Effects of Steaming Process on Liriopis Tuber to Antioxidant Activities and Hyperlipidemia Induced Rats.

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麥門冬의 蒸熟에 따른 항산화 효능 및 고지혈증 유발 흰쥐에 대한 효능 연구

구가람^1#, 이현인^1#, 김수지², 신미래², 이아름³, 박해진⁴, 노성수², 서영배^1*

1. 대전대학교 한의과대학 본초학교실, 2. 대구한의대학교 한의과대학 본초약리학교실 3. 호산대학교 뷰티디자인학과, 4.대구한의대학교 산학협력단 코스메디컬센터

Garam Ku

^1#

, Hyun-In Lee

^1#

, SuJi Kim

²

, Mi-Rae Shin

²

, AhReum Lee

³

Hae-Jin Park

⁴

, Seong-Soo Roh

²

, Young Bae Seo

^1*

1 : Department of Herbology, College of Korean Medicine, Daejeon University, Republic of Korea 2 : Department of Herbology, College of Korean Medicine, Daegu Haany University, Republic of Korea

3 : Department of beauty design, Hosan university, Republic of Korea

4 : Cosmedical Center, Academic Industry Cooperation, Daegu Haany University, Republic of Korea

ABSTRACT

Objectives : This study is aimed to compare the changes in Antioxidative capacity of Liriopis Tuber by steaming process and to compare the effects in hyperlipidemia induced rats fed high cholesterol diet between Simvastatin and Liriopis Tuber by steaming process.

Methods : The SD rats were divided into six groups: normal diet (Nor), high cholesterol diet (Veh), high cholesterol diet plus Simvastatin 5 ㎎/㎏ (Sim), high cholesterol diet plus LT0 extract 200 ㎎/㎏ (LT0), high cholesterol diet plus LT6 extract 200 ㎎/㎏ (LT6) and high cholesterol diet plus LT9 extract 200 ㎎/㎏ (LT9). We compared the total cholesterol (TC), triglyceride (TG), high density lipoprotein cholesterol (HDL), low density lipoprotein cholesterol (LDL) contents and reactive oxygen species (ROS) from each serums. Protein expression in liver tissues related to antioxidant and cholesterol was analyzed.

Results : The Antioxidant activity of Liriopis Tuber increased by steaming process. In vivo, TC, TG, LDL-c, atherogenic index (AI) and cardiac risk factor (CRF) decreased and HDL-c increased with increasing steaming frequency. aspartate aminotransferase (AST), alanine aminotransferase (ALT), creatinine, and blood urea nitrogen (BUN) decreased with increasing steaming frequency. ROS decreased only in LT9, and SOD, catalase and glutathione peroxidase (GPx) increased with increasing steaming frequency. phospho-AMP-activated protein kinase (p-AMPK) increased and sterol regulatory element-binding protein 2 (SREBP-2), Phospho-Acetyl-CoA Carboxylase (p-ACC) and HMG-CoA reductase (HMGCR) decreased with increasing steaming frequency. Liver staining showed a decrease in hepatic fat accumulation of LT9.

LT9 showed significant results in all experiments.

Conclusions : LT9 showed significance of anti-lipid effect and improved fatty liver of hyperlipemia induced rats fed on high cholesterol diet, In conclusion, LP9 can be effectively used for the treatment of hyperlipidemia.

1)

Key words : Liriopis Tuber, steaming process, antioxidant activity, hyperlipidemia, statin.

*Corresponding author : Young-Bae Seo, College of Korean Medicine, Daejeon University, 62 Daehak-ro, Dong-gu, Daejeon 34520, Republic of Korea.

·Tel : +82-42-280-2625 ·Fax : +82-42-280-2644 ·E-mail : [email protected]

#First author : Garam Ku, College of Korean Medicine, Daejeon University, 62 Daehak-ro, Dong-gu, Daejeon 34520, Republic of Korea.

·Tel : +82-42-280-2625 ·Fax : +82-42-280-2644 ·E-mail : [email protected]

Hyun-In Lee, College of Korean Medicine, Daejeon University, 62 Daehak-ro, Dong-gu, Daejeon 34520, Republic of Korea.

·Tel : +82-42-280-2625 ·Fax : +82-42-280-2644

·Received : 12 June 2018 ·Revised : 12 September 2018 ·Accepted : 25 September 2018

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Ⅰ. 서 론

麥門冬은 백합과 (Liliaceae)에 속하는 다년생 초본인 맥문 동 (Liriope platyphylla Wang et Tang) 또는 소엽맥문동 (Ophiopogon japonicus Ker-Gawl.)의 괴근이다¹⁾. 중국에 서는 소엽맥문동 O. japonicus Ker-Gawl.의 덩이뿌리를 기원 으로 한다²⁾. ≪神農本草經 ․ 上品≫에 “麥門冬味甘平主心腹結氣傷中傷飽胃絡脉絶羸痩短氣久服輕身不老不飢. 生川谷及堤阪.”로 처음 수록되어 있으며³⁾, 養陰潤肺, 淸心除煩, 益胃生津 등의 효능으로 滋陰降火湯, 增液湯, 麥門冬湯, 生脈散, 益胃湯 등에 사용되고 있다¹⁾. 麥門冬의 현대 연구로는 항염증 작용⁴⁾, 면역조절효과⁵⁾, 간 보호효과⁶⁾, 폐 손상 보호효과⁷⁾, 기관 지 과민반응의 억제효과⁸⁾, 항암효과⁹⁾ 및 기억력 증진 효과¹⁰⁾ 등이 보고된 바 있다. 현대에 이르러 서구화되어가는 생활습 관의 변화에 따라 당뇨병, 비만, 대사증후군, 이상지질혈증과 같은 질환이 계속 증가하고 있으며 이는 동맥경화로 인한 혈 전성 심혈관계 질환 및 뇌혈관계 질환과 직접적으로 연관되어 있다¹¹⁾. 이에 麥門冬의 당뇨와 콜레스테롤에 대한 효능 연구 또한 이루어지고 있으며, 혈당과 혈청 콜레스테롤 개선¹²⁾, 당뇨 쥐에 대한 항염증 효과¹³⁾, PI3-kinase pathway 조절을 통한 인슐린 감작 효과¹⁴⁾, 麥門冬 추출물의 농도가 증가함에 따라 콜레스테롤 감소 효과¹⁵⁾가 증가함을 보고한 바 있다.

麥門冬은 임상에서는 주로 生乾品을 사용하고 있으나, 麥門冬의 추출 방법에 따른 이화학적 변화의 연구에는 麥門冬의 열수추출 시 가열시간의 증가에 따라 환원당이 증가하며, 로 스팅 온도의 증가에 따라 고형분, 총당, 환원당, 조사포닌의 함량 및 麥門冬 열수 추출물의 항산화능 역시 유의적으로 증가 하는 것으로 나타났다¹⁶⁾. 또한 9蒸麥門冬이 인슐린 분비를 촉진시켜 당뇨를 유효하게 개선하였음이 보고되어있고¹⁷⁾, 9蒸麥門冬이 生乾麥門冬에 비해 polyphenol 함유량이 높았으며, 지방간 형성 억제에 큰 효과를 보였음을 보고하였다¹⁸⁾. 이는 열처리를 통해 麥門冬의 성분 변화로 약효가 증강되는 것으로 생각되며, 열처리를 하는 여러 炮製法 중 蒸法은 일정한 실험 조건을 유지하기가 좋아, 변수를 통제하기에 유리하여 麥門冬의 항산화능과 항지질 효과를 비교함에 유리할 것으로 생각되었다.

이상과 같이 麥門冬은 열처리에 의해 항산화능이 증가되고, 麥門冬과 9蒸麥門冬이 모두 유효한 콜레스테롤 조절 효과가 있어 蒸熟麥門冬이 고지혈증에 효과적일 것으로 생각되나, 蒸熟麥門冬에 관한 기존의 연구는 항당뇨 효과를 규명함에 치우쳐 있고, 蒸熟麥門冬과 대조군만을 비교했을 뿐 고지혈증 치료제로 널리 이용되고 있는 statin과 비교한 연구보고는 없는 실정이다.

이에 본 저자는 生乾 및 蒸熟 횟수를 달리하여 제조한 麥門冬으로 in vitro에서 항산화능을 비교하고, 양성대조군으로서 simvastatin과 비교하여 고지혈증을 유도한 흰 쥐에 투여하여 in vivo에서도 유의한 성적을 얻었기에 보고하는 바이다.

Ⅱ. 재료 및 방법

1. 실험 재료

2016년 충남 청양지역에서 생산된 麥門冬 (Liriopis Tuber,

LT)을 청양 원예농협협동조합에서 구입하여 대전대학교 본초 학교실에서 『대한약전』 규격에 부합되는 것만을 선별하여 시 료제조에 사용하였다.

2. 실험 동물

Sprague-Dawley (SD) 흰쥐 수컷 6 주령을 대한 바이오 (충북, 한국)에서 구입하였다. 온도 22 ± 2℃와 습도 55 ± 5%로 조절된 사육실에서 12 시간 명-암 주기 환경을 유지하고, 물과 고형 사료 (Samyang corporation, Seoul, Korea)를 충분히 공급하며 1 주간 적응시킨 후 실험에 사용하였다. 실 험은 동물관리 규정을 준수하였으며, 동물 실험 윤리위원회의 승인 (DHU2017-070)을 얻어 시행하였다.

3. 고콜레스테롤 식이 조성표

정상군은 실험식이로 일반사료를 공급하였고, 대조군과 실험 군은 콜레스테롤을 1.25% 함유한 고콜레스테롤식이 (D12336, Research Diets, Inc., NJ, USA)를 8 주간 공급하였다 (Table 1).

Ingredients g ㎉

Corn starch 275 1,100

Maltodextrin 10 150 600

Soya protein 130 520

Cellulose, BW200 90 0

Casein, 30 Mesh 75 300

Cocoa butter 75 675

Soyabean oil 50 450

Coconut oil, 76 35 315

Mineral mix S10001 35 0

Sucrose 30 120

Cholesterol, USP 12.5 0

Potassium citrate 10 0

Vitamin mix V10001 10 40

Sodium chloride 8 0

Calcium carbonate 5.5 0

Sodium cholic acid 5 0

DL methionine 2 8

Choline bitartrate 2 0

FD&C Blue Dye #1 0.1 0

Total 1,000.1 4,128

Table 1. The Ingredients of High Cholesterol Diet

4. 시약

본 실험에 사용된 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH), gallic acid, naringin, diethylene glycol, 2,2'-azinobis (3 ethybenzothiazoline-6-sulfonic acid, ABTS), potassium persulfate, phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)와 dithiothreitol (DTT)는 Sigma Aldrich Co., Ltd. (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다. Cholesterol reagent kit,

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aspartate aminotransferase (AST) reagents kit와 alanine aminotransferase (ALT) reagents kit는 Wako Pure Chemical Industries, Ltd. (Osaka, Japan)에서 구입 하고, blood urea nitrogen (BUN) assay kit는 Asan Pharm. Co., (Hwaseong, Korea)에서 구입하였고, creatinine assay kit는 Biosystems S.A. Ltd. (barcelona, Spain)에서 구입하였다. 2',7'‑dichlorofluorescein diacetate (DCF‑DA)는 Molecular Probes (Eugene, OR, USA)에서, Superoxide dismutase (SOD), catalase, glutathione peroxidase (GPx), sterol regulatory element-binding protein 2 (SREBP-2), HMG-CoA reductase(HMGCR), histone과 β-actin은 Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA)로부터 구입하 였다. Phospho-Acetyl-CoA Carboxylase (p-ACC), Acetyl-CoA Carboxylase (ACC), Phospho-AMP-activated protein kinase (p-AMPK), AMP- activated protein kinase (AMPK)는 Cell Signaling Technology Inc.

(Beverly, MA, USA)로부터 구입하였고, 2차 항체인 Rabbit lgG antibody, Mouse lgG antibody는 GeneTex, Inc.

(GeneTex, San Antonio, TX, USA)에서 구입하였다. Protease inhibitor mixtur와 Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)는 Wako Pure Chemical Industries, Ltd. (Osaka.

Japan)로부터 구입하였으며, nitrocellulose membranes는 Amersham GE Healthcare (Little. Chalfont, UK)에서, ECL Western Blotting Detection Reagents와 nitrocellulose membranes는 Amersham GE Healthcare에서 구입하였다.

BCA protein assay kit는 Thermo Scientific (Rockford, IL, USA)에서 구입하였다.

5. 실험 기기

본 실험에 사용된 기기는 무압식 스팀증숙기 (에이스기공, 화성, 한국), 밀폐제습식 건조기 (에이스기공, 화성, 한국), 열 탕추출기 (Daewoong, Korea), 전자체중계 (CAS, Korea), AE-6530 mPAGE (ATTO Corporation, Tokyo, Japan), Sensi-Q2000 Chemidoc (Lugen Sci Co., Ltd, Seoul, Korea), DWT-1800T (Daewoongbio, Hwaseong-si, Korea), vortex mixer, 동결건조기 (Labconco, Kansas, USA), Deep-freezer (Sanyo Co. Japan), tissue grinder (BioSpec Product, Oklahoma, USA), Infinite m200 pro 흡광도 측정기 (Tecan, Männedorf, Switzerland), Multiscan spectrum (Thermo Scientific, Rockford, IL. USA), Incapacitance Meter Tester 600 (IITC Life Science Inc. Woodland Hills, USA), BX-51 형광현미경 (Olympus, Tokyo, Japan), 냉장 초고속 원심분리기 (Labogene, Seoul, Korea) 등을 사용하였다.

6. 시료 제조

시료는 구입된 麥門冬을 去心하지 않고, 蒸熟과 건조과정을 1 회로 하여 9 회 반복하여 제조 하였다. 蒸熟은 온도 90℃에서 60 분간 수행하였고, 수분함량 15% 이하로 충분히 건조하였 으며 실험에는 건조한 것 (LT0), 6 회 蒸熟한 것 (LT6), 9 회 蒸熟한 것 (LT9)을 사용하였다. 시료들의 추출은 분쇄하여 약재

100g에 10 배수의 30% EtOH을 가한 뒤 100℃에서 2 시간 열수 추출 후 농축, 동결 건조하였다. LT0, LT6 와 LT9 추출 물의 수율은 각각 66.5%, 70.3%, 47.9%였다.

7. 고지혈 유발 및 약물 투여

정상군 외에 실험동물들은 1.25% 콜레스테롤이 함유된 사 료로 2 주간 사육하여 고지혈증을 유도하였다. 실험 기간 동안 자유 식이를 하였으며, 몸무게와 사료섭취량은 약물투여 6 주 동안 1 일 1 회 같은 시간에 측정 하였다. 매일 일정한 시각에 실험 약재를 증류수에 각 농도에 맞게 희석하여 사용하였다.

실험군은 각 군별로 난괴법에 의해 7 마리씩 6 군으로 나누었다.

① Nor : 정상군, 일반 식이를 섭취한 군

② Veh : 대조군, 콜레스테롤이 1.25% 함유된 사료를 섭취 한 군

③ Sim : 양성대조군, 콜레스테롤이 1.25% 함유된 사료를 섭취하고 simvastatin을 5 ㎎/㎏로 투여한 군

④ LT0 : 콜레스테롤이 1.25% 함유된 사료를 섭취하고 麥門冬生乾 추출물을 200 ㎎/㎏로 투여한 군

⑤ LT6 : 콜레스테롤이 1.25% 함유된 사료를 섭취하고 麥門冬 6蒸 추출물을 200 ㎎/㎏로 투여한 군

⑥ LT9 : 콜레스테롤이 1.25% 함유된 사료를 섭취하고 麥門冬 9蒸 추출물을 200 ㎎/㎏로 투여한 군

8. 체중, 식이섭취량 및 식이효율 측정

실험동물들의 체중과 식이섭취량은 1 일 1 회, 동일 시간, 동일 조건에서 측정하였다. 체중증가량, 평균 식이섭취량, 식 이효율은 아래의 식을 이용하여 산출하였다.

① 체중 증가량

= Final body weight (g) - Initial body weight (g)

② 식이섭취량

= {Total food intake (g)} / days

③ 식이효율

= (Body weight gain / food intake)×100 (%)

9. 항산화능 측정

(1) DPPH, ABTS radical 소거능 측정

DPPH법¹⁹⁾을 이용하여 추출한 시료의 DPPH free radical 소거능을 측정하였다. 각 시료를 농도별로 희석하여, 각 용액 100 ㎕와 0.2 mM DPPH 용액 100 ㎕를 혼합하여 암소 상태 에서 37℃에서 30 분간 반응시킨 후 517 ㎚에서 흡광도를 측정 하였다. 각 시료 추출물의 DPPH free radical 소거능은 시료를 첨가하지 않은 대조군의 흡광도를 1/2로 환원시키는데 필요한 시료의 농도인 IC₅₀ 값으로 나타내었다. 추출한 시료의 ABTS free radical 소거능의 측정²⁰⁾은 7 mM ABTS 용액과 2.4 mM potassium persulphate를 혼합하여 실온에 암소 상태로 16 시간 이상 방치하여 ABTS⁺을 형성시킨 후 100% ethanol로 희석하여 734 ㎚에서 흡광도 값이 0.70 (± 0.02)이 되게 하 였다. 시료 100 ㎕를 희석된 용액 900 ㎕에 가하여 1 분간

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반응시킨 후 흡광도를 측정하였다. 각 시료 추출물의 ABTS free radical 소거능은 시료를 첨가하지 않은 대조군의 흡광 도를 1/2로 환원시키는데 필요한 시료의 농도인 IC₅₀값으로 나타내었다.

(2) 총 polyphenol 과 총 flavonoid 함량 측정

Folin-Denis법²¹⁾을 이용하여 총 polyphenol의 함량을 측정 하였다. 10% Folin-Ciocalteau’s phenol reagent 500 ㎕에 각 시료 25 ㎕를 혼합하여 실온에서 5 분간 반응시킨 후 10%

sodium carbonate 500 ㎕를 추가하여 30℃ incubator에서 90 분 동안 반응시켰다. 그 후 725 ㎚에서 흡광도를 측정하 였다. 이때 총 polyphenol의 함량은 gallic acid로 작성한 표 준곡선으로부터 구하였다. Davis법을 변형한 방법²²⁾을 이용 하여 총 flavonoid의 함량을 측정하였다. Diethylene glycol 600 ㎕에 추출한 시료 300 ㎕를 잘 섞어준 후, 1 N NaOH 6 ㎕ 를 가하여 37℃ incubator에서 1 시간 동안 반응시켰다. 그 후 420 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 이때 총 flavonoid의 함량은 rutin으로 작성한 표준곡선으로부터 구하였다.

10. 혈청분석 및 간 조직 무게 측정

실험동물은 희생시키기 전 12 시간 동안 절식 후, 복대정맥 에서 채혈 하였다. 혈청을 얻기 위해 채혈된 혈액을 3,000 rpm으로 15 분간 원심분리 후 –80℃에 보관하여 분석에 사용 하였다. 간 조직은 적출 후, 생리식염수에 헹구고 물기를 제 거한 후 무게를 측정하였다. 산화적 스트레스 바이오마커인 ROS의 측정은 혈청과 25 mM DCF-DA를 혼합하여, 형광 광도계로 emission 파장 530 ㎚, excitation 파장 485 ㎚에서 0 분 부터 매 5 분씩 총 30 분간 측정해 산출 값을 계산하였다.

혈청내의 지질농도의 분석은 total cholesterol (TC)와 triglyceride (TG), high density lipoprotein cholesterol (HDL-c)은 cholesterol reagent kit로 enzymatic colorimetry 검사법을 이용하였고, Low density lipoprotein cholesterol (LDL-c)은 다음의 식을 이용하여 구하였다.

LDL  c  

TC  HDL  c  TG

측정된 TC, HDL-c로부터 동맥경화지수 (atherogenic index, AI)와 심혈관위험지수 (cardiac risk factor, CRF)를 Rosenfeld식에 따라 아래와 같이 계산하였다.

① 동맥경화지수 (AI) = HDL  c

TC  HDL  c

② 심혈관위험지수 (CRF) = HDL  c

TC

11. 조직 Western blotting

간 조직의 세포질을 얻기 위해 100 mM Tris-HCl (pH 7.4), 5 mM Tris–HCl (pH 7.5), 2 mM MgCl2, 15 mM CaCl2, 1.5 M sucrose, 0.1 M DTT와 protease inhibitor cocktail을 첨가한 buffer A를 넣고 tissue grinder로 분쇄

하였다. 여기에 10% NP‑40 용액을 첨가하여, ice 위에서 20 분 간 정치시켰다. 그 후 12,000 rpm으로 2 분간 원심분리 하여 세포질을 포함한 상층액을 분리하였다. 이후 핵을 얻기 위해 10% NP‑40이 더해진 buffer A에 2 번 헹군 후 100 ㎖의 buffer C (50 mM HEPES, 50 mM KCl, 0.3 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0.1 mM PMSF, 10% glycerol) 를 첨가해 재부유 시킨 뒤 10 분마다 vortex를 3 회 하였다.

그 후 4℃에서 12,000 rpm으로 10 분 동안 원심 분리를 시 행하여 핵을 포함한 상층액을 얻었고, –80℃에 각각 냉동 보관 하였다. 간 조직 세포질의 superoxide dismutase (SOD), catalase, glutathione peroxidase (GPx), SREBP-2, HMG- CoA reductase (HMGCR), Histone, β-actin, Phospho- Acetyl-CoA Carboxylase (p-ACC), Acetyl-CoA Carboxylase (ACC), Phospho-AMP-activated protein kinase (p-AMPK), AMP-activated protein kinase (AMPK)의 단백질 발현을 측정하기 위하여 10 ㎎의 단백질을 8~15% SDS-polyacrylamide gel을 이용하여 전기연동 후, acrylamide gel을 nitrocellulose membrane 으로 이동시켰다.

준비된 membrane에 각각의 1차 antibody를 처리하여 4℃

에서 overnight 시킨 후, PBS-T로 6 분 간격으로 5 회 세척 하였다. 이후, 각각 처리된 1차 항체에 사용되는 2차 항체 (PBS-T로 1:3000으로 희석해서 사용)로 상온에서 1 시간 동안 반응시킨 후, PBS-T로 6 분 간격으로 5 회 세척하였다.

그 후 enhanced chemiluminescence (ECL) 용액에 노출시 키고, Sensi-Q2000 Chemidoc에 감광시켜 단백질 발현을 확인하였으며, 해당 band는 ATTO Densitograph Software (ATTO Corporation, Tokyo, Japan)프로그램을 이용하여 정량하였다.

12. 광학현미경적 관찰

실험 종료 후 적출한 간 조직에 대한 조직 병리학적 관찰을 하기 위해 조직을 10% neutral buffered formalin에 24 시간 고정시켰다. 그 후 graded alcohol로 탈수시키고 파라핀으로 고정하여 block을 제작한 다음 microtome으로 4 ㎜ 두께의 조직절편을 제작하였다. 이에 hematoxylin & eosin (H&E) 염색과 Oil red O 염색을 시행하였으며, xylene clearing을 하고 permount로 처리한 후 광학현미경 위에서 관찰하였다.

13. 통계처리

실험결과는 SPSS program for windows version 22 (SPSS Inc., Chicago, USA)를 이용하여 분석하였다. 모든 측정 결과는 평균 ± 평균의 표준오차 (mean ± SEM)로 나 타내었으며, 실험군 간의 차이는 one-way ANOVA와 LSD 분석법을 사용하여 p＜ 0.05 인 경우에 통계적으로 유의성이 있는 것으로 판단하였다.

Ⅲ. 결 과

1. 항산화능의 평가

(5)

시료에서 항산화 지표인 DPPH, ABTS, polyphenol, flavonoid를 측정하였다. DPPH radical 소거능 측정 결과, 양성대조군으로 사용된 L-ascorbic acid의 IC₅₀ 값은 1.57

± 0.08 ㎍/㎖, LT0은 156.57 ± 0.39 ㎍/㎖, LT6은 66.31

± 0.49 ㎍/㎖, LT9는 25.92 ± 5.73 ㎍/㎖으로 나타났다 (Fig 1, A). ABTS radical 소거능 측정 결과, L-ascorbic acid의 IC50 값은 3.53 ± 0.16 ㎍/㎖, LT0는 289.27 ±

0.28 ㎍/㎖, LT6는 186.31 ± 0.12 ㎍/㎖, LT9는 157.22

± 4.86 ㎍/㎖으로 나타났다 (Fig 1, B). 총 polyphenol 함량 측정 결과, LT0는 1.56 ± 0.13 ㎎/g, LT6는 19.59 ± 0.12 ㎎/g, LT9는 23.20 ± 0.10 ㎎/g으로 나타났다 (Fig 1, C). 총 flavonoid 함량 측정 결과, LT0는 0.08 ± 0.01 ㎎/g, LT6는 12.13 ± 0.11 ㎎/g, LT9는 39.01 ± 0.06 ㎎/g으로 나타났다 (Fig 1, D).

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180

L-ascorbic acid LT0 LT6 LT9

DPPH radical scavenging activity IC50(㎍/㎖)

(A)

0 50 100 150 200 250 300 350

L-ascorbic acid LT0 LT6 LT9

ABTS radical scavenging activity IC50(㎍/㎖)

(B)

0 5 10 15 20 25

LT0 LT6 LT9

Total polyphenol contents (㎎/g)

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45

LT0 LT6 LT9

Total flavonoid contents (㎎/g)

(C) (D)

Fig 1. Evaluation of antioxidant efficacy of Liriopis Tuber.

LT0; Liriopis Tuber without steaming process, LT6; Liriopis Tuber with six times steaming process, LT9; Liriopis Tuber with nine times steaming process.

2. 체중변화, 식이섭취량 및 식이효율 분석

적응기간과 고지혈증의 유발기간을 제외하고 6 주 동안 체중변화, 식이섭취량 및 식이효율의 측정 결과를 비교한 결과, 체중변 화는 대조군이 정상군에 비하여 증가하였고, Sim 투여군, LT0 투여군, LT6 투여군과 LT9 투여군은 대조군에 비하여 감소하였 으며, 麥門冬 투여군은 정상군보다도 낮은 수준을 보였다. 식이 섭취량은 정상군에 비하여 모두 감소하는 경향을 보였으나, 식이 효율 (FER)은 대조군이 정상군보다 증가하였고, 양성대조군인 Sim 투여군은 정상군과 동일하였으며, LT0, LT6와 LT9 투여군은 정상군보다 낮았다 (Table 2).

Group Initial body weight (g) Body weight gain (g) Food intake (g/day) Food efficiency ratio (%)

Nor 308.1 ± 5.4 4.1 ± 0.1 26.98 ± 0.1 15.20 ± 0.4

Veh 308.2 ± 5.2 5.1 ± 0.2 20.45 ± 0.5 18.91 ± 1.1

Sim 307.8 ± 3.7 4.1 ± 0.2 20.82 ± 0.4 15.20 ± 1.0

LT0 307.4 ± 2.6 4.0 ± 0.2 20.34 ± 0.1 14.66 ± 1.1

LT6 307.3 ± 5.3 3.7 ± 0.3 20.22 ± 0.5 13.76 ± 1.6

LT9 307.1 ± 4.6 3.9 ± 0.2 21.07 ± 0.4 14.28 ± 0.8

Nor; normal diet fed rats, Veh; high cholesterol fed rats, Sim; high cholesterol diet plus simvastatin 5 ㎎/㎏ body weight, LT0; high cholesterol diet plus Liriopis Tuber extract 200 ㎎/㎏ body weight, LT6; high cholesterol diet plus Liriopis Tuber by steaming for six times extract 200 ㎎/㎏ body weight, LT9; high cholesterol diet plus Liriopis Tuber by steaming for nine times extract 200 ㎎/㎏ body weight.

All data are expressed mean±SEM, n=7 rats per group.

Table 2. Initial Body Weight, Body Weight Gain, Food Intake and Food Efficiency Ratio in High Cholesterol Fed Rats

(6)

3. 간 조직의 무게 분석

간 조직의 무게를 측정한 결과, 대조군 (0.0535 ± 0.1)의 간 무게가 정상군 (0.0291 ± 0.1, ***p＜ 0.001)에 비하여 유 의성 있게 증가하였으며, 증가된 간 무게는 모든 약물 처리군 에서 감소하였다. 특히 Sim 투여군 (0.0494 ± 0.1, ***p＜ 0.001)과 LT0 투여군 (0.0498 ± 0.1, ***p＜ 0.001), LT9 투여군 (0.0474 ± 0.1, ***p＜ 0.001)은 대조군에 비하여 유의성 있게 감소하였다 (Fig 2).

0.00 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06

Nor Veh Sim LT0 LT6 LT9

Liver weight / Body weight (g)

***

*** *** ***

Fig 2. Liver weights of high cholesterol fed rats

Nor; normal diet fed rats, Veh; high cholesterol fed rats, Sim; high cholesterol diet plus simvastatin 5 ㎎/㎏ body weight, LT0; high cholesterol diet plus Liriopis Tuber extract 200 ㎎/㎏ body weight, LT6; high cholesterol diet plus Liriopis Tuber by steaming for six times extract 200 ㎎/㎏ body weight, LT9; high cholesterol diet plus Liriopis Tuber by steaming for nine times extract 200 ㎎/㎏ body weight. All data are expressed mean±SEM, n=7 rats per group.

Significance: *p ＜ 0.05, **p ＜ 0.01, ***p ＜ 0.001 vs. high cholesterol fed rats.

4. 혈청 중 지질 농도의 분석

지질 농도의 분석을 위해 TC, TG, HDL, LDL을 측정 한 결과, TC는 대조군 (147.03 ± 6.2)이 정상군 (104.89 ± 1.1,

***p＜ 0.001)에 비하여 유의성 있게 증가하였다. Sim 투여 군 (118.10 ± 4.0, **p＜ 0.01)과 LT0 투여군 (106.82 ± 7.5, ***p＜ 0.001)은 대조군에 비하여 유의성 있게 감소하 였다. LT6 투여군 (85.24 ± 8.8, ***p＜ 0.001)과 LT9 투 여군 (83.15 ± 9.1, ***p＜ 0.001) 또한 대조군에 비하여 유의성 있게 감소하였으며, 정상군보다 낮은 수준을 보였다 (Fig 3, A). TG 함량 측정 결과, 대조군 (40.90 ± 1.0)은 정 상군 (31.58 ± 1.6, ***p＜ 0.001)에 비하여 유의성 있게 증가하였다. Sim 투여군 (31.73 ± 1.5, ***p＜ 0.001)은 대조군에 비하여 유의성 있게 감소하였으며 정상군과 비슷한 수준을 보였다. LT0 투여군 (24.85 ± 2.6, ***p＜ 0.001), LT6 투여군 (13.49 ± 1.6, ***p＜ 0.001)과 LT9 투여군 (11.68 ± 1.6, ***p＜ 0.001)은 대조군에 비하여 유의성 있게 감소하였고, 정상군보다 낮은 수준을 보였다 (Fig 3, B) HDL 콜레스테롤 함량 측정 결과, 대조군(37.82 ± 4.5)은 정상군 (63.72 ± 2.2, ***p＜ 0.001)에 비하여 유의성 있게

감소하였다. Sim 투여군 (49.69 ± 2.2, **p＜ 0.01), LT6 투여군 (46.64± 2.9, *p＜ 0.05)과 LT9 투여군 (49.98 ± 1.3, **p＜ 0.01)은 대조군에 비하여 유의성 있게 증가하였 다. LT0 투여군 (44.77 ± 2.7)은 대조군 보다 증가하였지만 유의성은 없었다 (Fig 3, C). LDL 콜레스테롤 측정 결과, 대 조군 (90.55 ± 7.39)은 정상군 (39.13 ± 3.17, ***p＜ 0.001)에 비하여 유의성 있게 증가 하였다. Sim 투여군 (75.19 ± 6.43, *p＜ 0.05), LT0 투여군 (69.09 ± 3.88,

*p＜ 0.05), LT6 투여군 (63.50 ± 9.75, **p＜ 0.01)과 LT9 투여군 (58.17 ± 9.21, ***p＜ 0.001) 모두 대조군에 비하여 유의성 있게 감소하였으며, LT9 투여군이 가장 유의 성 있는 감소를 보였다 (Fig 3, D).

5. 동맥경화지수 및 심혈관위험지수 분석

동맥경화지수(AI)와 심혈관위험지수(CRF)를 측정한 결과, AI 지수는 대조군 (149.10 ± 5.3)이 정상군 (103.89 ± 1.1,

***p＜ 0.001)에 비하여 유의성 있게 증가하였다. Sim 투여군 (117.10 ± 4.0, ***p＜ 0.001)과 LT0 투여군 (105.82 ± 9.1, ***p＜ 0.001)은 대조군에 비하여 유의성 있게 감소하 였다. LT6 투여군 (79.04 ± 7.1, ***p＜ 0.001)과 LT9 투 여군 (77.32 ± 5.8, ***p＜ 0.001)은 대조군에 비하여 유 의성 있게 감소하였고, 정상군보다 낮은 수준을 보였다. (Fig 4, A). CRF 측정 결과, 대조군 (3.07 ± 0.11)이 정상군 (1.66 ± 0.06, ***p＜ 0.001)에 비하여 유의성 있게 증가 하였다.

Sim 투여군 (2.39 ± 0.14)은 대조군에 비하여 감소하였지만 유의성은 없었다. LT0 투여군 (2.27 ± 0.11, ***p＜ 0.001) 은 대조군에 비하여 유의성 있게 감소하였다. LT6 투여군 (1.62

± 0.14, ***p＜ 0.001)과 LT9 투여군 (1.43 ± 0.07,

***p＜ 0.001)은 대조군에 비하여 유의성 있게 감소하였고, 정상군보다 낮은 수준을 보였다 (Fig 4, B).

6. 혈청 중 간 기능 관련 효소 측정

혈청 중 간 기능 관련 효소인 AST, ALT 측정 결과, AST는 대조군 (157.02 ± 7.8)이 정상군 (121.77 ± 7.8, **p＜ 0.01) 에 비하여 유의성 있게 증가하였다. Sim 투여군 (131.18 ± 5.4), LT0 투여군 (153.12 ± 12.6)과 LT6 투여군 (153.21 ± 11.2) 은 대조군에 비하여 감소하였지만 유의성은 없었다. LT9 투여군은 (92.67 ± 9.6, ***p＜ 0.001)은 대조군에 비하여 유의성 있게 감소하였으며, 정상군보다 낮은 수준을 보였다 (Fig 5, A). ALT 측정 결과, 대조군 (1.49 ± 0.21)은 정상군 (1.00 ± 0.06, **p＜ 0.01)에 비하여 유의성 있게 증가 하 였다. Sim 투여군 (1.20 ± 0.18), LT0 투여군 (1.63 ± 0.26), LT6 투여군 (1.43 ± 0.15)과 LT9 투여군 (1.17 ± 0.14) 모두 대조군에 비하여 감소하였으나, 유의성은 없었다 (Fig 5, B).

(7)

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180

Total cholesterol level (㎎/㎗)

*** ***

*** ** *** *** ***

***

*** ***

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45

Triglyceride level (㎎/㎗)

0 10 20 30 40 50 60 70

HDL-cholesterol (㎎/㎗)

***

** * **

0 20 40 60 80 100 120

LDL-cholesterol (㎎/㎗)

***

* * **

(A) (B)

(C) (D)

Fig 3. Serum analysis of high cholesterol feeding rats

Nor; normal diet fed rats, Veh; high cholesterol fed rats, Sim; high cholesterol diet plus simvastatin 5 ㎎/㎏ body weight, LT0; high cholesterol diet plus Liriopis Tuber extract 200 ㎎/㎏ body weight, LT6; high cholesterol diet plus Liriopis Tuber by steaming for six times extract 200 ㎎/㎏

body weight, LT9; high cholesterol diet plus Liriopis Tuber by steaming for nine times extract 200 ㎎/㎏ body weight. All data are expressed mean±SEM, n=7 rats per group. Significance: *p ＜ 0.05, **p ＜ 0.01, ***p ＜ 0.001 vs. high cholesterol fed rats.

*** *** ***

*** ***

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180

(Atherogenic index (AI ;score)

***

*** ***

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5

Cardiac risk factor (CRF;score)

(A) (B)

Fig 4. Evaluation of AI and CRF in high cholesterol fed rats

Nor; normal diet fed rats, Veh; high cholesterol fed rats, Sim; high cholesterol diet plus simvastatin 5 ㎎/㎏ body weight, LT0; high cholesterol diet plus Liriopis Tuber extract 200 ㎎/㎏ body weight, LT6; high cholesterol diet plus Liriopis Tuber by steaming for six times extract 200 ㎎/㎏ body weight, LT9; high cholesterol diet plus Liriopis Tuber by steaming for nine times extract 200 ㎎/㎏ body weight. All data are expressed mean±SEM, n=7 rats per group. Significance: *p ＜ 0.05, **p ＜ 0.01, ***p ＜ 0.001 vs. high cholesterol fed rats.

(8)

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180

AST level (㎎/㎗)

**

***

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0

ALT level (㎎/㎗)

**

(A) (B)

Fig 5. Evaluation of AST and ALT in high cholesterol fed rats

7. 혈청 중 신 기능 관련 효소 측정

혈청 중 신 기능 관련 효소인 Creatinine, BUN 측정 결과, Creatinine은 대조군 (2.07 ± 0.48)이 정상군 (0.82 ± 0.04,

**p＜ 0.01)에 비하여 유의성 있게 증가하였다. LT0 투여군 (1.50 ± 0.30)과 LT6 투여군 (1.31 ± 0.26)은 대조군에 비 하여 감소하였지만 유의성은 없었다. Sim 투여군 (1.19 ± 0.19,

*p＜ 0.05)과 LT9 투여군 (1.02 ± 0.19, *p＜ 0.05)은 대

조군에 비하여 유의성 있게 감소하였다 (Fig 6, A). BUN 측정 결과, 대조군(32.38 ± 1.2)이 정상군 (21.45 ± 1.6, ***p＜ 0.001)에 비하여 유의성 있게 증가하였다. Sim 투여군 (31.03

± 0.8), LT0 투여군 (31.41 ± 1.7)과 LT6 투여군 (31.21 ± 0.7)은 대조군에 비하여 감소하였지만 유의성은 없었다. LT9 투여군 (26.67 ± 1.9, **p＜ 0.01)은 대조군에 비하여 유의성 있게 감소하였다 (Fig 6, B).

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0

Creatinine level (㎎/㎗)

**

* *

0 5 10 15 20 25 30 35 40

BUN level (㎎/㎗)

***

**

(A) (B)

Fig 6. Evaluation of creatinine and BUN in high cholesterol fed rats

8. 혈청 내 산화적 스트레스 바이오마커 측정

산화적 스트레스의 마커인 ROS를 측정한 결과, 대조군 (5504.00 ± 662.3)은 정상군 (4840.00 ± 321.3)에 비하여 증가하였지만 유의성은 없었다. Sim 투여군 (4191.70 ± 169.8), LT0 투여군 (4758.10 ± 305.3)과 LT6 투여군 (5085.71 ± 383.1)은 대조군에 비하여 감소하였으나 유의 성은 없었다. LT9 투여군 (3845.71 ± 390.2, **p＜ 0.01)은 대조군에 비하여 유의성 있게 감소하였으며, 정상군 보다 낮은 수준을 보였다 (Fig 7).

9. 간 조직 내 항산화 단백질 발현 분석

간 조직에서 western bolt을 실시하여 항산화 관련 단백질인 SOD, catalase, GPx의 발현을 측정한 결과, SOD는 대조군 (0.54 ± 0.02)이 정상군 (1.00 ± 0.06, ***p＜ 0.001)에 비하여 유의성 있게 감소하였다. LT0 투여군 (0.69 ± 0.05)은 대조군에 비하여 증가하였지만 유의성은 없었다. Sim 투여군 0.81 ± 0.06, **p＜ 0.01), LT6 투여군 (0.80 ± 0.08,

**p＜ 0.01)과 LT9 투여군 (0.95 ± 0.12, ***p＜ 0.001)은 대조군에 비하여 유의성 있게 증가하였으며, 특히 LT9 투여

(9)

군은 정상군과 비슷한 수준으로 증가하였다 (Fig 8, A).

catalase 발현 결과, 대조군 (0.64 ± 0.06)은 정상군 (1.00

± 0.08, **p＜ 0.01)에 비하여 유의성 있게 감소하였다.

LT0 투여군 (0.85 ± 0.06)은 대조군보다 증가하였지만 유의 성은 없었다. Sim 투여군 (0.94 ± 0.09, **p＜ 0.01), LT6 투여군 (0.86 ± 0.05, *p＜ 0.05)과 LT9 투여군 (1.19 ± 0.07, ***p＜ 0.001)은 대조군에 비하여 유의성 있게 증가 하였으며, 특히 LT9 투여군은 정상군보다도 증가하였다 (Fig 8, B). GPx 발현 결과, 대조군 (0.73 ± 0.04)은 정상군 (1.00

± 0.08, **p＜ 0.01)에 비하여 유의성 있게 감소하였다.

Sim 투여군 (0.72 ± 0.04)과 LT0 투여군 (0.73 ± 0.08)은 유의성이 없었으며, LT6 투여군 (0.87 ± 0.10)은 대조군에 비하여 증가하였지만 유의성은 없었다. LT9 투여군 (1.15 ± 0.05, ***p＜ 0.001)은 대조군에 비하여 유의성 있게 증가 하였고, 정상군보다도 증가하였다 (Fig 8, C).

0 1,000 2,000 3,000 4,000 5,000 6,000 7,000

ROS (fluorescence/min/ml)

**

Fig 7. ROS level of serum in high cholesterol fed rats

Nor; normal diet fed rats, Veh; high cholesterol fed rats, Sim;

high cholesterol diet plus simvastatin 5 ㎎/㎏ body weight, LT0;

high cholesterol diet plus Liriopis Tuber extract 200 ㎎/㎏ body weight, LT6; high cholesterol diet plus Liriopis Tuber by steaming for six times extract 200 ㎎/㎏ body weight, LT9; high cholesterol diet plus Liriopis Tuber by steaming for nine times extract 200 ㎎/㎏

body weight. All data are expressed mean±SEM, n=7 rats per group. Significance: *p ＜ 0.05, **p ＜ 0.01, ***p ＜ 0.001 vs. high cholesterol fed rats.

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2

(fold of Nor)

b-actin SOD

*** ***

**

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4

(fold of Nor)

b-actin

***

** **

* Catalase

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4

(fold of Nor)

b-actin GPx

** ***

(A) (B) (C)

Fig 8. Antioxidant-related protein expression in liver tissue

Nor; normal diet fed rats, Veh; high cholesterol fed rats, Sim; high cholesterol diet plus simvastatin 5 ㎎/㎏ body weight, LT0; high cholesterol diet plus Liriopis Tuber extract 200 ㎎/㎏ body weight, LT6; high cholesterol diet plus Liriopis Tuber by steaming for six times extract 200 ㎎/㎏ body weight, LT9; high cholesterol diet plus Liriopis Tuber by steaming for nine times extract 200 ㎎/㎏ body weight.

All data are expressed mean±SEM, n=7 rats per group. Significance: *p ＜ 0.05, **p ＜ 0.01, ***p ＜ 0.001 vs. high cholesterol fed rats.

10. 콜레스테롤 관련 단백질 발현 분석

간 조직에서 콜레스테롤 관련 단백질인 p-AMPK, SREBP-2, p-ACC, HMGCR의 발현량을 측정하였다. p-AMPK 발현은 대조군 (0.73 ± 0.07)이 정상군 (1.00 ± 0.24)에 비하여 감소 하였지만 유의성은 없었다. Sim 투여군 (1.03 ± 0.07)은 대 조군에 비하여 정상군 수준으로 증가하였지만 유의성은 없었다.

LT0 투여군 (0.78 ± 0.04)과 LT6 투여군 (0.85 ± 0.05)은 대조군에 비하여 증가하였지만 유의성은 없었다. LT9 투여군 (1.12 ± 0.09, *p＜ 0.05)은 대조군에 비하여 유의성 있게 증가하였고, 정상군보다도 증가하였다 (Fig 9, A). 대조군의 SREBP-2 발현 (1.17 ± 0.31)은 정상군 (1.00 ± 0.14, *p＜ 0.05)에 비하여 유의성 있게 증가하였다. Sim 투여군 (1.35 ± 0.15, *p＜ 0.05)은 대조군에 비하여 유의성 있게 감소하였다.

LT0 투여군 (1.06 ± 0.13, *p＜ 0.05), LT6 투여군 (0.99 ± 0.21, *p＜ 0.05)과 LT9 투여군 (0.79 ± 0.06, *p＜ 0.05) 모두 대조군에 비하여 유의성 있게 감소하였으며, 특히 LT9

투여군은 정상군보다 낮은 수준을 보였다 (Fig 9, B). 대조군의 p-ACC 발현 (1.52 ± 0.18)은 정상군 (1.00 ± 0.07, *p＜ 0.05)에 비하여 유의성 있게 증가하였다. Sim 투여군 (0.96 ± 0.12, **p＜ 0.01)과 LT0 투여군 (1.07 ± 0.16, *p＜ 0.05) 은 대조군에 비하여 유의성 있게 감소하였으며, 정상군과 비 슷한 수준을 보였다. LT6 투여군 (0.81 ± 0.16, **p＜ 0.01) 과 LT9 투여군 (0.68 ± 0.12, ***p＜ 0.001)은 대조군에 비하여 유의성 있게 감소하였으며, 정상군보다도 낮은 수준을 보였다 (Fig 9, C). 대조군의 HMGCR 발현 (1.71 ± 0.24)은 정상군 (1.00 ± 0.20, *p＜ 0.05)에 비하여 유의성 있게 증 가하였다. Sim 투여군 (1.37 ± 0.10), LT0 투여군 (1.38 ± 0.30)과 LT6 투여군 (1.10 ± 0.21)은 대조군에 비하여 감소 하였지만 유의성은 없었다. LT9 투여군 (0.70 ± 0.17, **p＜ 0.01)은 대조군에 비하여 유의성 있게 감소하였으며, 정상군 보다 낮은 수준을 보였다.(Fig 9, D).

(10)

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4

(fold of Nor)

AMPK

* p-AMPK

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8

(fold of Nor)

p-ACC ACC

* *

** **

***

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5

(fold of Nor)

b-actin HMGCR

*

**

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5

(fold of Nor)

Histone SREBP-2

*

* *

**

(A) (B)

(C) (D)

Fig 9. Results of cholesterol-related protein expression in liver tissue.

11. 간 조직의 광학현미경적 분석

간조직에서 H&E 와 Oil red O 염색을 실시하여 관찰하였다.

H&E 염색 결과, 정상군 (A)은 정상세포로서 핵이 뚜렷이 보이 며, 세포의 크기가 일정하고, 간격이 좁고 일정하여 잘 짜여진 소엽구조를 이루고 있음을 관찰할 수 있다. 대조군 (B)에서는 정상군에 비하여 세포질의 크기가 커졌으며, 축적된 지방층으로 인해 세포질의 염색이 잘 나타나지 않았으며, 지방공포의 수가 많이 증가되있음을 확인할 수 있다. 이에 비하여 실험군은 세 포의 크기는 커져 있지만, 대조군에 비하여 염색이 잘 나타나며,

특히 LT9 투여군 (F)은 정상군에 가깝게 붉게 염색되었으며, 지방공포의 수가 정상군에 가깝게 줄어든 것을 확인할 수 있다 (Fig 10). oil red O 염색 결과, 정상군 (A)은 파란색으로 염 색된 핵이 뚜렷이 보이며 세포질 내의 지방침착이 거의 없으나, 고콜레스테롤혈증이 유발되어진 대조군 (B) 에서는 세포질에 광범위하게 축적된 지방층과 지방공포의 수가 뚜렷하게 늘어난 것을 확인할 수 있었다. 이에 비하여 실험군에서는 대조군에 비하여 세포 내 지방축적이 감소하고, 지방공포의 수가 감소 하였으며, 특히 LT9 투여군 (F)에서 가장 감소가 큰 것을 확 인할 수 있다 (Fig 11).

(A) (B) (C)

(D) (E) (F)

Fig 10. Liver H&E staining histology. (×100)

(A) Nor; normal diet fed rats, (B) Veh; high cholesterol fed rats, (C) Sim; high cholesterol diet plus simvastatin 5 ㎎/㎏ body weight, (D) LT0; high cholesterol diet plus Liriopis Tuber extract 200 ㎎/㎏ body weight, (E) LT6; high cholesterol diet plus Liriopis Tuber by steaming for six times extract 200 ㎎/㎏ body weight, (F) LT9; high cholesterol diet plus Liriopis Tuber by steaming for nine times extract 200 ㎎/㎏ body weight.

(11)

(A) (B) (C)

(D) (E) (F)

Fig 11. Liver oil red O staining histology. (×100)

(A) Nor; normal diet fed rats, (B) Veh; high cholesterol fed rats, (C) Sim; high cholesterol diet plus simvastatin 5 ㎎/㎏ body weight, (D) LT0; high cholesterol diet plus Liriopis Tuber extract 200 ㎎/㎏ body weight, (E) LT6; high cholesterol diet plus Liriopis Tuber by steaming for six times extract 200 ㎎/㎏ body weight, (F) LT9; high cholesterol diet plus Liriopis Tuber by steaming for nine times extract 200 ㎎/㎏ body weight.

Ⅳ. 고 찰

현대에 이르러 식생활의 서구화로 관상동맥질환이 꾸준히 증가하고 있는데, 그 원인으로 이상지질혈증이 주목받고 있다²³⁾. 이상지질혈증은 체내 지질대사의 이상으로 혈액 중 지질 농도 가 비정상적으로 높아진 상태이며, 산화된 LDL-cholesterol 은 백혈구의 화학주성을 증가시키고, 세포벽세포에서 chemoattractant cytokines의 생성을 일으켜 혈관벽에 동맥 경화가 쉽게 일어나도록 한다²⁴⁾. 따라서 LDL-cholesterol의 수치를 낮추는 것이 이상지질혈증 치료의 일차적인 목표로서 서양의학에서는 LDL-cholesterol 강하제를 우선적으로 사용 하며 HMG CoA reductase inhibitors 인 atorvastatin, cerivastatin, fluvastatin, lovastatin, simvastatin 등 일 반적으로 statin 계열의 약품을 주로 사용하고 있다²⁵⁾. 그러나 statin 제제는 다양한 부작용이 보고되고 있다. 가장 흔한 부 작용은 근육통으로 약 10%에서 근육통, 위약감 등을 호소하며, 소화장애, 속쓰림, 복통 등이 4% 정도에서 나타나며, 간효소 (AST, ALT) 수치의 상승이 1~2%에서 발생할 수 있고, 인지 장애 또한 보고되고 있다²⁶⁾. 이러한 statin의 부작용으로 인해 한약 및 천연물로부터의 고지혈증 치료약물 개발을 위한 연구가 많이 이루어지고 있다. 이에 본 저자는 콜레스테롤을 감소시 키는 데 있어서 蒸熟 횟수를 달리하여 제조한 麥門冬 시료를 이용하여 in vitro에서 항산화능을 비교하고, 고지방식이로 고 콜레스테롤혈증을 유도한 흰 쥐에 양성대조군으로 simvastatin 과 비교 투여하여 in vivo에서도 유의한 결과를 얻었으며 다 음과 같다.

In vitro에서 항산화능을 비교하기 위하여 DPPH radical 소거능, ABTS radical 소거능, 총 polyphenol 함량과 총 flavonoid 함량을 측정한 결과, 麥門冬의 蒸熟 횟수가 증가함에 DPPH radical과 ABTS radical의 소거능이 증가되었으며, 총 polyphenol 함량과 총 flavonoid 함량도 증가하는 것으로 나타났다 (Fig. 1). 기존의 연구에서 볶음 麥門冬 시료가 건조

麥門冬 시료에 비하여 DPPH radical과 ABTS radical의 소거 능이 높으며, 항산화성이 높게 측정되는 것으로 보고하였다²⁷⁾. 또한 9蒸麥門冬이 生乾麥門冬에 비해 많은 양의 polyphenol 을 함유한다고 한 보고¹⁸⁾와 일치하는 결과로, 蒸熟 횟수가 증가 함에 따라 麥門冬의 항산화 효능이 증대되는 것으로 생각된다.

적응기간과 고지혈증의 유발기간을 제외하고 6 주 동안 측 정된 체중변화, 식이섭취량 및 식이효율의 측정 결과를 비교한 결과, 체중변화는 대조군이 정상군에 비하여 증가하였으며, 실험군은 모두 감소하였으나 각 군 간의 경향성은 없었다. 식이 섭취량은 대조군과 실험군 모두 정상군에 비해 감소하였으나, 각 군 간의 차이는 유의성이 없었다. 식이효율은 대조군이 정 상군에 비해 증가하였고, 실험군은 모두 정상군보다 감소하였 으나, 각 군 간의 경향성은 없었다 (Table 3).

실험 종료 후 간 조직의 무게를 측정한 결과, 고콜레스테롤 식이로 인하여 증가된 간 조직의 무게가 모든 약물 처리군에서 감소하였으나 蒸熟 횟수에 따른 경향성은 보이지 않았다 (Fig 2).

이는 麥門冬 메탄올 추출물이 고콜레스테롤 유발 쥐의 혈중과 간의 지질 수준을 낮춘다고 보고¹⁵⁾한 것과, 9蒸麥門冬이 지 방간 감소에 크게 효과가 있음을 보고¹⁸⁾한 것과 일치하는 결 과로, 蒸熟麥門冬이 지방간에 유의한 효과가 있는 것으로 생 각된다.

혈청 내 지질 농도 분석을 위해 TC, TG, HDL-c를 측정하 였으며, 이를 바탕으로 LDL-c, 동맥경화지수 (AI) 및 심혈관 위험지수 (CRF)를 분석한 결과, TC의 함량은 麥門冬의 蒸熟 횟수가 늘어남에 따라 감소하는 경향을 보였으며, 麥門冬 투여 군이 sim 투여군에 비하여 더욱 유의성 있게 감소하였으며, LT6와 LT9 투여군은 정상군보다 낮은 수준을 보였다 (Fig 3, A).

TG의 함량은 麥門冬 투여군이 Sim 투여군 보다 유의성 있게 감소하였으며, 정상군보다 낮은 수준을 보였다. 또한 蒸熟 횟 수가 늘어남에 따라 감소하는 경향을 보였다 (Fig 3, B).

HDL-c의 함량은 麥門冬의 蒸熟 횟수에 따라 증가하는 경향을 보였으나, Sim 투여군과 LT6 투여군, LT9 투여군만 유의성

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있는 증가를 보였다 (Fig 3, C). LDL-c의 함량은 麥門冬의 투여군이 Sim 투여군보다 유의성 있게 감소하였으며, 蒸熟 횟수에 따라 감소하는 경향을 보였다. 특히 LT9 투여군은 가장 유의성 있는 감소를 보였다 (Fig 3, D).

AI는 麥門冬 투여군이 Sim 투여군보다 유의성 있게 감소 하였으며, 蒸熟 횟수에 따라 감소하는 경향을 보였다. 특히 LT6와 LT9 투여군은 정상군보다 낮은 수준을 보였다 (Fig 4, A).

CRF는 Sim 투여군은 유의성이 없었으나, 麥門冬 투여군은 유의성 있게 감소하였으며, 麥門冬의 蒸熟 횟수에 따라 감소 하는 경향을 보였다. 특히 LT6와 LT9 투여군은 정상군보다 낮 은 수준을 보였다 (Fig 4, B). 고지혈증 치료에 있어 LDL-c을 낮추는 것 외에도 HDL-c을 증가시키고, triglyceride를 낮추는 것도 중요한데, 특히 HDL-c은 콜레스테롤 역수송 과정으로 독립적인 지질 제거 과정을 제공하며, 그 외에도 항산화 작용, 항염증 작용, 항응고 작용 및 혈관내피세포 보호 기능 등으로 관상동맥 질환의 발생 위험을 낮추는 것으로 알려져 있다.

HDL-c이 1 ㎎/㎗ 증가 할 때마다 관상동맥 질환을 3% 감소 시킬 수 있다고 한다²⁴⁾. 따라서 본 연구 결과는 LT9이 LDL-c 함량을 simvastatin에 비하여 유의성 있게 감소시킬 뿐 아니라, HDL-c을 유의성 있게 증가시키고, TG를 유의성 있게 감소시킴으로서 AI와 CRF 감소에 높은 유의성을 보여, 동맥경화 예방 및 고지혈증 치료에 있어 복합적인 효과를 노릴 수 있는 좋은 대체 약물이 될 수 있을 것으로 생각된다.

간과 신장에 미치는 영향을 평가하기 위하여, 혈청 중 간기 능 손상 지표인 AST와 ALT를 신기능 손상 지표인 BUN과 creatinine을 측정한 결과, AST는 LT9 투여군 만이 대조군에 비하여 유의성 있게 감소하였으며, 정상군보다도 낮은 수준을 보였다. Sim 투여군과 L1, L6 투여군은 대조군에 비하여 감 소하기는 하였으나 유의성은 없었다 (Fig 5, A). ALT는 대조 군에 비하여 麥門冬의 蒸熟 횟수에 따라 감소하는 경향을 보 였으나, Sim 투여군과 麥門冬 투여군 모두 유의성은 없었다 (Fig 5, B).

Creatinine은 대조군에 비하여 麥門冬의 蒸熟 횟수에 따라 감소하는 경향을 보였으나, Sim 투여군과 LT9 투여군만이 유의성 있게 감소하였다 (Fig 6, A). BUN은 모든 실험군에서 대조군에 비하여 감소하였으나, LT9 투여군만이 유의성 있는 감소를 보였다 (Fig 6, B). 이는 기존의 연구에서 7蒸麥門冬을 흰쥐에 10일간 농도를 다르게 투여하여 50 ㎎/㎏ body weight/day로 투여하였을 때 BUN이 유의하게 증가한 외에는 간독성과 신독성이 없음을 보고²⁸⁾한 내용과 유사한 결과로서, LT9이 간 기능과 신장 기능을 개선시킬 수 있는 것으로 생각 된다.

혈청 중 산화적 스트레스 바이오마커인 ROS는 세포에 손 상을 입히는 모든 종류의 변형된 산소를 말하며, 과산화수소 (hydrogen peroxide, H₂O₂), 초과산화 이온 (superoxide ion, O2-)과 수산화 라디칼 (hydroxyl radical, ·OH)이 대표 적이다. ROS를 측정한 결과, 모든 실험군이 대조군에 비하여 감소하였으며, LT9 투여군 만이 유의성 있게 감소하였으며, 정상군보다 낮은 수준을 보였다 (Fig 7).

간 조직 내 항산화 관련 단백질인 SOD는 초과산화이온 (O2-)을 과산화수소와 산소로 바꿔 주는 반응을 촉매하는 효소 이며, 산소에 노출되는 대부분의 세포에서 항산화방어기작을

하는 것으로 알려져 있다. SOD의 발현을 분석한 결과, 麥門冬의 蒸熟 횟수가 증가함에 따라 증가하는 경향을 보였으며, 특히 LT9 투여군은 가장 높은 유의성을 보였으며, 정상군과 비슷한 수준으로 증가하였다 (Fig 8, A).

Catalase는 과산화수소 (H2O2)를 산소와 물로 분해하는 반 응을 촉매하는 효소이며 간 속에 많이 존재하는데, 이는 우리가 간의 주요기능으로 해독작용을 이야기하는 이유이기도 하다.

Catalase의 발현을 분석한 결과 麥門冬의 蒸熟 횟수가 증가 함에 따라 증가하는 경향을 보였으나, LT0 투여군은 대조군에 비하여 유의성이 없었다. LT6 투여군은 대조군에 비하여 유 의성 있게 증가하였으나, Sim 투여군보다 낮은 증가를 보였다.

LT9 투여군은 대조군에 비하여 유의성 있게 증가하였으며, 정상군보다도 증가하였다 (Fig 8, B).

GPx는 산소에 의한 피해로부터 세포를 보호하는 과산화효소 능력을 갖는 효소군을 총칭한다. GPx의 발현을 분석한 결과, 麥門冬의 蒸熟 횟수가 증가함에 따라 증가하는 경향을 보였으나, LT9 투여군 만이 대조군에 비하여 유의성 있는 증가를 보였 으며, 정상군보다도 증가하였다 (Fig 8, C). 이를 종합하면 LT9은 간 조직 내의 항산화 단백질의 발현을 simvastatin보다 유의성 있게 증가시키는 것으로 나타났다.

간 조직 내 콜레스테롤 관련 단백질인 p-AMPK (phospho- AMP-activated protein kinase)의 발현을 분석한 결과, 麥門冬의 蒸熟 횟수가 증가함에 따라 증가하는 경향을 보였으나, LT9 투여군 만이 대조군에 비하여 유의성 있는 증가를 보였 으며, 정상군보다도 증가하였다 (Fig 9, A). AMPK는 간과 골격근에서의 지방산의 산화와 glucose uptake를 촉진하고, 콜레스테롤 합성과 adipocyte의 지방 분해로 인한 triglyceride 형성을 억제하고, 췌장의 β-cell에서 insulin 분비를 조절한 다²⁹⁾. AMPK의 인산화는 영양 결핍 또는 insulin 자극에 의해 활성화되는 mTORC1의 활성이 저하되는 것에 의해 이루어지 는데³⁰⁾, 麥門冬이 Akt 경로를 통해 insulin 분비를 촉진하여 혈당을 조절한다는 연구보고³¹⁾와 종합하여보면 蒸熟麥門冬에 의해 혈당이 감소하고, 또한 AMPK 경로를 통해 SREBP-1을 조절하여 지방산 합성을 조절함으로서 혈중 지질 농도가 감소 하여 p-AMPK의 발현이 증가된 것으로 생각된다.

SREBP-2는 스테로이드 조절 유전자의 전사를 자극하여 콜레스테롤 항상성을 조절하는 전사 인자를 암호화한다³²⁾. SREBP-2의 발현을 분석한 결과, 麥門冬의 蒸熟 횟수가 증 가함에 따라 유의성 있게 감소하는 경향을 보였으며, Sim 투 여군에 비하여 麥門冬 투여군이 더 낮은 수준을 보였다. 특히 LT9 투여군은 정상군보다 낮은 수준을 보였다 (Fig 9, B). 이는 蒸熟麥門冬이 콜레스테롤 합성을 억제함으로서, SREBP-2의 발현이 감소된 것으로 생각된다.

ACC는 체내 flavonoid 합성에 관여하는 첫 단계의 효소로, p-ACC (phospho-acetyl-CoA carboxylase)는 지방산합 성의 중간체인 마로닐CoA의 합성에 관여하며, C6-3-CoA에 세 개의 마로닐-CoA가 결합을 하면 flavonoid가 합성된다³³⁾. p-ACC의 발현을 분석한 결과, 麥門冬의 蒸熟 횟수가 증가함에 따라 유의성 있게 감소하는 경향을 보였으며, LT6 투여군과 LT9 투여군은 정상군보다도 낮은 수준을 보였다 (Fig 9, C).

이는 蒸熟麥門冬에 풍부하게 함유되어 있는 flavonoid로 인해 체내 flavonoid 합성이 저해되어 p-ACC의 발현이 감소된