Pharmacological Properties of the Four-year Unripe Ginseng Berry and the Enhancing Effect on Learning and Memory in Aβ42-induced Alzheimer Mouse Model

DOI 10.17480/psk.2020.64.2.109

4년근 미성숙 인삼열매 분획물의 약리학적 특성 및 치매 마우스 모델에서 인지능 개선효과

안정원*^,†·장수길****^,†·김현수*·조보람*·성은아*·김승태*·최은경**·

김윤배**·박희용***·주성수*^,****^,#

*강릉원주대학교 생물의약신소재연구실, **충북대학교 독성학연구실,

***중앙대학교 약학대학, ****노벨젠메드 중앙연구소

Pharmacological Properties of the Four-year Unripe Ginseng Berry and the Enhancing Effect on Learning and Memory in A β42-induced

Alzheimer Mouse Model

Jeong Won Ahn*^,†, Su Kil Jang****^,†, Hyun Soo Kim*, Boram Jo*, Eun Ah Sung*, Seung Tae Kim*, Ehn-Kyoung Choi**, Yun-Bae Kim**, Hee Yong Park***, and Seong Soo Joo*^,****^,#

*College of Life Science, Gangneung-Wonju National University

**College of Veterinary Medicine, Chungbuk National University

***College of Pharmacy, Chung-Ang University

****Novelgenmed R&D Center

(Received January 19, 2020; Revised February 26, 2020; Accepted March 2, 2020)

Abstract In the present study, we aimed to determine whether the processed 4-year ginseng berry extract (SGF) had pharmacological properties with improving learning and memory in an Aβ42-induced Alzheimer’s mouse model. Passive avoidance test (PAT) and Morris water-maze test (MWMT) were performed after the administration with SGF, and assays (acetylcholine, ACh and Aβ) in the brain lysates were followed along with the glial fibrillary acidic protein (GFAP) detection for the brain damage. Acetylcholinesterase (AChE) activity and the gene expression (choline acetyltransferase (ChAT), vesicular acetylcholine transporter (VAChT) and brain-derived neurotrophic factor (BDNF)) in N2a cells was further analyzed using Ellman’s and qPCR assays, respectively. Results demonstrated that SGF contained a high amount of 3 active ginsenosides (Rg3, Rg5 and F4) and significantly improved PAT and MWMT compared to Aβ42-induced mouse model. Interestingly, AChE activity in the brain lysates was significantly reduced, whereas ACh amounts was escalated in SGF groups. In addition, ChAT, VAChT and BDNF mRNAs were significantly upregulated in the presence of a single Rg3, Rg5 and F4 as well as SGF. Taken together, these findings clearly suggest that SGF can participate in alleviating AD pathogenesis by preventing the brain damage and increasing ACh production which are primitive requirements for a therapeutic candidate of Alzheimer’s disease.

Keywords ginseng berry, passive avoidance test, Morris water-maze test, acetylcholine, choline acetyltransferase, ginsenoside

서 론(Introduction)

퇴행성 뇌질환은 노화와 함께 발생하는 퇴행성 질환 중 뇌에 서 발생하는 질환을 의미하며, 과학의 눈부신 발달에도 불구하

고 발병의 원인과 근치 개념의 치료법이 극히 제한적인 현대의 학의 도전영역으로 간주되고 있다.

다양한 퇴행성 뇌 질환 중 가장 대표되는 질환은 혈관성 치매, 알츠하이머, 파킨슨병, 루이 체 치매 및 전측두엽 치매 등이며, 이들 모두는 노인성 질환으 로 분류된다. 특히, 알츠하이머와 루이체 치매는 전체 치매환자 의 90%를 차지할 정도로 질병의 중요성이 인정되나 많은 연구 개발에도 불구하고, 행동, 인지, 및 기억력 개선을 돕는 수준의 약물만이 가능한 실정이다.

최근 다수의 대형 제약사들이 역점 을 두고 진행한 β-amyloid 항체나 억제제 등의 임상이 모두 실 패로 돌아가면서, 알츠하이머 치매의 β-amyloid 가설이 힘을 잃 어가는 동안 cholinergic 가설이 힘을 받고 있다.

현재 임상시

†

These authors contributed equally to this work.

#

Corresponding author

Seong Soo Joo, Ph.D., Department of Marine Molecular Bioscience, College of Life Science, Gangneung-Wonju National University, Gangneung, Gangwon 25457, Korea

Tel.: +82-33-640-2856, Fax: +82-33-640-2340

E-mail: [email protected]

험이 진행중인 개발 약물들은 질환의 병태생리에 기반하여 수 행되고 있는데, 대표적으로는 신경전달물질에 대한 조절, 타우 또는 아밀로이드 단백질을 대상으로 한 약제 개발, 세포 내 신 호 전달 체계에 대한 조절, 산화 스트레스 경감, 미토콘드리아 및 세포 칼슘 대사 등을 타겟으로 하는 다양한 제제들이 연구 중에 있다.

전 세계적으로 약 100여 종의 알츠하이머 치매 치 료제 개발이 활발하게 수행되고 있으며, 국내에서도 천연물의약 품, 합성의약품, 줄기세포 치료제와 펩타이드 의약품 등이 연구 개발 중에 있으나 뚜렷한 성과는 미진한 상태이다.

많은 반론 들이 존재하고 있으나, 일반적으로 알츠하이머 치매는 뇌 신경 세포 밖에 베타 아밀로이드(Aβ)가 침착된 amyloid plaque와 신 경세포 내에 hyperphosphorylated tau 단백질 축적을 병리적 특 징으로 하는데, 이들이 원인이 되어 결국 인지·기억능 저하 및 뇌신경 세포(neurons) 사멸을 초래하는 것으로 알려져 있다.

따 라서 국내외 연구개발은 주로 아밀로이드 가설, 신경전달물질(콜 린성) 가설 및 타우 증식 가설 등을 배경으로 한 임상연구(53.5%) 에 집중되고 있다.

본 연구진은 선행연구를 통해 인삼의 약리 활성 성분인 진세 노사이드 중 Rg3가 마우스 뇌소교세포주(BV-2)에서 Aβ42로 매 개된 뇌신경세포독성을 억제하고 뇌소교세포의 활성을 유도하 여 아밀로이드 단백질을 효과적으로 제거함을 제시하였고, Re 및 Rd가 뇌신경 세포에서 콜린성 마커 발현 및 신경세포 분화 를 촉진함을 확인하였다.

인삼에 존재하는 사포닌 배당체인 진세노사이드는 천연 스테로이드로서 트리터펜 사포닌(triterpene saponin) 의 일종이고, 대부분이 C3 및 C-20 위치에 포도당, 아라 비노오스, 자일로스 및 람노오스 등이 결합한 4환계 담마란 골 격(dammarane skeleton)의 구조적 특징을 가지고 있다.

‘Rx’ 로 표기하는 진세노사이드의 ‘R’은 ‘Radix 또는 Root’을 의미하며

‘x’는 컬럼 크로마토그래피에 의한 극성 순서에 따라 아래에서 위의 알파벳순으로 명명하고 있다.

최근 연구에 따르면 고온 (120

C) 증기로 인삼을 찌는 경우 Rg3, Rg5 및 Rk1이 수십 배 증가하여 암과 같은 특정 질환에 유용한 후보 물질로 보고되고 있다. 특히, Re 전환체로서 가열 후 증가되는 진세노사이드 F4 는 인삼의 뿌리, 줄기 및 잎보다 열매부분에서 상대적으로 높게 존재하여, 높은 항산화 활성 및 항암 활성을 나타내는 것으로 보고되었다.

본 연구에서는 4년근 인삼 열매 가공과정에서 증가된 Rg3, Rg5 및 F4가 다량 함유된 분획물이 뇌 신경 보호 및 인지·기억능 개선에 유효함을 확인하고 나아가 퇴행성뇌질 환 천연물신소재 후보 물질로 가능성을 제시하고자 하였다.

실험방법(Experimental Methods)

연구재료 및 시료 준비

본 연구의 시료인 미성숙 인삼 열매는 경기도 연천군 인삼재 배지에서 3년근 및 4년근 인삼으로부터 수확하여 세척, 건조 및 증포(4증 4포, 7증 7포)된 원료를 시작 물질로 사용하였으며, 인 삼 열매 원료의 표준화를 위해 6월 초 과육 내 씨앗이 여물기

전 초록색을 띤 단단한 열매만을 채취하였다.

3년근 인삼 열 매는 원료 수급의 대체 여부를 확인하기위해 4년근 인삼 열매 와 동일한 조건으로 추출과정을 수행하여 대조 물질로 사용하 였다. 시험 원료 확보를 위해 각각에 대해 인삼 열매를 4증포 인삼 열매와 7증포 인삼 열매를 동량으로 혼합한 뒤 30배수 용 량의 정제수를 첨가하여 24시간 95

C 열수 추출한 후 남은 잔 여물에 10배수의 65% 발효 주정을 가하여 상온에서 24시간 추 가 추출을 2회 반복하였다. 이상으로부터 확보한 2종의 추출물 을 혼합한 후 생체친화성 균주인 Lactobacillus plantarum (기탁번 호: KCTC 21084)을 발효 균주로 사용하였다. 발효과정은 혼합 추출물을 3 brix로 희석하고 L. plantarum을 접종(1×10

CFU/mL) 한 후 30

C 배양기에서 72시간 발효를 수행하여 발효 건조 시 료를 얻어 시험 물질(SGF)을 확보하였다. 본 연구에서 수행된 추출 및 발효 과정은 50종 이상의 ginsenoside가 극성과 비극성 의 화합물로 존재하는 인삼의 특징으로 열수 추출과 용매 추출 을 함께 진행하여 높은 함량의 ginsenoside가 함유되도록 하였다.

특정 ginsenoside 분리 동정은 SGF에 포함된 극성 잔여물을 제 거하기 위한 전처리 과정으로 solid phase extraction (SPE)을 수 행하였다. SPE는 Starata C18-E (1 g/6 mL, Phenomenex, CA, USA)를 사용하여 국가기술표준원(인삼 및 인삼 제품제품-진세 노사이드 함량 측정-고속액체크로마토그래피법, 표준 번호 KS H 2153)를 참조하여 수행하였으며, 사전 세척(메탄올 5 mL, 물 20 mL), 시료 주입(100 mg/5 mL), 사후 세척(물 20 mL, 30% 메 탄올 15 mL), 용출(메탄올 10 mL)의 과정으로 SGF를 획득하였 다(Fig. 1). 시험동물모델에 사용한 대조 물질은 식품의약품안전 처로부터 인지기능 개선효과가 인정된 카테킨(catechins) 성분인 epigallocatechine gallate (EGCG) 를 사용하였으며, 이는 다양한 연 구에서도 인지능 및 기억력 개선에 효능이 입증된 성분이다.

치매 유발용 Aβ의 aggregation은 monomer 상태의 amyloid β peptide (Aβ42, Abcam, Cambridge, UK)를 phosphate-buffered saline (PBS)에 1 mg/mL의 농도로 용해한 후 37

C에서 7일간 aging 을 유도하여 세포 독성과 in vivo 치매유발 시험에 사용하였다.

총 폴리페놀 및 사포닌 함량 측정

총 폴리페놀 함량 비교는 산화-환원 반응을 통해 청색으로 발

색하는 원리를 이용하는 Folin-Ciocalteu법을 응용 수정하여 측

정하였다. 즉, 0.2 mL 튜브에 측정 시료 10 mg/mL를 10 μL씩 분

주한 후 3DW를 160 μL씩 첨가하고, Folin-Ciocalteu’s phenol

reagent (Sigma-Aldrich, MO, USA) 를 10 μL 추가하여 5분간 암

실에서 반응을 실시하였다. 최종 반응물에 20% Na

CO

를 각

well 에 첨가하여 20분간 암실 반응 후 96 well plate에서 765 nm

의 흡광도로 측정하였다. 측정 시료내 폴리페놀 정량을 위해 갈

산(GA, gallic acid)을 500 μg/mL로부터 62.5 μg/mL까지 1/2씩 희

석하여 검량선을 작성한 후 측정 시료내 총 폴리페놀 함량을

mg GAE (GA equivalent)/g (dry extract wt.) 로 나타내었다. 또한

측정 시료에 함유된 총 사포닌 함량 측정은 적자색 반응을 나

타내는 vanillin-sulfuric acid 분석법을 적용하였다. 즉, 8% 바닐

린과 72% 황산 용액을 6:84의 비율로 혼합하여 아이스 위에 두 어 차갑게 유지시킨 후, 측정 시료(10 mg/mL)를 10 μL씩 0.2 mL 튜브에 분주하고 미리 조제한 바닐린-황산 용액을 90 μL씩 튜브 에 담아 55

C에서 20분간 반응하였다. 반응 종료 후 5분간 반 응물을 아이스 위에 두어 식힌 다음 96-well plate에 옮겨 545 nm 에서 흡광도를 측정하였고, 총 사포닌 함량의 정량을 위한 검 량선을 작성하기 위해 ginsenoside Re (GR)를 500 μg/mL로부터 62.5 μg/mL까지 1/2 희석하여 검량선을 작성한 후 측정 시료내 총 사포닌 함량을 mg GRE (GR equivalent)/g (dry extract wt.) 로 제시하였다.

항산화효과

항산화효과는 라디칼 소거능 및 금속이온촉매 산화억제능을 통해 분석하였다. 라디칼 소거능분석을 위해 사용된 1,1-Diphenyl- 2-picrylhydrazyl (DPPH) 은 화학적으로 안정화된 수용성 free radical 로서 517 nm에서 특징적인 광흡수를 나타내는 보라색 화합물이 다. 이 라디칼은 알코올 등의 유기용매에서 매우 안정하며, 항 산화활성이 있는 물질과 만나면 전자를 내어주면서 라디칼(DPPH) 이 소멸되어 최초 용액의 보라색에서 노란색으로 색깔이 변화 하여 산화 활성을 육안으로도 쉽게 관찰할 수 있는 대표적인 항 산화 활성실험법이다. 라디칼은 0.3 mM DPPH를 함유한 methanol 용액을 제조하여 1-100 μg/mL 시험 물질을 혼합한 후 실온에서 10분간 반응 후 517 nm에서 흡광도를 측정한 뒤 실험 물질 간 라디칼 소거능을 비교 분석하였다. 또한, 강력한 활성산소종인 hydroxyl radical 에 의한 단백질 분해 억제 효능 분석을 위해 금 속이온촉매 산화억제 분석법을 적용하였다. BSA (bovine serum albumin, Sigma-Aldrich) 분해는 활성산소종(reactive oxygen spe- cies)에 의한 손상으로부터 단백질이나 효소를 보호하는 항산화 물질의 효과를 금속이온촉매반응을 이용해 확인하는 방법이다.

Target protein 으로서 BSA를 0.5 μg/mL 농도가 되도록 하고, 1차 반응으로서 Cu

(100 μM)와 H

O

(2.5 mM) 를 첨가하여 hydroxyl radical 을 생성하고 BSA와 각 농도 별 시험 물질(10, 50, 100 μg/

mL) 을 함께 혼합 후 2차 반응을 수행하였다. 반응 종료된 각 그 룹은 10% sodium dedoxyl sulfate (SDS)-polyacrylamide gel에 전기영동하여 추출물 시료에 의한 BSA 단백질 분해 저해 수준 을 분석하였다. 양성대조군으로서 항산화 효과가 우수한 아스코 르브산(ascorbic acid, 50 μM)을 사용하였다.

High performance liquid chromatography (HPLC) 및 pre- parative HPLC

진세노사이드 함량 분석은 선행연구에서 표준화한 방법을 부 분 수정하여 수행하였다.

즉, 시험 물질에 함유되어 있는 진세

노사이드 분석을 위해 고성능액체크로마토그래피(HPLC)를 사용 하였다. 본 연구에서 유효 물질로 선정한 Rg3 (S-/R-form), Rg5, F4 및 기타 보조 분석용 진세노사이드 Rg1, Re, Rb1, Rc, Rd, Rk1은 Biopurity (Cheungdu, China)로부터 구입하여 사용하였으 며, 정량·정성 분석을 위해 각 표준 물질을 125-2000 μg/mL의 농도 범위에서 표준검량선을 작성하여 적용하였다. HPLC 분석 은 Ultimate 3000 HPLC System (Thermo Scientific, RO, USA) 과 YMC-Triart C18 Column (250×4.6 mm, S-5 μm, 12 nm, YMC, Tokyo, Japan)을 사용하여 column 온도를 30

C로 설정하 여 측정하였고, DAD3000 검출기를 이용하여 203 nm 파장에서 검출하였다. 각 시료는 3DW로 10 mg/mL의 농도로 용해한 후 0.22 μm PTFE 주사여과기(Hyundai Micro, Seoul, Korea)로 여과 하고 10 μL씩 주입하여 분석하였다. 3DW (A)와 acetonitrile (B) (HPLC grade, Thermo Fisher Scientific) 을 이동상으로 하여 유속 은 1.6 mL/min으로 하였다. 이동상의 조건은 국가기술표준원(인 삼 및 인삼제품-진세노사이드 함량 측정-고성능액체크로마토그 래피법, 표준 번호 KS H 2153)에 명시된 조건으로, 80% A로 시작하여 0-10 min (80% A, 20% B), 10-40 min (80-68% A, 20-32% B), 40-55 min (68-50% A, 32-50% B), 55-70 min (50- 35% A, 50-65% B), 70-72 min (35-10% A, 65-90% B), 72-82 min (10% A, 90% B), 82-84 min (10-80% A, 90-20% B), 84- 90 min (80% A, 20% B)을 사용하였다.

A β42로 유도된 치매 마우스 모델

실험 동물은 체중 25 g 내외의 6주 령 수컷 마우스(ICR, C57BL/

6J, DBL. Co., Ltd., Chungbuk, Korea) 를 구입하여 1주간 순화 과 정을 거친 후 사용하였다. 실험 동물은 무작위로 분리시키고 고 형 사료와 물을 자유롭게 섭취하도록 하였고 실험 기간 동안 공 기가 조절된 semi-SPF실에서 23±2

C 의 온도와 상대습도 55±10%, 환기 횟수 12회/시간, 조명 주기 12시간, 조도 150-300 Lux로 조 절되었다. 본 실험은 충북대학교 실험동물연구지원센터의 동물 실험윤리 위원회(Institutional Animal Care and Use Committee, IACUC) 의 승인(CBNUR-1287-19)하에 동 기관의 표준 작업 지침 서(Standard Operation Procedures, SOP)에 따라 수행되었다.

치매 유발 및 시험 물질 투여를 위해 7주 령의 마우스(n=8/

group) 에 SGF를 6주간 매일 경구로 투여하였으며(Table 2), 투여 용량은 Sprague-Dawley 랫드를 이용한 인삼열매 추출물 단회 경 구투여 독성시험결과 최대 2 g/kg 투여량에서 시험 물질 투여로 인한 유해한 영향이 관찰되지 않고(㈜켐온 비임상연구소, 시험 번호: 17-RA-0298N), 사전 연구에서 약물 이상반응이 없이 효 능 비교가 가능한 SGF100, 300 또는 500 mg/kg을 각각 투여하 였다(Table 2). 비교 물질로는 EGCG (100 mg/kg)를 투여하였다.

Table 1. Composition of the control and treatment groups

Group Test substance

Vehicle 450 μL PBS + 10 μL ATCh + 10 μL DTNB + 30 μL brain homogenate (5%)

SGF 400 μL PBS + 50 μL SGF + 10 μL ATCh + 10 μL DTNB + 30 μL brain homogenate (5%)

시험 물질 마지막 투여 일에 동물을 에테르로 흡입 마취시킨 후 Stereotaxic Frame (Stoelting, IL, USA) 에 고정하고, Aβ42 (5 μL, 5 mg/mL/head) 로 뇌실 내(AP: 0.6, ML: 1.1, DV: 2.0 mm)로 투 여하여 치매를 유발하였으며, 실험 전 기간 동안 체중을 측정하 여 약물에 대한 이상 징후를 관찰하였다.

인지기능(학습/기억력) 측정

인지기능 결핍 유도를 위해 Aβ42 투여 48시간 후 2시간 간 격으로 6회의 수동 회피 반응 시험(passive avoidance test, PAT) 을, 6일간 매일 1회씩 수중미로시험(Morris water-maze test, MWMT) 을 실시하여 학습 및 기억력을 평가하였다.

PAT 실험 은 어두운 방과 밝은 방으로 나누어진 수동 회피 상자의 밝은 방에 동물을 위치시키고 동물이 어두운 방으로 이동하면 1 mA 로 2초간 전기 충격을 가했다. 이후 같은 시험에서 어두운 방의 전기 충격으로 인한 기억을 확인하기 위해 밝은 방에서 동물이 체류하는 시간을 측정하여 기억력을 평가하였다. 또한, MWMT 은 원형의 수조에 물을 채워 22±2

C로 유지하면서 수면을 스티 로폼으로 채워 수면 아래의 피신용 플랫폼(platform)을 가리고 연속적인 실험을 진행하였다. 실험 동물이 수조 주변의 표지물 을 기억하여 수조 내 일정한 장소에 위치한 플랫폼을 찾아갈 때 까지 소요되는 시간을 측정하고, 180초 간 플랫폼을 찾지 못할 경우 동물을 플랫폼에 30초 간 머물게 하여 기억을 유도하였다.

Acetylcholinesterase (AChE) 억제능 평가

AChE의 활성도는 Ellman’s assay에 따라 측정하였다. 즉, 7주 령 수컷 ICR 마우스(Daehan Bio Link, Chungbuk, Korea)를 에 테르 흡입 마취 하에 멸균 생리식염수(10 mL)로 심장 관류하여 안락사 시킨 후 뇌 조직을 적출하였다. 적출한 뇌 조직에 차가 운 100 mM PBS를 가하고 조직 파쇄기(Polytron PT-MR 2100, Lot. 528787, Luzern, Switzerland) 를 사용하여 5% 균질 액을 제 조하였다. Acetylthiocholine iodide (Sigma-Aldrich)와 5,5'-dithio- bis-(2-nitrobenzoic acid)(Sigma-Aldrich)를 각각 PBS와 에탄올에 녹여 최종 0.5 mM 농도로 맞추었다. 시험 물질 SGF는 최고 농 도(100 μg/mL)로부터 단계별 희석하여 최종 1 μg/mL로 준비하 였다. 용매 대조군(vehicle)은 시험 물질 대신 PBS를 첨가하여

측정하였다. Table 1과 같이 큐벳에 용매 vehicle 군 및 SGF군 을 설정하고, 총 용량에 맞춰 흡광도 412 nm 조건에서 1분 간 격으로 총 5분간 측정하였다.

뇌조직 내 ACh 농도 측정

마지막 행동 검사 24시간 후 부검하여 cold saline으로 뇌를 충 분히 관류하여 뇌조직을 적출한 후 액체 질소에 동결시켜 −80

C 에 보관하였다. 적출한 뇌조직의 중량을 측정한 후, 10배 부피 의 cold PBS를 넣고 homogenizer를 이용하여 균질화한 균질액을 Amplex Red acetylcholine/acetylcholinesterase assay kit (Invitrogen, CA, USA)를 이용하여 분석하였다.

뇌 손상 분석

부검 시 cold saline으로 뇌를 충분히 관류하여 뇌조직을 적출 하고 4% formaldehyde 용액에 고정시켜 동결 조직 슬라이드를 제작하였다. 기억을 담당하는 hippocampal CA1 구역에서의 성 상세포(astrocytes)의 골격단백질인 glial fibrillary acidic proteins (GFAP) 에 대한 면역형광염색으로 뇌 손상에 따른 성상세포수의 반응을 관찰하였다. 관찰 슬라이드를 anti-GFAP (Abcam) 1차 항 체에 이어, Alexa Fluor-488이 결합된 2차 항체(Moelcular Probes, OR, USA) 로 면역염색하고, 세포핵을 4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 로 염색한 후 성상세포의 GFAP를 확인하였다.

세포배양

마우스 대식세포주 Raw264.7 및 신경세포주 Neuro-2a (N2a) 는 10% 우 태아 혈청을 포함한 Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM, Hyclone, UT, USA)을 사용하여 37

C, 5%

CO

로 조정된 CO

배양기에서 배양하였다. 세포가 90% 증식이 되었을 때 실험에 사용하였으며, 20 passage가 넘지 않도록 조 절하였다. 배양된 세포는 0.25% trypsin-EDTA로 부유 시킨 후 혈구계산기로 세포 수를 산정하였다. 세포독성 시험은 배양된 세포를 96 well plate에 1.0×10

cells/well이 되도록 하였고 유전 자 발현 관련 시험은 6 well plate 또는 60 mm culture dish에 1.5×10

cells/well 및 5×10

cells/dish 이 되도록 분주하여 2시간 선 배양 후 본 실험에 사용하였다.

세포 활성 측정

세포 내 미토콘드리아 전자전달계에 존재하는 탈수소 효소 (dehydrogenase) 가 tetrazolium salts를 분해하여 formazan이라는 발 색 물질을 생성하는 원리를 활용한 Cell Counting Kit-8 (CCK- 8, Dojindo, Kumamoto, Japan)를 사용하였다. 즉, 측정 대상 세 포주(1.0×10

cells/96well) 에 SGF (1-100 μg/mL)를 처치 후 37

C, 5% CO

incubator 에서 24시간 동안 배양하였으며 양성대조군으 로 H

O

를 이용하여 상대적인 분석을 수행하였다. 반응 종료 후 세포 활성 분석을 위해 각 well에 10 μL CCK 용액을 각 well에 넣고 2시간 동안 37

C 배양기에서 배양한 후, Microplate Reader (SpectraMax plus 384, Molecular Devices, CA, USA) 를 이용하 Table 2. Test groups for the efficacy evaluation of SGF and

EGCG in A β-induced Alzheimer mouse model

Group Treatment No. of animals*

Normal Purified water 6 A β

alone Purified water 6

+SGF 100 100 mg/kg 6

+SGF 300 300 mg/kg 6

+SGF 500 500 mg/kg 6

+EGCG 100 EGCG 100 mg/kg 6

*Animals were checked the satisfaction of the protocol and performed

a per-protocol analysis.

여 450 nm에서 측정된 흡광도 상대 수치를 대조군(무처치군) 대 비 세포 활성 수준을 비교하였다.

일산화질소(NO) 측정

NO 생성은 NO의 대사물인 아질산염(nitrite)의 양을 측정하는 Griess 시약(Sigma-Aldrich)을 이용하였다. NO측정은 96 well plate 에 Raw264.7 세포를 분주하고 SGF (1, 10, 100 μg/mL) 선 처리 2 시간 후에 지질다당류(LPS, 1 μg/mL)을 처리하여 24시간 배양 하였다. 반응이 종료된 배양액과 동량의 Griess 시약을 섞고 10 분간 반응 후 30분 내 분광광도계(spectrophotometer)로 540 nm 에서 흡광도를 측정하였다. 이때 아질산소듐(sodium nitrite, Promega) 을 100 μM로부터 1.5 μM까지 1/2 단계적 희석하여 검 량선을 구해 정량 하였다.

Quantitative real time polymerase chain reaction (qPCR) 분석

유전자 발현 분석은 Trizol Reagent (Life Technologies, CA, USA) 를 이용하여 세포 및 조직으로부터 총 RNA를 추출하였다.

즉, Trizol 용액 1 mL를 첨가하여 세포를 용해시키고 실온에서 5 분 동안 방치 후 클로로포름 200 μL를 첨가하여 13500 rpm에 서 15분 동안 원심분리 하였다. 투명한 상층액(500 μL)을 취하 여 새로운 튜브로 옮기고 동량의 이소프로필 알코올을 첨가한 후 13500 rpm에서 10분 동안 원심분리 하여 RNA를 침강시켰다.

RNA 침전물을 diethyl pyrocarbonate (DEPC, Sigma-Aldrich) 처 리한 증류수로 희석한 70% 에탄올 0.75 mL로 세척한 후 공기 중에서 건조해 역전사 샘플(reverse transcription sample)로 사용 하였다. 1차 가닥(first strand) cDNA 합성은 추출된 총 RNA 1 μg 을 사용하여 수행되었고, TOPscript Reverse Transcription system (Enzynomics, Daejeon, Korea)과 oligo dT primer를 사용하여 역 전사 반응을 수행하였다. qPCR 분석은 Rotor-Gene 6000 (Qiagen, CA, USA)을 사용하였으며, Table 3의 primer를 이용하여 iNOS, ChAT, BDNF, VAChT 유전자의 발현을 정량적으로 측정하였고 housekeeping gene인 β-actin에 정상화(normalization) 시킨 상대

수치를 비교 분석하였다.

통계처리

결과 분석은 GraphPad Prism 5.01 software (GraphPad, CA, USA)를 이용하여 통계 처리하였다. 결과는 각 군별 mean±SD로 나타냈고 각 실험 군간 비교는 일원 분산분석(one-way ANOVA) 으로 분석한 후 Duncan’s multiple range tests로 p<0.05 수준에 서 검증하였다.

결과 및 고찰(Results and Discussion)

HPLC 분석, 총 페놀화합물, 총 사포닌 함량 및 항산화 효과 상업적으로 사용되는 인삼은 일반적으로 6년근 인삼을 선호 하나 인삼 본연의 특성은 4년근부터 나타난다. 보통 인삼 뿌리 의 상품성을 높이기 위해 인삼 열매를 제거하는 것이 일반적인 기술이었으나 최근 인삼 열매에 높은 함량의 ginsenoside가 함유 되어 있음이 보고되면서 다양한 연구가 수행되고 있다. 본 연구 에서는 보다 많은 ginsenoside를 함유하고 있는 것으로 알려진 익지 않은(green berry) 4년근과 3년근 인삼 열매를 비교하여 산 업성이 높은 연차의 인삼 열매를 선정하고자 하였다. 본 논문에 제시된 분석 법에 따라 3년근 인삼 열매(3YGB)와 4년근 인삼 열매(4YGB) 추출 후 최종 수율을 측정한 결과 각각 33.1% 및 32.3%로 나타났다(Fig. 1). 반면, 3YGB와 4YGB에 함유된 주요 활성 진세노사이드 함량은 Table 4와 같이 분석되어 4YGB가 3YGB에 비해 높은 ginsenoside를 포함하는 것으로 확인하였으 며, SGF (4YGB)는 Fig. 2에 제시된 바와 같이 각 ginsenosides 성분이 고루 분포하였다. 각 추출물의 총페놀성 화합물 함량은 3YGB 및 4YGB에서 각각 7.8, 10.5 mg GAE/g으로 분석되었고, 총 사포닌 함량은 각각 605.4 및 1001.4 mg GRE/g으로 4YGB 내 함유된 진세노사이드의 절대량이 3YGB보다 많은 것으로 분 석되어 수율 대비 약리적 유용성은 4YGB가 보다 우수할 것으 로 판단되었다(Fig. 3A & 3B). 폴리페놀은 식물에서 발견되는 화합물의 일종으로 분자당 페놀 그룹이 1개 이상 포함된 것을 Table 3. Primer sequences used for real-time qPCR

Species Gene Primer Sequences Product size (bp) Accession No.

Mouse

iNOS 5' Primer 5'- TGCCCCTGGAAGTTTCTCTT

252 NM_010927.4 3' Primer 5'- ACTGCCCCAGTTTTTGATCC

ChAT 5' Primer 5'- CCTGCCAGTCAACTCTAGCC

222 NM_009891.2 3' Primer 5'- GGAAGCCGGTATGATGAGAA

VAChT 5' Primer 5'- TTGATCGCATGAGCTACGAC

246 NM_021712.3 3' Primer 5'- CCACTAGGCTTCCAAAGCTG

BDNF 5' Primer 5'- ATGCTCAGCAGTCAAGTGCC

178 NM_001316310.1 3' Primer 5'- TTTTATCTGCCGCTGTGACC

b-actin 5' Primer 5'-TACAGCTTCACCACCACAGC

187 NM_007393

3' Primer 5'-AAGGAAGGCTGGAAAAGAGC

특징으로 하며, 많은 연구논문에서 항산화, 항암, 항당뇨, 인지 능, 신경학적 개선 및 현대인들의 성인병을 제어할 수 있는 미

래의 기능성소재로 대표되고 있다.

3YGB 및 4YGB의 라디 칼 소거능(DPPH IC

)은 각각 383.7 및 174.6 μg/mL로 4YGB가 3YGB에 비해 약 2배 높은 항산화 효과를 확인하였다(Fig. 3C

& 3D). 특히, 보다 강력한 항산화능을 측정하는 금속촉매이온 산화 억제 효능분석에서 4YGB가 10 μg/mL의 저용량에서도 양 성대조군에 필적하는 수준으로 단백질을 보호하는 것으로 확인 되어 3YGB보다 우수한 생리활성을 가지는 것으로 판단되었다 (Fig. 3E). 이상과 같은 결과에서, 주요 진세노사이드 함량, 총 페놀화합물 및 사포닌 함량 및 항산화능을 고려할 때 효능 물 질로서 4YGB가 유효할 것으로 판단되어 동물 모델 및 추가 연 구에 동일한 4YGB를 사용하였다. 추가로, Rg3 (S-form, R-form), Rg5 및 F4의 생리활성을 분석하기 위해 최종 시험 물질인 SGF 로부터 각 진세노사이드를 SGF로부터 직접 분리 동정하였다.

즉 preparative HPLC System (YMC LC Forte/R, YMC, Tokyo, Japan)과 YMC-Triart C18 Column (250×20.0 mm, S-5 μm, 12 nm, YMC)을 사용하여 분석용 HPLC와 동일한 조건으 로 분리 동정을 수행하였으며, 각각의 진세노사이드는 평균 순 도 98% 이상으로 확인되었다(Fig. 4).

SGF 추출 및 진세노사이드 함량 비교

최종 확보된 시험 물질 SGF에 함유된 진세노사이드는 HPLC 를 통해 정량 및 정성분석을 수행한 결과, 열수 추출의 진세노 사이드 함량 93.18 mg/g 및 열수 추출 후 65% 주정 추출 진세 노사이드 함량 215.86 mg/g이 존재함을 확인하였다(Table 5). 특 Fig. 1. Schematic representation of the preparation of SGF from

3YGB and 4YGB. The final SGF was obtained after the processes of SPE from the mixture of the water and 65% ethanol extraction.

Table 4. Profiles of 4 major ginsenosides

Year F4 Rg3(S) Rg3(R) Rg5 Total

3YGB 30.36±2.30 10.60±1.62 5.54±0.33 5.94±0.44 52.44±0.09 4YGB 34.69±2.67 13.85±0.81 6.47±0.18 8.69±1.05 63.70±2.73

Fig. 2. HPLC chromatogram of ginsenosides contained in SGF. Data represents 10 major ginsenosides from SGF.

히 Rg3, Rg5 및 F4는 SGF내 10종의 주요 진세노사이드 중 56.5% 이상을 함유하여 높은 함량의 유효 활성 물질을 함유하 는 것으로 확인되었다. 이와 같은 결과는 다양한 극성도에 따라 물 추출과 에탄올 추출에 용이하게 추출되는 진세노사이드의 특 징 때문인 것으로 사료되었으며,

전체적으로는 물35%가 포함 된 에탄올 65%의 주정 추출물에서 보다 높게 분석되어 단일 추 출에 비해 열수 추출 후 65% 에탄올 추출 과정이 보다 유용한 것으로 판단된다. 본 연구에 사용된 SGF는 F4, Rg3 (S-form 69%, R-form 31%), Rg5 상대비율로서 F4:Rg3:Rg5=5.6:3.2:1.2 를 함유한 물질이다.

기억 및 인지기능 개선 효능

뇌의 콜린성 신경(cholinergic neuron)에서 분비되는 신경전달 물질인 ACh은 콜린아세틸 트랜스퍼라제(ChAT) 효소에 의해 생 산되고 신경말단에서 분비되며, 최종적으로는 AChE에 의해 분 해되어 양적 조절을 가능하게 해 주므로, AChE의 활성 억제를 통해 ACh 증가를 유도할 수 있어 치매환자의 기억과 학습력을 증진시켜 줄 수 있다.

따라서, AChE 활성 억제는 뇌내 적절 한 ACh 농도를 유지시켜 주어 학습 능력, 기억력 감퇴 및 인지

능 저하를 개선할 수 있으며, 이러한 기전을 바탕으로 미국 FDA 에서 AChE 억제제로서 donepezil, tacrine, galantamine, rivastig- mine 등 4종의 약을 승인하여 현재 많은 환자들에게 처방이 이 루어지고 있다.

Fig. 5에 나타난 바와 같이 뇌 균질액에 SGF 를 처치하여 수행한 AChE 억제 활성은 25, 50 및 100 μg/mL에 서 각각 16, 21 및 24%의 효소 억제 활성이 나타나, 50 μg/mL 이상의 농도에서 유의한 효소 활성 억제효과를 나타내는 것으 로 확인되었으며, 일정 농도 수준의 SGF 투여 시 AChE 활성 억제를 통한 인지·기억능 개선에 기여할 것으로 사료되었다.

Aβ42를 이용한 치매 모델 유도 및 시험 물질 경구 투여 기

간 중 유의할 만한 체중 변화는 관찰되지 않았으며, 부검 시 주

요 장기의 중량 및 장기에 대해 육안적 평가에서도 시험 물질

단독 또는 시험 물질에 이은 Aβ 복합투여군에서 유의할 만한

이상소견은 관찰되지 않았다(data not shown). 학습 및 기억 능

력 평가를 위해 치매 유발 48시간 후 20분 간격으로 6회 실시

한 PAT에서는 왕복 상자(shuttle box)에서 어두운 방의 전기 자

극을 기억해 일정 시간(180초) 이상 밝은 방에 오래 머무는 동

물을 기억력이 형성된 것으로 평가하였다.

시험 결과 용매

(vehicle) 만을 투여한 정상 동물은 횟수가 반복될 때마다 밝은 방

Fig. 3. Analysis of biological properties between 3YGB and 4YGB. (A) total phenolic compounds, (B) total saponins, (C-D) DPPH radical

scavenging activity, (E) hydroxyl radical scavenging activity. Significantly different from 3YGB or control (**p<0.01, ***p<0.001).

에 머무르는 시간이 점차 늘어나 5회차에는 180초 이상 머물러 완전하게 기억력이 형성됨을 보여주었다. 반면, Aβ42로 인지 기 능 저하를 유발한 치매 유발 군은 6회차까지 학습에 의한 기억 형성이 저조하였으나, SGF 투여군에서는 Aβ42로 인한 학습 및 기억 기능 저하를 용량의존적으로 회복시켰다(Fig. 6A).

공간지각능력 평가는 치매 유발 48시간 후 MWMT를 이용해 매일 반복적인 수영으로 hidden platform에 안착할 때까지의 시 간이 단축되는 현상으로 인지기능 향상을 평가하였다.

시험 결 과, 용매(vehicle)만을 투여한 정상 동물은 횟수가 반복될 때마다 platform 을 찾아가는 시간이 급격히 단축되어 4일째에는 30초 이 Fig. 4. HPLC chromatogram. (A) preparative HPLC analysis of SGF, (B) HPLC overlay of each ginsenoside of isolated F4 (black), Rg3 (S- from and R-from, blue) and Rg5 (pink) a preparative HPLC.

Table 5. Relative concentration of ginsenosides in SGF

Extraction Rg1 Re Rb1 Rc Rd F4 Rg3(S) Rg3(R) Rk1 Rg5 Total

Water 0.27 3.10 15.83 3.54 16.33 25.69 10.21 4.97 6.42 6.82 93.18

Ethanol 0.69 5.30 45.69 8.45 35.24 61.58 24.32 10.23 11.95 12.41 215.86

Sub-total 0.96 8.4 61.52 11.99 51.57 87.27 34.53 15.2 18.37 19.23 309.04

내에 도달하여 우수한 기억력을 보여주었으나, Aβ42 단독 투여 치매유발군에서는 6일째까지 공간지각 능력이 회복되지 않았다.

이에 비해, SGF 투여군에서는 Aβ42 투여로 인한 인지능 저하 를 용량의존적으로 회복시켰을 뿐 아니라, SGF 최고 농도에서 비교 물질인 EGCG (100 mg/kg)와 유사한 수준의 효능을 나타 내 SGF가 단일 물질에 필적한 만한 효능이 있음이 입증되었다 (Fig. 6B). 알츠하이머병은 Aβ와 tau 단백질이 세포내 외에 축적 되어 진행성 인지·기억능 쇠퇴를 수반하는 신경퇴행성 뇌질환 으로서 보다 정교한 알츠하이머 치매 개선 효능을 평가하기 위 해 Aβ peptides의 뇌내 축적과 인지능 결핍 마우스 모델이 요구

된다.

본 연구에서는 Rg3, Rg5 및 F4를 주요 활성 물질로

포함하는 SGF 투여에 따른 치매유발동물의 인지·기억능 시험 결과를 분석한 결과 SGF 투여가 Aβ42로 유발되는 기억 및 인 Fig. 5. Effect of SGF on the brain acetylcholinestrase (AChE)

activity. Significantly different from vehicle (*p<0.05).

Fig. 6. Effects of SGF or EGCG on amyloid β peptide (Aβ)- challenged mice. (A) passive avoidance performances, (B) Morris water-maze performances. ○: Vehicle ●: Aβ alone, ∇: Aβ+100 mg/kg SGF, □: Aβ+300 mg/kg SGF, ◇: Aβ+500 mg/kg SGF, △:

A β+100 mg/kg EGCG. *Significantly different from normal, p<0.05.

#

Significantly different from A β42 alone, p<0.05.

Fig. 7. Effects of SGF on the brain lysates from A β42-challenged mice. (A) acetylcholine concentration, (B) Western blot analysis of the brain A β proteins, (C) ELISA analysis of the brain Aβ proteins.

*Significantly different from Sham, p<0.05.

Significantly different

from A β42 alone, p<0.05.

지기능 쇠퇴를 개선하는 것으로 판단되며, 이는 AChE 활성 억 제 시험에서 확인된 바와 같이 SGF를 투여 받은 군의 뇌에서 ACh 수준이 증가하여 총괄적인 개선 효과가 나타나는 것으로 생각되었다.

뇌조직 내 ACh 회복 및 Aβ 발현 조절 효능

임상적으로 아세틸콜린 분해 효소 억제는 뇌 안에 머무르는 아세틸콜린의 농도를 상승시켜 기억력 및 인지 기능을 개선시 켜주는 것으로 보고되고 있어 FDA에서도 최초로 알츠하이머병 치료제로 승인을 받았다.

본 연구에서는 인지기능 검사 종료

후 치매 유발 마우스 뇌를 적출하여 ACh의 농도를 측정한 결

과 Aβ42 단독투여 치매유발군에서는 5.80 μM로 정상군(11.53

μM)에 비해 신경전달물질인 ACh이 낮아져 있음이 확인되었다

(Fig. 7A). 이에 반해, SGF 사전 투여군에서는 100, 300 및 500

mg/kg 에서 각각 7.65, 8.45 및 13.38 μM 용량의존적으로 ACh 농

도가 회복되었을 뿐 아니라, 500 mg/kg의 고용량에서는 정상수

준으로 회복되었다. 이와 같은 결과는 SGF가 Aβ42 세포독성으

로 인한 ACh 결핍을 회복시켜 인지기능을 복구해 주는 것으로

판단되며, 이는 PAT 및 MWMT 시험과 일치하는 결과로 판단

되었다. 알츠하이머 치매의 특징적인 병리 소견은 Aβ 단백질과

Fig. 8. Effects of SGF or epigallocatechin gallate (EGCG) on the activation of astrocytes expressing brain glial fibrillary acidic protein

(GFAP) in amyloid β peptide (Aβ)-challenged mice

신경원섬유매듭(neurofibrillary tangle)이며, 일반적으로는 Aβ 단 백질의 축적이 선행하는 것으로 알려졌다.

따라서, Aβ 단백질 의 뇌 내 농도의 조절은 질병 진행에 주요한 인자로 인식되며, 알츠하이머병의 진행을 멈추거나 지연시키기 위해서는 병의 초 기 단계에 Aβ 단백질 생성을 조절할 필요성이 대두되고 있다.

SGF 및 Aβ42 투여 후 실험동물을 희생하여 뇌조직 내 Aβ 단 백질 함량을 ELISA와 Western blot으로 정량 및 정성 분석한 결 과 Aβ 단독 투여 치매유발군에서 Aβ 양이 증가한 반면, SGF 를 사전에 투여한 군에서는 100 mg/kg에서는 유의한 변화가 나 타나지 않았다. 반면, 300 및 500 mg/kg에서는 용량에 따라 Aβ 함량이 감소하였고, 500 mg/kg에서는 정상군 이하로 감소하여 매우 효과적인 조절능을 발휘한 것으로 사료되었다(Fig. 7B).

ELISA 분석을 통한 정량적 분석에서도 정상(Sham)군에 비해 Aβ 단독 투여 치매유발군에서 Aβ 농도가 약 43% 증가한 반면, SGF 를 사전에 투여한 군에서는 용량의존적으로 Aβ 농도가 감소하 였고, 특히 500 mg/kg에서는 정상수준으로 감소하였다(Fig. 7C).

이와 같은 결과는 SGF가 뇌조직 내 Aβ의 축적을 완화함으로써 뇌 보호 효능을 나타냈기 때문인 것으로 판단된다.

뇌 손상 방어 효능

뇌 내에 존재하는 해마의 CA3 및 CA1은 대뇌변연계의 양 쪽 측두엽에 존재하는 해마 내 부위로 학습과 기억을 담당하고 있

기 때문에 뇌조직의 손상 여부를 확인하는 분석에 적용되고 있

다.

본 연구에서는 치매 유발 마우스로부터 적출된 뇌조직

에서 기억을 담당하는 hippocampal CA3 구역의 astrocytes 활성 화에 따른 GFAP 발현을 면역 형광염색으로 확인한 후, 뇌 손 상이 유도된 성상세포(astrocyte)의 세포 수를 계수하여 뇌조직의 손상 정도를 평가하였다. GFAP은 뇌의 astrocytes가 사멸하거나 심하게 손상을 받은 결과 세포 외로 분비되어 뇌 손상을 받은 환자로부터 확인할 수 있는 biomarker로 잘 알려진 산성 단백질 이다.

특히, CA3 구역 뇌세포의 감소가 알츠하이머 환자에게 서 나타나는 기억 장애와 관련성이 높은 것을 알려져 본 연구 에서는 hippocampal CA3 구역의 astrocytes 활성화에 따른 GFAP 발현을 면역 형광 염색으로 확인하였다. 그 결과, Aβ42 단독 투 여 치매유발군에서는 GFAP-positive astrocytes가 평균 412개로 정상군(87개)의 4.7배로 증가하였다(Fig. 8). 이에 비해, SGF 사 전 투여군에서는 용량의존적으로 astrocytes의 수가 감소하여, 500 mg/kg에서는 정상수준 가까이 줄어들었다. 한편, EGCG (100 mg/kg) 투여군에서는 정상군 수준으로 감소했다. 이와 같은 결 과는 SGF와 EGCG가 Aβ42에 의한 뇌 손상을 효과적으로 차단 하기 때문인 것으로 생각된다.

In vitro 활성 효능

본 연구에서 사용된 세포주에 대한 SGF 시험 물질 및 SGF

Fig. 9. In vitro physiological activities in Raw264.7. (A-B) NO and iNOS gene expression in the presence of SGF, (C-D) NO and iNOS gene

expression in the presence of Rg3, Rg5 or F4. *Significantly different from control (***p<0.001).

Significantly different from LPS alone

(

p<0.01,

p<0.001).

로부터 분리 동정한 Rg3, Rg5, F4 각각에 대한 세포 활성 시험 을 수행하여 IC

을 측정하였다. SGF가 처리된 대식세포 Raw264.7 및 신경세포 N2a의 IC

은 각각 39.9±0.62 및 32.3±1.04 μg/mL 로 확인되었으며, 유효활성물질 Rg3, Rg5 및 F4 단일 물질의 IC

은 Raw264.7세포에서 각각 35.0±0.47, 23.5±0.63, 30.9±0.36 μg/mL, N2a 세포에서 각각 41.4±5.11, 22.5±1.15, 18.7±1.79 μg/

mL 로 측정되었다. 각 시험 물질의 생리활성은 일산화질소(NO) 와 일산화질소 합성 효소(iNOS) 유전자 발현 분석을 통해 확인 하였다. Fig. 9A 및 9B에 나타난 바와 같이 NO 생성 및 iNOS 유전자 발현 수준은 SGF 처리 시 Raw264.7 세포에서 농도의존 적으로 감소하였다. ED

은 각각 30.5±0.10 및 23.8±0.68 μg/mL 로 나타났으며, 단일 유효활성물질 Rg3, Rg5, F4에서는 Rg3와

Rg5에서 유효한 결과를 나타내 SGF내 함유된 위 3종의 진세노 사이드가 약리학적 특징 나타내는 주요 물질로 사료되었다(Fig.

9C & 9D).

인지기능 및 뇌 보호 유전자 발현 효능

ACh 는 말초 및 중추신경계에서 신경전달물질로서 학습 및 기 억 유지에 매우 중요한 역할을 하며, 콜린성 세포 내에서 ChAT 효소에 의해 acetyl-CoA와 choline으로부터 합성된 후 VAChT 수 송 단백질을 통해 신경세포 말단에서 분비되어 신경전달물질로 서 활동을 한다.

최종적으로는 신경세포의 탈분극 후 세포 외로 분비된 ACh는 시냅스의 수용체에 결합하여 신호전달을 유 도하거나 AChE에 의해 신속히 acetate와 choline으로 가수분해 Fig. 10. Facilitation of ChAT, VAChT and BDNF gene expression in N2a cells by SGF and active ginsenosides (Rg3, Rg5 and F4) contained in SGF. Results are expressed as means±standard deviations from three separate experiments (*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 vs.

control).

되어 재순환된다.

따라서, ChAT 발현 증가는 직접적인 ACh 양 조절을 통해 인지능 개선에 직간접적인 영향을 줄 수 있을 것으로 예상되며, 알츠하이머 치매 치료 요법의 한 부류로 포함 될 수 있다.

아울러 뇌 보호 및 신경영양인자로 잘 알려진 BDNF (Brain- Derived Neurotrophic Factor) 는 중추신경계에서 시냅스전달과 시 냅스 가소성(synapse plasticity)의 분자 기전에 필수적인 것으로 알려졌으며, 알츠하이머 치매와 혈중 BDNF가 감소가 상호 밀 접한 관계에 있는 것으로 보고되었다.

시험 물질 SGF 및 활 성 물질 Rg3, Rg5, F4를 신경세포 N2a에 각각 처리 후 ChAT, VAChT 및 BDNF 유전자 발현 수준을 분석한 결과 SGF 농도 가 증가할수록 ACh 합성관련 유전자 발현이 유의하게 증가하 였다(Fig. 10A-C). 또한 SGF에서 분리한 Rg3, Rg5 및 F4 단독 처리 시 ChAT는 3종 모두에서 유의하게 발현이 증가되었으며, VAChT 및 BDNF는 Rg3와 Rg5에서 유의한 수준으로 발현 증 가가 관찰되었다(Fig. 10D-F). 흥미롭게, BDNF는 Rg5 처리군에 서 높은 수준의 유전자 발현이 유도되어 Rg5는 Rg3와 더불어 SGF 에 의한 뇌신경세포의 분화·증식 및 학습과 기억을 개선 의 주요 인자로 사료된다.

결 론(Conclusion)

알츠하이머 치매는 전체 치매의 대부분을 차지하는 주요한 질 환으로서 인간의 수명이 늘어날수록 사회·경제적 비용 증가와 삶의 질 향상을 위한 국가적 차원의 관리 강화가 뒤따르고 있 다. 이에 반해 알츠하이머 치매 치료제 개발은 답보상태에 있거 나 질환의 진행속도 및 증상 완화 수준의 연구개발에 집중되어 안전하고 효과적인 치료제 개발이 절실한 시점이다.

본 연구에서 사용한 인삼 열매 4증포:7증포 혼합 및 생체친 화형 균주인 L. plantarum을 이용한 발효는 사전연구결과 각각 의 단계에서 인지능개선의 주요 활성을 나타낼 것으로 사료되 는 Rg3가 급격히 증가하였을 뿐 아니라 4증포:7증포 혼합 시료 를 마우스에 투여 시 생체이용율이 높을 것으로 사료되어 본 연 구에 해당 기술을 적용하였다.

본 연구를 통해 Rg3, Rg5 및 F4가 다량 함유된 SGF (4YGB) 가 Aβ42로 유도된 치매 및 in vitro모델에서 AChE 활성 억제, 인지기능 개선, 뇌세포 보호, ACh 회복, Aβ42 발현 조절, 뇌 손 상 방어에 유효함을 확인하여 SGF의 항 치매 효능을 제시하고 자 하였다. 결과에서 언급한 바와 같이 3YGB와 4YGB 비교 시 추출 수율은 3YGB가 높으나 약리학적 특성은 4YGB에서 우수 하게 나타날 것으로 판단되어 4YGB가 최종 SGF로 선정되었다.

특히 SGF는 Rg3, Rg5 및 F4가 분석된 주요 진세노사이드 중 50% 이상을 함유하는 지표물질이자 활성 물질로 확인되었으며, 단일 지표성분으로는 F4를, 복수 지표성분으로는 Rg3와 Rg5가 추가로 포함될 수 있을 것으로 사료되었다. 또한, 치매동물모델 에서 수행된 PAT 및 MWMT 시험결과 우수한 기억 및 인지기 능 개선이 확인되어 항 치매 소재로서 활용가능성이 제시되었

을 뿐 아니라, AChE 활성 억제 및 치매동물모델의 뇌내 ACh 회복은 지속적인 SGF 투여가 치매로 인해 손상된 뇌 환경의 개 선을 유도한 것으로 생각된다. 특히 뇌 조직의 hippocampal CA3 구역의 뇌 손상 정도를 평가한 결과 SGF 처리군에서 정상수준 으로 정상화되어 뇌세포 정상화에도 관여하고 있음을 확인하였 다. SGF에 높은 농도로 함유된 Rg3, Rg5, F4를 각각 순수 분리 하여 in vitro 시험을 수행한 결과 ACh 합성 효소인 ChAT는 3 종 모두에서 유의한 증가가 관찰되었고, ACh 수송 단백질인 VAChT와 뇌 보호 및 신경영양인자인 BDNF는 Rg3와 Rg5에서 유의한 증가가 관찰되었다. 이와 같은 결과는 SGF내 활성성분 이 상호 보완적인 역할을 수행하여 인지기능 개선을 유도하는 것으로 생각되며, 나아가 알츠하이머 치매 환자에게 처방이 되 고 있는 의약품 군 중 하나인 시냅스 내 신경전달물질(ACh) 증 가 목적의 신소재 적용이 기대된다.

결론적으로, 본 연구에 사용된 SGF는 기억 및 인지기능을 개 선하는 천연물 신소재 후보 물질로서 임상적으로는 알츠하이머 치매의 개선 지표인 ACh의 증가, 뇌 손상 보호, AChE 활성 억 제 잠재성이 인정되며, 뇌신경세포의 활성 증가를 통한 ChAT, VAChT 및 BDNF 발현 증가는 중추신경계의 시냅스 전달과 시 냅스 가소성 및 세포의 분화·증식을 유도하여 지속적인 뇌내 환경 개선을 유도할 것으로 생각된다. 따라서, 답보상태에 있는 치매 치료제 시장을 고려할 때 SGF는 그 자체로서 알츠하이머 치료보조요법으로 개발이 가능할 것으로 사료되며 본 연구를 기 반으로 하는 천연물의약품 개발도 가능할 것으로 생각된다.

감사의 말씀(Acknowledgment)

본 연구는 중소벤처기업부와 한국산업기술진흥원의 “지역특화 산업육성(R&D, P0005101)” 사업의 지원을 받아 수행된 연구결과임.

Conflict of Interest

모든 저자는 이해 상충을 가지고 있지 않음을 선언한다.

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