Development of Analytical Method for Ambroxol Hydrochloride and Clenbuterol Hydrochloride Formulation in Korean Pharmaceutical Codex
Tae-Woong Lee#, Rae-Seok Jeong, Soo-Jin Park, Lan Choi*, Young-Hun Shim*, Bo-Kyung Choi* and Hyo-Sun Kwak Hazardous Substances Analysis Division, Daejeon regional Korea Food & Drug Administration, Daejeon 302-828, Korea
*National Institute of Food and Drug Safety Evaluation, Osong Health Technology Administration Complex, Chungcheongbuk-do 363-700, Korea
Abstract — The Korean Pharmaceutical Codex (KPC) analytical method of ambroxol hydrochloride and clenbuterol hydro- chloride formulation is complicated and needed to carry out multiple processes during the test.1) To improve the low effi- ciency of analytical procedure that makes pharmaceutical laboratory consume much time and high cost to conduct the test of this formulation, this study was performed for simplifying the pretreatment process and optimizing conditions of the HPLC assay. The analytical procedure using HPLC was developed to establish analytical specification for ambroxol hydro- chloride and clenbuterol hydrochloride formulations. The newly developed analytical method has good linearity (R2>0.999), specificity, precision (RSD<1.0%) and the recovery ranges of 98.50~101.84% for ambroxol, 98.29~101.35% for clenbuterol syrup and 98.66~101.71% for clenbuterol tablets. The LOQs were 0.204 μg/ml for ambroxol, 0.021 μg/ml for clenbuterol syrup and 0.073μg/ml for clenbuterol tablets.2) The new method was performed with commercially available samples to confirm analytical conditions and validated to be suitable for saving time and cost to control the quality of routine man- ufactured products. This analytical method will be used for revising the monograph of ambroxol hydrochloride and clen- buterol hydrochloride formulation in next supplement of KPC.
Keywords □ method validation, ambroxol hydrochloride, clenbuterol hydrochloride
암브록솔염산염(Ambroxol Hydrochloride, 2-Amino-3,5-dibromo- N-(trans-4-hydroxycyclohexyl)benzylamine hydrochloride, C13H18Br2N2O · HCl, MW 414.56)은 점액분비 장애로 인한 급·만성 호흡기 질환(급·만성 기관지염, 기관지 천식, 부비강 염, 건성비염) 등의 치료에 사용되고 있는 약물이다(Fig. 1).3-6) 클렌부테롤염산염(Clenbuterol Hydrochloride, 4-Amino-α-(t- butylaminomethyl)-3,5-dichlorobenzyl alcohol hydrochloride, C12H18Cl2N2O · HCl, MW 313.56)은 베타2 agonist로서 기관지 확장 작용으로 기관지천식, 만성 기관지염, 폐기종 등의 기도폐
쇄성 장애에 의한 호흡곤란 등의 치료에 사용되는 약물이다(Fig.
1).7-12)이런 호흡기에 작용하는 진해거담성분제제는 2012년도
약효 별 허가 및 신고 기준으로 해열·진통·소염제, 순환계용 약, 항생제에 이어 4번째로 많은 품목 수를 나타내며, 이 중 암 브록솔염산염 및 클렌부테롤염산염은 단일제, 복합제 및 정제, 시럽제 등 다양한 제형으로 60여 품목이 생산, 수입 유통되어 다 빈도로 실생활에 사용되고 있는 의약품이다.13)반면 해당 의약 품의 시험법은 에테르 및 염산을 이용한 반복적인 추출 과정을
#Corresponding Author Tae-Woong Lee
Hazardous Substances Analysis Division, Daejeon regional Korea Food & Drug Administration, 166 Cheongsa-ro, Seo-gu, Daejeon 302-828, Korea
Tel.: 042-480-8797 Fax.: 042-480-8790 E-mail: [email protected]
Fig. 1 − Structures of ambroxol hydrochloride (a) and clenbuterol hydrochloride (b).
거쳐야 함에 따라 유기용매가 다량소모 되어 환경적인 면과 실 험자의 건강보호 측면에서 개선이 요구되며, 분획-분리-세척-여 과-증발건고 등의 다단계 과정은 전처리에 있어 많은 시간이 소 요될 뿐 아니라 오차 발생 요소로 작용하여 결과의 정밀도와 정 확도에 편차가 비교적 크다(Fig. 2).14)
우리나라의 의약품 시험법은 의약품공정서인 「대한민국약전」
및 「대한민국약전외의약품기준」을 고시하여 의약품 품질관리 에 필요한 규격들을 설정하고 꾸준한 제·개정을 통해 최신 분 석기술 및 세계적인 기준·규격을 반영하고 있다.15)다품종 소 량생산이 대부분 국내 제약업계의 제조형태임을 감안하면 다수 의 제조번호에 대해 신속하게 품질적부 판정을 할 수 있는 신속 하고 간단하면서 편차가 적은 품질시험법의 도입은 무엇보다 중
요하다.16-18)이에 본 연구에서는 「대한민국약전외의약품기준」
수재 의약품 각조 중 시험법이 노후되어 시험법 개선이 시급하 고 현재 생산유통이 활발하여 의약품시험검정 및 품질관리와 관 련한 재검토가 우선적으로 필요한 품목으로 암브록솔염산염 및 클렌부테롤염산염 제제를 선정하여 시험법 개선을 위한 연구를 수행하였다. 식약처의 "의약품등 시험방법 밸리데이션 가이드라 인"에 따라 분석법 밸리데이션을 통하여 전처리법 및 함량 분석 조건을 설정하고 유통 제품의 함량시험을 수행하여 최종 확립하 고자 하였다.2,19,20)
실험방법
시약 및 기기
암브록솔염산염 표준품(Fluka, A9797, USA) 및 클렌부테롤염 산염 표준품(Sigma, C5423, USA)을 구입하여 사용하였다. 고성 능 액체크로마토그래프(HPLC) 이동상 제조에 사용한 아세토니 트릴 및 메탄올 등의 시약은 Merck사(Darmstadt, Germany)의 HPLC 등급을 사용하였다. HPLC는 Waters사(Milford, MA, USA)의 Alliance 2695 Separations Module, 2998 Photodiode Array Detector로 분석하였다.
품목 선정
「대한민국약전외 의약품 기준」에 수재된 암브록솔염산염과 클렌부테롤염산염 제제 함량 시험법 중 단순 희석 후 흡광도를 측정하는 정량법으로 설정된 암브록솔염산염 단일성분 정제를 제외하고, 추출, 분획분리 및 농축 등 복잡한 전처리 과정을 포 함하는 1) 암브록솔염산염 단일성분 시럽제, 2) 클렌부테롤염산 염 단일성분 시럽제, 3) 암브록솔염산염·클렌부테롤염산염 복 합성분 시럽제, 4) 암브록솔염산염·클렌부테롤염산염 복합성분 정제로 선정하였다. 실험에 사용된 시험약은 국내 허가현황을 검 토하여 서로 다른 제조회사이면서 현재 유통되는 제품으로 선정 Fig. 2 − Analytical method described in KPC for ambroxol hydrochloride (a) and clenbuterol hydrochloride (b) in the formulation containing
both components.
Table I − List of tested drugs
Item Dosage form Labeled amount
Ambroxol hydrochloride syrup A
B Single component syrup 3 mg/ml
Clenbuterol hydrochloride syrup C Single component syrup 1µg/ml
Ambroxol hydrochloride and clenbuterol hydrochloride syrup D
E Complex components syrup 1.5 mg/ml (A)* 1µg/ml (C)* Ambroxol hydrochloride and clenbuterol hydrochloride tablets F
G Complex components tablets 30 mg/tab (A)* 20µg/tab (C)*
* (A): ambroxol hydrochloride, (C): Clenbuterol hydrochloride.
를 넣어 초음파로 15분간 추출한 후 0.1 mol/l 메탄올성염산시액 을 넣어 100 ml로 하였다. 이 액 5 ml를 정확하게 취하여 0.1 mol/l 메탄올성염산시액을 넣어 50 ml로 하여 표준액으로 하였다. 검 액 및 표준액 10 μl씩을 가지고 액체크로마토그래프법에 따라 시 험하여 각 액의 암브록솔염산염의 피크면적을 구했다.21-24)
클렌부테롤염산염 시럽 − 클렌부테롤염산염 약 10 μg에 해당하 는 양을 취해 20 ml 용량플라스크에 넣고 이동상을 넣어 20 ml 로 하여 검액으로 하였다. 따로 클렌부테롤염산염표준품 약 10 mg 을 정밀하게 달아 이동상을 넣어 100 ml로 하였다. 이 액 1 ml를 정확하게 취하여 이동상을 넣어 200 ml로 하여 표준액으로 하였 다. 검액 및 표준액 20 μl씩을 액체크로마토그래프법에 따라 시 험하여 각 액의 클렌부테롤염산염의 피크면적을 구했다.25-29)
암브록솔염산염·클렌부테롤염산염 복합정제 중 암브록솔염 산염 − 검체 20정 이상을 가지고 그 질량을 정밀하게 달아 가루 로 하였다. 암브록솔염산염 약 30 mg에 해당하는 양을 취해 200 ml 용량플라스크에 넣고 0.1 mol/l 메탄올성염산시액 120 ml를 넣어 초음파로 15분간 추출한 후 0.1 mol/l 메탄올성염산시액을 넣어 200 ml로 하였다. 이 액 5 ml를 정확하게 취하여 0.1 mol/l 메탄올성염산시액을 넣어 50 ml로 하여 검액으로 하였다. 암브 록솔염산염 시럽의 함량 분석법과 동일하게 분석하였다.
암브록솔염산염·클렌부테롤염산염 복합정제 중 클렌부테롤염 산염 − 검체 20정 이상을 가지고 그 질량을 정밀하게 달아 가루 로 하였다. 클렌부테롤염산염 약 100 μg에 해당하는 양을 취해 100 ml 용량플라스크에 넣고 이동상 60 ml를 넣어 15분간 추출 한 후 이동상을 넣어 100 ml로 하여 검액으로 하였다. 따로 클 렌부테롤염산염표준품 약 10 mg을 정밀하게 달아 이동상을 넣 어 10 ml로 하였다. 이 액 1 ml를 정확하게 취하여 이동상을 넣 어 100 ml로 하여 표준액으로 하였다. 클렌부테롤염산염 시럽의 함량 분석법과 동일하게 분석하였다.
HPLC의 분석조건 확립
암브록솔염산염의 HPLC 분석조건은 Capcell Pak C18(5 μm, 150×4.6 mm) 칼럼을 사용하여 탄산암모늄 1 g을 물 1000 ml에 녹이고 이 액 430 ml에 아세토니트릴 570 ml를 넣어 조제한 이 동상으로 유량 1.0 ml/min로 하여 자외부흡광광도계의 측정파장
는 검량선의 기울기를 나타낸다. 기울기 S는 분석대상물질의 검 량선으로부터 구하였으며, 표준편차 σ는 검량선 y절편의 표준편 차를 이용하였다.2,14)
암브록솔염산염 시럽·정 − 특이성은 표준액 및 희석용매를 검 액으로 하여 이들의 크로마토그램 및 포토다이오드어레이(PDA) 를 이용하여 첨가제에 의한 주성분 피크의 간섭여부를 확인하였 다. 직선성은 암브록솔염산염 표준품(99.97%)을 0.1 mol/l 메탄 올성염산시액에 녹여 각각 약 1.5, 9.0, 12.0, 15.0, 18.0 μg/ml 해 당액을 표준액 I, II, III, IV, V로 하여 분석법의 전 조작을 3회 수행하여 각각 직선식을 구하고, 각 직선식 결정계수(R2)로부터 직선성을 평가하였다. 정확성은 암브록솔염산염 표준품(99.97%) 15 mg을 정밀히 취하여 0.1 mol/l 메탄올성염산시액에 녹여 정 확하게 100 ml로 한 것을 표준원액(150.0 mg/ml)으로 하고, 시럽 은 시험약 A 10 ml를 0.1 mol/l 메탄올성염산시액에 녹여 정확하 게 200 ml로 한 것을 제제 희석액으로 하고, 정제는 시험약F 1 정을 0.1 mol/l 메탄올성염산시액에 녹여 정확하게 200 ml로 한 것을 제제 희석액으로 하였다. 표준원액 및 제제 희석액을 취하 여 0.1 mol/l 메탄올성염산시액을 넣어 만든 각각 약 13.5, 15.0, 16.5μg/ml 해당액을 정확성 시험용액으로 하여 각 농도의 정확 성시험용액 I, II, III 용액에 대해서 분석법의 전 조작을 각 농도 당 3회씩 반복 측정한 결과로부터 회수율(%)을 계산하여 정확성 을 평가하였다. 정밀성은 암브록솔염산염 표준품(99.97%) 15 mg 을 정밀히 취하여 0.1 mol/l 메탄올성염산시액에 녹여 정확하게 100 ml로 한 것을 표준원액(150.0 μg/ml)으로 하고, 표준원액 5 ml 를 취하여 0.1 mol/l 메탄올성염산시액을 가하여 50 ml로 한 정 밀성시험용액(15.0 μg/ml)을 가지고 분석법의 전 조작을 6회 반 복 측정한 결과로부터 상대표준편차(%)를 계산하여 정밀성을 평 가하였다. 정량한계는 반응의 표준편차와 검량선의 기울기에 근 거하는 방법에 따라 구하였다.
클렌부테롤염산염 시럽 − 특이성은 표준액 및 희석용매를 검액 으로 하여 이들의 크로마토그램 및 포토다이오드어레이(PDA)를 이용하여 첨가제에 의한 주성분 피크의 간섭여부를 확인하였다.
직선성은 클렌부테롤염산염 표준품(100.0%)을 이동상에 녹여 각 각 약 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6 μg/ml 해당액을 표준액 I, II, III, IV, V로 하여 분석법의 전 조작을 3회 수행하여 각각 직선식을 구하
고, 각 직선식 결정계수(R2)로부터 직선성을 평가하였다. 정확성 은 클렌부테롤염산염 표준품(100.0%) 10 mg을 정밀히 취하여 이 동상에 녹여 정확하게 100 ml로 하고, 이 액 1 ml를 취하여 이동 상에 녹여 정확하게 100 ml로 한 것을 표준원액(1.0 μg/ml)으로 하고, 시험약 C 자체를 제제원액으로 하였다. 표준원액 및 제제 원액을 취하여 이동상을 넣어 만든 각각 약 0.45, 0.50, 0.55 μg/
ml 해당액을 정확성 시험용액으로 하여 각 농도의 정확성시험용 액 I, II, III 용액에 대해서 분석법의 전 조작을 각 농도당 3회씩 반복 측정한 결과로부터 회수율(%)을 계산하여 정확성을 평가하 였다. 정밀성은 클렌부테롤염산염 표준품(100.0%) 10 mg을 정밀 히 취하여 이동상에 녹여 정확하게 100 ml로 한 것을 표준원액 (100.0μg/ml)으로 하고, 표준원액 1 ml를 취하여 이동상을 가하 여 200 ml로 한 정밀성시험용액(0.5 μg/ml)을 가지고 분석법의 전 조작을 6회 반복 측정한 결과로부터 상대표준편차(%)를 계산 하여 정밀성을 평가하였다. 정량한계는 반응의 표준편차와 검량 선의 기울기에 근거하는 방법에 따라 구하였다.
클렌부테롤염산염 정 − 특이성은 표준액 및 희석용매를 검액으 로 하여 이들의 크로마토그램 및 포토다이오드어레이(PDA)를 이 용하여 첨가제에 의한 주성분 피크의 간섭여부를 확인하였다. 직 선성은 클렌부테롤염산염 표준품(100.0%)을 이동상에 녹여 각각 약 0.4, 0.6, 0.8, 1.0, 1.2 μg/ml 해당액을 표준액 I, II, III, IV, V 로 하여 분석법의 전 조작을 3회 수행하여 각각 직선식을 구하 고, 각 직선식 결정계수(R2)로부터 직선성을 평가하였다. 정확성 은 클렌부테롤염산염 표준품 (100.0%) 10 mg을 정밀히 취하여 이동상에 녹여 정확하게 100 ml로 하고, 이 액 1 ml를 취하여 이 동상에 녹여 정확하게 50 ml로 한 것을 표준원액(2.0 μg/ml)으로 하고, 시험약 F 5정을 이동상에 녹여 정확하게 50 ml로 한 것을 제제 희석액으로 하였다. 표준원액 및 제제 희석액을 취하여 이 동상을 넣어 만든 각각 약 0.9, 1.0, 1.1 μg/ml 해당액을 정확성 시험용액으로 하여 각 농도의 정확성시험용액 I, II, III 용액에 대해서 분석법의 전 조작을 각 농도당 3회씩 반복 측정한 결과
로부터 회수율(%)을 계산하여 정확성을 평가하였다. 정밀성은 클 렌부테롤염산염 표준품(100.0%) 10 mg을 정밀히 취하여 이동상 에 녹여 정확하게 100 ml로 한 것을 표준원액(100.0 μg/ml)으로 하고, 표준원액 1 ml를 취하여 이동상을 가하여 100 ml로 한 정 밀성시험용액(1.0 μg/ml)을 가지고 분석법의 전 조작을 6회 반복 측정한 결과로부터 상대표준편차(%)를 계산하여 정밀성을 평가 하였다. 정량한계는 반응의 표준편차와 검량선의 기울기에 근거 하는 방법에 따라 구하였다.
함량 시험
HPLC의 분석조건 및 밸리데이션 결과를 바탕으로 설정된 전 처리 방법(Fig. 3)으로 암브록솔염산염 시럽은 시험약 A, B, 클 렌부테롤염산염 시럽은 시험약 C, 암브록솔염산염·클렌부테롤 염산염 복합시럽제는 시험약 D, E, 암브록솔염산염·클렌부테 롤염산염 복합정제는 시험약 F, G 에 대하여 함량시험을 실시하 였다.
실험결과
HPLC의 분석조건 확립
암브록솔염산염 시럽·정 − 함량 분석법의 밸리데이션 결과 포 토다이오드어레이(PDA)를 이용하여 주성분 피크의 단일성 여부 를 확인하였다(Fig. 4). 암브록솔염산염은 1.5~18.0 μg/ml의 범 위에서 결정계수(R2) 0.999 이상을 나타내었고(Fig. 5), 정확성은 암브록솔염산염의 경우 정확성시험용액 I, II, III 용액(각각 13.5, 15.0, 16.5μg/ml)을 가지고 분석법 전 조작을 각 농도 3회씩 반 복 측정한 결과 평균 회수율 100.8%, 표준편차 0.830%의 결과 를 나타내었다(Table II). 정밀성은 정밀성 시험용액을 가지고 분 석법의 전 조작을 6회 반복 측정한 결과로부터 구한 상대표준편 차는 0.68%였으며(Table III), 정량한계는 반응의 표준편차와 검 량선의 기울기에 근거하는 방법에 따라 측정하였을 때 0.204 μg/
Fig. 3 − Developed method for ambroxol hydrochloride (a) and clenbuterol hydrochloride (b).
ml로 나타났다.
클렌부테롤염산염 시럽 − 함량 분석법의 밸리데이션 결과 포토 다이오드어레이(PDA)를 이용하여 주성분 피크의 단일성 여부를
확인하였다(Fig. 6). 클렌부테롤염산염은 0.2~0.6 μg/ml의 범위 에서 결정계수(R2) 0.999 이상을 나타내어 양호한 직선성을 나 타내었다(Fig. 7). 클렌부테롤염산염은 정확성 시험용액 I, II, III Fig. 4 − Specificity of HPLC analytical condition for ambroxol hydrochloride syrup and tablets. (a) Chromatogram and (b) PDA scan of ambroxol
hydrochloride standard solution (15µg/ml).
Fig. 5 − Calibration curve of HPLC assay for ambroxol hydrochloride syrup and tablets.
Table II − Accuracy of HPLC analytical condition for ambroxol hydrochloride syrup and tablets
Dosage form Item Actual conc. (µg/ml) Tested conc. (µg/ml) Recovery (%) Standard deviation
Single component syrup
A
13.62 13.77
101.14 0.237
15.12 15.32
16.62 16.80
B
13.59 13.61
100.62 0.602
15.09 15.20
16.59 16.74
Complex components syrup
D
13.46 13.60
101.38 0.373
14.96 15.17
16.46 16.73
E
13.46 13.61
101.31 0.367
14.96 15.14
16.46 16.74
Complex components tablets F
13.62 13.52
99.40 0.550
15.12 15.00
16.62 16.58
G
13.39 13.61
101.01 0.669
14.89 14.96
16.39 16.54
(각각 0.45, 0.50, 0.55 μg/ml)을 가지고 분석법 전 조작을 각 농 도 3회씩 반복 측정한 결과 평균 회수율 99.8%, 표준편차 0.877%
의 결과를 나타내었다(Table IV). 정밀성은 정밀성 시험용액을 가지고 분석법의 전 조작을 6회 반복 측정한 결과로부터 구한 상 Table III − Precision of HPLC analytical condition for ambroxol hydrochloride
Concentration
(µg/ml) Number of
measurement
Actual concentration
(µg/ml) Average Standard
deviation
Relative standard deviation
15.00
1 15.09
15.00 0.102 0.68
2 15.04
3 15.04
4 14.88
5 15.09
6 14.87
Fig. 6 − Specificity of HPLC analytical condition for clenbuterol hydrochloride syrup. (a) Chromatogram and (b) PDA scan of clenbuterol hydrochloride standard solution (0.5µg/ml).
Fig. 7 − Calibration curve of HPLC assay for clenbuterol hydrochloride syrup.
Table IV − Accuracy of HPLC analytical condition for clenbuterol hydrochloride syrup
Dosage form Item Actual conc. (µg/ml) Tested conc. (µg/ml) Recovery (%) Standard deviation
Single component syrup C
0.451 0.448
099.97 0.892
0.501 0.502
0.552 0.554
Complex components syrup D
0.435 0.435
100.18 0.653
0.486 0.486
0.536 0.540
E
0.446 0.442
099.24 0.839
0.497 0.492
0.547 0.545
대표준편차는 0.77%의 결과를 나타내었고(Table V), 정량한계는 반응의 표준편차와 검량선의 기울기에 근거하는 방법에 따라 측 정하였을 때 정량한계는 0.021 μg/ml로 나타났다.
클렌부테롤염산염 정 − 함량 분석법의 밸리데이션 결과 포토다 이오드어레이(PDA)를 이용하여 주성분 피크의 단일성 여부를 확
인하였다(Fig. 8). 클렌부테롤염산염은 0.4~1.2 μg/ml의 범위에 서 결정계수(R2) 0.999 이상을 나타내어 양호한 직선성을 나타 내었다(Fig. 9). 클렌부테롤염산염은 정확성 시험용액 I, II, III(각 각 0.90, 1.00, 1.10 μg/ml)을 가지고 분석법 전 조작을 각 농도 3회씩 반복 측정한 결과 평균 회수율 100.0%, 표준편차 0.893%
Fig. 8 − Specificity of HPLC analytical for clenbuterol hydrochloride tablets. (a) Chromatogram and (b) PDA scan of clenbuterol hydrochloride standard solution (1.0µg/ml).
Fig. 9 − Calibration curve of HPLC assay for clenbuterol hydrochloride tablets.
Table VI − Accuracy of HPLC analytical condition for clenbuterol hydrochloride tablets
Dosage form Item Actual conc. (µg/ml) Tested conc. (µg/ml) Recovery (%) Standard deviation
Complex components tablets F
0.879 0.882
100.36 0.735
0.980 0.987
1.080 1.081
G
0.877 0.883
099.7 0.933
0.978 0.975
1.079 1.065
의 결과를 나타내었다(Table VI). 정밀성은 정밀성 시험용액을 가지고 분석법의 전 조작을 6회 반복 측정한 결과로부터 구한 상 대표준편차는 0.92%의 결과를 나타내었고(Table VII), 정량한계 는 반응의 표준편차와 검량선의 기울기에 근거하는 방법에 따라 측정하였을 때 정량한계는 0.073 μg/ml로 나타났다.
유통품목 함량시험 결과 및 기존 시험법과 비교
암브록솔염산염 시럽·정 − 새로 설정된 전처리법 및 분석법 을 가지고 시험약 A, B, D, E, F, G을 대상으로 Fig. 3(a) 방법 으로 암브록솔염산염 함량시험 한 결과를 Table VIII에 나타내 었다. 주성분의 표시량에 대한 함량 백분율은 각각 101.7%, 101.3%, 101.7%, 98.7%, 99.5%, 99.6%로 각 제형 별 설정된 기준규격에 적합하였다. 또한 기존 KPC 시험법의 시험결과와 비교하여 t검정을 통한 유의성 검정을 한 결과 두 시험법간의 결과의 차이가 없음과 동 분석법을 적용하기에 타당함을 확인 하였다.
클렌부테롤염산염 시럽·정 − 새로 설정된 전처리법 및 분석 법을 가지고 시험약 C, D, E, F, G을 대상으로 Fig. 3(b) 방법 으로 클렌부테롤염산염 함량시험 한 결과를 Table IX에 나타내 었다. 주성분의 표시량에 대한 함량 백분율은 각각 99.7%, 93.6%, 97.9%, 95.1%, 94.8%로 각 제형 별 설정된 기준규격에 적합함에 따라 동 분석법을 적용하기에 타당함을 확인하였다.
동일 검체를 가지고 기존 시험법으로 반복 시험한 결과 내 편 차가 커 새로운 시험법과 기존 시험법간 유의성 검정이 불가하 였다.
결론 및 고찰
암브록솔염산염과 클렌부테롤염산염 성분 함유 제제의 함량시 험 조건 개선을 위해 "의약품등 시험방법 밸리데이션 가이드라 인"에 따라 각 제형(단일성분 및 복합성분 시럽제, 정제)에 적용 할 시험법에대한 밸리데이션을 수행하였다.2,14)분석하고자 하는 성분의 분리 및 정량에 최적화된 기기분석 조건을 찾아내어 상 대적으로 적은 양의 희석용매로 실험 할 수 있게 됨에 따라 기 존 시험법에서 추출을 위해 소모되는 유기용매와 산의 양을 현 저히 감소시켰다. 이는 실험법 개선을 통해 환경과 실험실내 유 해한 요소를 경감하는 효과를 가져온 것으로 판단된다. 또한 추 출법을 희석법으로 변경한 새로운 시험법은 시간과 비용이 개선 되었고, 특이성, 직선성, 정확성, 정밀성, 정량한계를 확인하고 국 내유통 의약품 중에서 시험약을 선정하여 기존 시험법과 비교분 석 후 확립된 시험법 및 규격을 적용해 보았다. 이는 신속하고 재현성 있는 시험법의 설정으로 의약품의 품질관리 수준을 향상 시킬 수 있으며, 본 연구에서 제안하는 시험규격은 식품의약품 안전처고시 「대한민국약전외 의약품 기준」 개정 시 기초자료로 Table VII − Precision of HPLC analytical condition for clenbuterol hydrochloride tablets
Concentration
(µg/ml) Number of
measurement
Actual concentration
(µg/ml) Average Standard
deviation
Relative standard deviation
1.00
1 0.99
1.00 0.009 0.92
2 1.00
3 1.01
4 1.00
5 1.00
6 1.00
Table VIII − Results of ambroxol hydrochloride contents assay for commercially available samples
Item A B D E F G
Dosage form Single component Syrup Complex components Syrup Complex components Tablets
Specification 93.0∼107.0% 90.0∼110.0% 90.0~110.0%
Contents (%)a) 101.7 101.3 101.7 98.7 099.5 99.6
Contents (%)b) 099.5 100.4 101.8 99.8 101.0 96.3
* Contentsa):new developed method, Contentsb): KPC method.
Table IX − Results of clenbuterol hydrochloride contents assay for commercially available samples
Item C D E F G
Dosage form Single component Syrup Complex components Syrup Complex components Tablets
Specification 90.0∼110.0% 90.0∼110.0% 90.0∼110.0%
Contents (%) 99.7 93.6 97.9 95.1 94.8
1) 식품의약품안전처 고시 : 대한민국약전외 의약품 기준 (2013).
2) 대한민국약전 10개정 : 의약품등 시험방법 밸리데이션 가이드라 인 (2013).
3) Hasegawa, I., Niisato, N., Iwasaki, Y. and Marunaka, Y. : Ambroxol-induced modification of ion transport in human airway Calu-3 epithelia. Biochem. Biophys. Res. Commun. 343, 475 (2006).
4) Yamada, T., Takemura, Y., Niisato, N., Mitsuyama, E., Iwasaki, Y. and Marunaka, Y. : Action of N-acylated ambroxol derivatives on secretion of chloride ions in human airway epithelia. Biochem. Biophys. Res. Commun. 380, 586 (2009).
5) Lee, H. J., Joung, S. K., Kim, Y. G., Yoo, J.-Y. and Han, S. B. : Bioequivalence assessment of ambroxol tablet after a single oral dose administration to healthy male volunteers. Pharmacol.
Res. 49, 93 (2004).
6) Cho, Y., Jang, Y. Y., Han, E. S. and Lee, C. S. : The inhibitory effect of ambroxol on hypochlorous acid-induced tissue damage and respiratory burst of phagocytic cells. Eur. J.
Pharmacol. 383, 83 (1999).
7) Martin, P., Soubrie, P. and Simon, P. : Does a single priming injection of clenbuterol alter behavioral response to β- adrenoceptor agonists and antagonists in mice through a time- dependent process. Eur. J. Pharmacol. 115, 91 (1985).
8) Kazanietz, M. G., Gutkind, J. S. and Enero, M. A. : Interaction between β2- and α2-adrenoceptor responses in the vascular system: effect of clenbuterol. Eur. J. Pharmacol. 130, 119 (1986).
9) Re, G., Badino, P., Girardi, C. and Carlo, F. D. : Effects of a β2- agonist (clenbuterol) on cultured human (CG-5) breast cancer cells. Pharmacol. Res. 26, 377 (1992).
10) Yamashita, J., Nagase, H., York, D. A. and Bray, G. A. : Effects of clenbuterol, a β2-Adrenoceptor agonist, on Macronutrient selection in rats. Physiology & Behavior 56, 251 (1994).
11) Fabre, J., Bousquet, J., Lebel, B., Jirou-Najou, J. L., Cluzel, M., Godard, P. and Michel, F. B. : Anti-allergic activity of an oral beta-2 agonist, clenbuterol. J. Allergy Clin. Immunol. 81, 311
Industry-Extended release oral dosage forms : Development, evaluations and application of in vitro/in vivo correlation (1997).
17) United States Pharmacopoeial Convention, Inc. : The United States Pharmacopeia 35th (2009).
18) Society of Japanese Pharmacopoeia : The Japanese Pharmacopoeia 16th (2011).
19) 식품의약품안전처 고시 : 의약품동등성시험기준 (2013).
20) 대한민국약전 10개정 : 일반시험법 (2013).
21) Rote, A. R. and Kande, S. K. : Development of HPTLC method for determination of cefpodoxime proxetil and ambroxol hydrochloride in human plasma by liquid-liquid extraction.
Pharm. Methods 2, 242 (2011).
22) Dharuman, J., Vasudhevan, M. and Ajithlal, T. : High performance liquid chromatographic method for the determination of cetirizine and ambroxol in human plasma and urine—A boxcar approach. J. Chromatogr. B 879, 2624 (2011).
23) Shaikh, K. A., Patil, S. D. and Devkhile, A. B. : Development and validation of a reversed-phase HPLC method for simultaneous estimation of ambroxol hydrochloride and azithromycin in tablet dosage form. J. Pharm. Biomed. Anal.
48, 1481 (2008).
24) Hadad, G. M., El-Gindy, A. and Mahmoud, W. M. M. : HPLC and chemometrics-assisted UV-spectroscopy methods for the simultaneous determination of ambroxol and doxycycline in capsule. Spectrochim. Acta, Part A 70, 655 (2008).
25) Bazylak, G. and Nagels, L. J. : Simultaneous high-throughput determination of clenbuterol, ambroxol and bromhexine in pharmaceutical formulations by HPLC with potentiometric detection. J. Pharm. Biomed. Anal. 32, 887 (2003).
26) Abdel-Ghani, N. T. and Hussein, S. H. : Determination of ambroxol hydrochloride in pure solutions and some of its pharmaceutical preparations under batch and FIA conditions. Il Farmaco 58, 581 (2003).
27) Trejo, F. M., León, S. V., Medina, A. E. and Tolentino, R. G. : Application of high-performance liquid chromatography–UV detection to quantification of clenbuterol in bovine liver
samples. JFDA 21, 414 (2013).
28) Furusawa, N. : An isocratic solvent-free mobile phase HPLC- PDA analysis of clenbuterol and ractopamine. Int. J. Chem.
Anal. Sci. 4, 169 (2013).
29) Liu, B., Yan, H., Qiao, F. and Geng, Y. : Determination of
clenbuterol in porcine tissues using solid-phase extraction combined with ultrasound-assisted dispersive liquid-liquid microextraction and HPLC–UV detection. J. Chromatogr. B 879, 90 (2011).
