균주는 S. anulatus 288-11로 명명하였 다(Table 2).
생화학 조성 분석
미세조류의 생화학 조성은 cell당 함량으로 표시하였다. 건 중량, 탄수화물, 클로로필 a의 함량은 방선균 추출물을 첨가 하여 배양한 경우와 첨가하지 않은 경우에 큰 차이를 나타내 지 않았지만 지질 함량과 단백질 함량에서는 차이를 나타내었 다(P＜0.01). 지질 함량의 경우 추출물을 첨가하여 배양한 경우 가 1.17배 높게 나타났고 단백질 함량의 경우 0.92배로 낮게 나 타났다(Table 3).
지방산 조성분석
미세조류 D. salina의 지방산 중 바이오디젤로 사용이 가능 한 탄소 16과 18의 함량을 분석한 결과 16:0, 16:1, 16:2, 16:3, 18:0, 18:1, 18:2, 18:3의 지방산이 분석되었다. 그 중 18:3 지방 산의 경우 39.4%로 가장 높게 나타났으며 16:0의 경우 22.4%, 18:2의 경우 18.4%로 나타났다. S. anulatus 288-11 추출물을 첨가한 경우 18:3 지방산은 39%로 추출물을 첨가하지 않은 경 우보다
0.4
% 낮게 나타났으며16:0
의 경우는 22.8%로 0.4%높게 나타났다. 지방산 중 18:1과 18:2의 함량이 각각 15.2%
와 15.3%로 나타나 추출물을 첨가하지 않은 경우의 지방산 함 량과 차이를 나타내었다. 전체적인 지방산의 조성과 함량에 는 큰 차이를 보이지 않았으며 biomass 생산량의 상승으로 바
Fig. 1. Effect of bacterial extract of strain 288-11 on D. salina cell growth. Cells of D. salina were cultured in f/2 medium inoculated with 1.2±0.4×10
5cell/mL. Bacterial extract was added to medium at 1 mg/mL (○). The reference was cultured in the f/2 medium without the extract (●).
Table 3. Gross biochemical composition of D. salina cultured in f/2 medium with and without the water extract of S. anulatus (1 mg/mL). Cell was cultured for 8 days and values are expressed as dry weight in gram per cell.
Cultured without
extract Cultured with extract Dry weight 2.54×10-10 2.46×10-10 Carbohydrate 5.12×10-10 5.14×10-10 Chlorophyll 3.64×10-12 3.78×10-12
Lipid 3.41×10-9 4.01×10-9*
Protein 3.92×10-9 3.64×10-9*
*Significantly different from control at P < 0.01.
80 60 40 20
0 2 4 6 8 10
Cell No. (x105 cell/mL)
Days
이오디젤의 생산량은 2.04배 증가하였다(Table 4). 본 결과를 D. tertiolecta의 지방산 함량(Tang et al., 2011)과 비교한 경우 16:1 지방산과 18:0, 18:2의 함량이 높게 나타났으며 18:3 지방 산의 함량이 비교적 낮게 나타났다.
방선균 배지별 효능
배양배지 별로 방선균의 추출물 생산 결과를 분석한 결과 M1 배지의 경우 120 mg/mL의 물질을 생산하였다. M1 배지에 CaCO3를 첨가한 경우 추출물(M1+C)의 양은 1.17배 상승하 였고 BFe를 첨가한 경우(M1BFe)는 M1 배지의 경우와 동일한 양의 추출물을 생산하였다. TCG배지의 경우 84.5 mg/mL로 M1배지에 비해 낮게 나타났으며 CaCO3 및 무기물(Fe2(SO4)3 4H2O, KBr)을 첨가한 경우(TCG, TBFe, TBFe+C)에도 M1배 지에 비해 추출물의 생산량은 낮게 나타났다. 각각의 추출물을 미세조류 D. salina의 성장에 미치는 영향을 확인한 결과 TCG 배지 추출물은 M1배지 추출물에 비해 세포성장이 낮게 나타 나며 CaCO3 및 무기물(Fe2(SO4)3 4H2O, KBr)을 첨가한 경우 (TCG, TBFe, TBFe+C)에도 동일하였다. M1배지에 BFe를 첨 가한 추출물(M1BFe)을 미세조류 배양배지에 첨가한 결과 미 세조류의 성장은 M1배지 추출물에 비해 1.54배 높게 나타났 다(Table 5).
바이오디젤의 생산성이 높은 미세조류 D. salina를 대상으 로 그 생산성을 높이기 위하여 배양액 첨가물질을 해양방선균 으로 부터 탐색하였다. 해조류 및 해조류 근권에서 분리한 98 균주를 대상으로 추출물을 제조, 배양액에 첨가하여 D. salina 의 성장을 확인 한 결과 288-11균주의 추출물이 가장 높은 효 능을 나타내었고 그 균주를 16S rDNA sequencing을 통하여 S.
anulatus 288-11로 명명하였다. S. anulatus 288-11의 추출물 을 미세조류 D. salina의 배양액에 첨가한 결과 대수증식기(배 양 4일째)에 2.1배의 성장촉진 효과를 확인하였다. D. salina
의 생화학조성을 분석한 결과 S. anulatus 288-11의 추출물을 첨가한 경우 지질의 함량은 높아지고 단백질의 함량은 낮아졌 으며, 바이오디젤로 사용 가능한 지방산(C16, C18) 조성의 변 화를 분석한 결과 추출물을 첨가한 경우 C18:1의 함량은 증가 하고 C18:2의 함량은 감소하는 것으로 나타났다. 해양방선균 Streptomyces sp.는 배양액에 따라 추출물의 종류와 양이 달라 진다. 따라서 Streptomyces 배양에 쓰이는 해양배지 8종을 이 용하여 S. anulatus 288-11의 8종류의 추출물을 제조하여 각 각의 추출물이 D. salina의 성장에 미치는 영향을 확인한 결 과 M1BFe 배지 추출물의 경우 M1 배지 추출물에 비해 1.54 배 높게 나타났다. 추후 S. anulatus 288-11로부터 D. salina 의 성장 촉진 물질을 분리하여 그 구조를 규명하는 연구를 진 행하고자 한다
사 사
이 논문은 2008년도 정부재원(교육과학기술부)으로 한국연 구재단의 지원을 받아 연구되었음(No. 531-2008-1-F00010).
참고문헌
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Daryamides A-C, weakly cytotoxic polyketides from a marine-derived actinomycete of the genus Streptomyces strain CNQ-085. J Nat Prod 69, 1756-1759.
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Bugni TS, Woolery M, Kauffman CA, Jensen PR and Fenical W. 2006. Bohemamines from a marine-derived Strepto- myces sp. J Nat Prod 69, 1626-1628.
Cho JY, Kwon HC, Williams PG, Kauffman CA, Jensen PR and Fenical W. 2006a. Actinofuranones A and B, polyketides from a marine-derived bacterium related to the genus Streptomyces (Actinomycetales). J Nat Prod Table 4. Fatty acid composition (% of total fatty acids) of D.
salina cultured for 8 days in f/2 medium with and without the extract of S. anulatus extract (1 mg/mL).
Fatty acids Cultured without
extract Cultured with extract
16:0 22.41±0.12 22.81±0.14
16:1 1.31±0.08 1.40±0.02
16:2 1.70±0.06 1.63±0.05
16:3 1.92±0.04 2.03±0.06
18:0 2.62±0.09 2.70±0.06
18:1 12.34±0.10 15.21±0.12*
18:2 18.42±0.21 15.32±0.16*
18:3 39.41±0.26 39.02±0.22
Biomass productivity (g/L) 0.21±0.01 0.43±0.01*
*Significantly different from control at P < 0.01.
Table 5. Microalgae cell density with different bacterial media extract. Cell No. was counted at 4 days.
Media Extracts yield
(mg/L) Cell density
(×105 cell/mL)
TCG 84.51±1.23 28.78±1.28
TCG+C 89.91±0.87 29.13±2.36
TBFe 110.30±4.86 32.42±2.59
TBFe+C 111.82±6.78 36.61±1.89
M1 120.43±2.85 37.83±1.94
M1+C 141.35±7.82 38.14±2.34
M1BFe 120.50±8.74 57.32±2.51
M1BFe+C 116.29±8.21 50.50±2.21
